鈣結(jié)合蛋白S100A4調(diào)節(jié)小鼠骨髓源肥大細(xì)胞活化的作用*

吳通前，金筱茜，馬嵐，周萍萍，李靜，袁銳，余芳***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 臨床微生物及免疫學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，貴州 貴陽(yáng) 550004； 4.湖北醫(yī)科大學(xué)附屬東風(fēng)醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，湖北 十堰 442008； 5.長(zhǎng)沙市第八醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410100)

長(zhǎng)期以來(lái)，肥大細(xì)胞因具有分泌多種過(guò)敏性介質(zhì)的能力一直被認(rèn)為是過(guò)敏性疾病的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其激活和募集是過(guò)敏性疾病發(fā)作和發(fā)展的重要效應(yīng)器[1-4]。肥大細(xì)胞的異常積累和激活可促進(jìn)炎性進(jìn)展[5]，主要是通過(guò)多種途徑激活其表面受體并釋放多種化學(xué)介質(zhì)及炎性因子[5-6]，從而誘導(dǎo)和維持免疫炎癥反應(yīng)[7-8]。S100A4蛋白屬于鈣結(jié)合蛋白S100家族成員，多表達(dá)于腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞，存在于細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)，同時(shí)也可分泌至胞外發(fā)揮功能[9-11]；并可在蛋白磷酸化、細(xì)胞生長(zhǎng)存活、細(xì)胞遷移分化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解及重塑等方面起到重要的調(diào)控作用，如在慢性炎癥疾病中涉及免疫調(diào)節(jié)與信號(hào)通路調(diào)節(jié)功能[12-15]。已有研究顯示，S100A4蛋白亦參與調(diào)節(jié)過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性鼻炎及過(guò)敏性哮喘的發(fā)生與發(fā)展[16-17]，但其對(duì)肥大細(xì)胞的作用尚不明確。因此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)野生型(wild type,WT)及S100A4基因敲除(S100A4-/-)小鼠骨髓源肥大細(xì)胞(bone marrow-derived mast cells,BMMC)，探究S100A4與肥大細(xì)胞活化的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 8～10周齡WT和S100A4基因敲除(S100A4-/-)C57BL/6健康雄性小鼠各2只，來(lái)自中國(guó)科學(xué)院生物物理所秦志海教授團(tuán)隊(duì)，均在無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲得本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)1503057)。

1.1.2主要試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，甲苯胺藍(lán)、β-氨基己糖苷酶(β-hexosainidase,β-hex)檢測(cè)底物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸鈉溶液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、2-巰基乙醇及離子霉素(ionomycin，ION)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，蛋白運(yùn)輸抑制劑布雷非德菌素A、流式檢測(cè)抗體白細(xì)胞介素-5(interleukin-5，IL-5)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-13(interleukin-13，IL-13)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞分化簇117(cluster of differentiation 117，CD117)及Fcε受體I(Fc epsilon receptor I，F(xiàn)cεRI)購(gòu)自美國(guó)BD公司；SYNERGY多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Therom fisher scientific公司，NAVIOS流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1BMMC培養(yǎng) 取WT和S100A4-/-C57BL/6健康雄性小鼠各2只，無(wú)菌條件下分別取2種小鼠脛骨與股骨提取骨髓，反復(fù)吹打至骨髓成細(xì)胞懸液，300目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾1次，PBS洗2次；用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%雙抗、4 mmol/L L-谷氨酰胺、50 μmol/L 2-巰基乙醇、1 mmol/L丙酮酸鈉溶液、0.1 mmol/L非必需氨基酸、10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液及2 500 μg/L IL-3)重懸細(xì)胞，置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)WT BMMC以及S100A4-/-BMMC[18]。

1.2.2BMMC鑒定及S100A4表達(dá)檢測(cè) 取培養(yǎng)第1、2及3周的BMMC，采用甲苯胺藍(lán)染色鑒定肥大細(xì)胞，分別使用抗小鼠CD117 PE、抗小鼠FcεRI Pacific blue和抗小鼠S100A4 FITC染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMMC純度及檢測(cè)BMMC的S100A4表達(dá)，其中CD117 PE與FcεRI Pacific blue雙陽(yáng)性細(xì)胞(散點(diǎn)圖第四象限)代表成熟BMMC[19]。

1.2.3S100A4蛋白誘導(dǎo)WT BMMC活化檢測(cè) 取1.5×109個(gè)/L成熟WT BMMC鋪于96孔板，分為S100A4蛋白處理組(S100A4蛋白1 500 μg/L)和PBS對(duì)照組(S100A4白蛋等量體積PBS)，各組3個(gè)重復(fù)，37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，4 ℃離心機(jī)1 000 r/min離心5 min，分別取各孔培養(yǎng)上清50 μL加至新的96孔板，再分別加入β-hex底物50 μL混勻，37 ℃恒溫?fù)u床孵育1.5 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)410 nm處吸光度(optical density,OD)；按上述分組及處理，向各組同時(shí)加入蛋白運(yùn)輸抑制劑布雷非德菌素A 1 μL，37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，離心機(jī)1 000 r/min 4 ℃離心5 min，去上清，加抗小鼠IL-5 APC、抗小鼠IL6-V450、抗小鼠IL-13 PE及抗小鼠TNF-α FTIC進(jìn)行染色，流式細(xì)胞術(shù)上機(jī)檢測(cè)PBS對(duì)照組及S100A4蛋白處理組中成熟BMMC的IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α熒光強(qiáng)度并計(jì)算相對(duì)熒光指數(shù)(relative fluorescence index,rFI)[20]。

1.2.4離子霉素(ION)誘導(dǎo)WT和S100A4-/-BMMC活化檢測(cè) 取1.5×109個(gè)/L小鼠成熟WT BMMC鋪于96孔板，分為WT PBS對(duì)照組與WT ION處理組；同時(shí)取1.5×109個(gè)/L小鼠成熟S100A4-/-BMMC鋪于96孔板，分為S100A4-/-PBS對(duì)照組與S100A4-/-ION處理組。各組3個(gè)重復(fù)，INO 1 500 μg/L分別加至WT ION處理組與S100A4-/-ION處理組，以ION等量體積PBS加入至WT PBS對(duì)照組及S100A4-/-PBS對(duì)照組，經(jīng)ION處理30 min后，各組培養(yǎng)上清用于檢測(cè)β-hexOD；經(jīng)ION處理3 h，流式細(xì)胞術(shù)上機(jī)檢測(cè)前述各組小鼠成熟BMMC中IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α熒光強(qiáng)度并計(jì)算rFI。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMMC培養(yǎng)鑒定及S100A4表達(dá)檢測(cè)

流式鑒定結(jié)果顯示，第1周時(shí)小鼠BMMC純度為10%左右，第2周為40%左右，第3周基本成熟，純度達(dá)到80%以上(圖1A)；甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，圖中藍(lán)紫色細(xì)胞為小鼠成熟BMMC，第1周較少，第2周明顯增多，第3周BMMC基本成熟(圖1B)；S100A4的檢測(cè)結(jié)果顯示，WT BMMC表達(dá)S100A4，S100A4-/-BMMC不表達(dá)S100A4(圖1C)。

注：A為成熟WT、S100A4-/-BMMC培養(yǎng)的鑒定結(jié)果；B為BMMC甲苯胺藍(lán)染色(400×)；C為S100A4在BMMC上的表達(dá)。圖1 小鼠成熟BMMC培養(yǎng)鑒定及S100A4表達(dá)Fig.1 Identification and S100A4 expression of mature BMMC

2.2 S100A4蛋白誘導(dǎo)小鼠成熟WT BMMC活化檢測(cè)

S100A4蛋白處理組小鼠成熟BMMC培養(yǎng)上清β-hex含量高于PBS對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A)；S100A4蛋白處理組小鼠成熟BMMC胞內(nèi)相關(guān)炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α表達(dá)水平也均高于PBS對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。

注：A為β-hex檢測(cè)OD值；B為炎性因子rFI水平；(1)與PBS對(duì)照組比較，P<0.05。圖2 S100A4蛋白誘導(dǎo)小鼠成熟WT BMMC活化檢測(cè)Fig.2 Detection of mature WT BMMC activation induced by S100A4 protein

2.3 ION誘導(dǎo)小鼠成熟WT和S100A4-/-BMMC活化檢測(cè)

WT ION處理組小鼠β-hex水平分別高于WT PBS對(duì)照組和S100A4-/-ION處理組(P<0.05或P<0.01)，S100A4-/-ION處理組則高于S100A4-/-PBS對(duì)照組(P<0.05，圖3A)；WT ION處理組小鼠細(xì)胞內(nèi)炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α表達(dá)水平分別高于WT PBS對(duì)照組和S100A4-/-ION處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，S100A4-/-ION處理組小鼠IL-5和IL-6高于S100A4-/-PBS對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3B)。

注：A為β-hex檢測(cè)的OD值；B為炎性因子rFI直條圖；(1)與WT PBS對(duì)組比較，P<0.01；(2)與S100A4-/-PBS組比較，P<0.05；(3)與WT ION組比較，P<0.05。圖3 ION誘導(dǎo)小鼠成熟WT和S100A4-/-BMMC活化檢測(cè)Fig.3 Detection of mature WT and S100A4-/-BMMC activation induced by ION

3 討論

S1000A4具有調(diào)節(jié)血管生成、細(xì)胞生存、運(yùn)動(dòng)及侵襲等生物學(xué)功能，也參與慢性炎癥疾病的免疫調(diào)節(jié)以及信號(hào)通路調(diào)節(jié)[21]。有研究顯示，在過(guò)敏性鼻炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)培養(yǎng)上清中，通過(guò)S100A4抗體處理后IL-5和IL-13降低，證實(shí)了其與過(guò)敏性疾病的相關(guān)性[18]，但作用機(jī)制尚不明確，對(duì)于過(guò)敏性疾病的重要效應(yīng)細(xì)胞肥大細(xì)胞的作用研究尚有待開發(fā)。因此探討S100A4與肥大細(xì)胞作用的相關(guān)性在過(guò)敏性疾病的發(fā)生與發(fā)展領(lǐng)域具有潛在的意義。本研究通過(guò)WT、S100A4-/-小鼠培養(yǎng)成熟BMMC，BMMC第3周時(shí)已基本成熟，純度達(dá)到80%以上，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)成熟BMMC中存在S100A4蛋白的表達(dá)。肥大細(xì)胞活化是過(guò)敏性疾病產(chǎn)生臨床癥狀的重要過(guò)程，其活化產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)及炎性因子[22]。通過(guò)S100A4蛋白直接作用于成熟WT BMMC后，S100A4蛋白處理組β-hex水平高于PBS對(duì)照組(P<0.05)，同時(shí)，S100A4蛋白處理組中胞內(nèi)炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α產(chǎn)生也高于PBS對(duì)照組(P<0.05)，提示外源性S100A4蛋白可直接誘導(dǎo)BMMC激活。但其作用機(jī)制尚不明確。有研究表明，S100A4在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)單核細(xì)胞中能夠通過(guò)Toll樣受體4(toll-like receptors，TLR4)介導(dǎo)炎性應(yīng)答，促進(jìn)炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的釋放，相關(guān)腫瘤研究也發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白通過(guò)TLR-4信號(hào)通路傳遞功能調(diào)節(jié)信號(hào)[23-24]。因此，有理由推測(cè)在肥大細(xì)胞的活化中，S100A4可能通過(guò)TLR-4這一受體傳遞激活信號(hào)，但還需進(jìn)一步研究來(lái)明確。

近期研究表明，通過(guò)S100A4抗體封閉過(guò)敏性哮喘模型小鼠體內(nèi)S100A4蛋白的功能發(fā)揮后，相對(duì)于S100A4未封閉組，小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-5、IL-13等炎性因子水平以及氣道炎癥明顯受到抑制，提示通過(guò)抑制S100A4蛋白表達(dá)可能抑制過(guò)敏性疾病的發(fā)生與發(fā)展，其機(jī)制可能是抑制了肥大細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞的活化，進(jìn)而抑制炎性的產(chǎn)生[17]，但沒(méi)有充分的證據(jù)證實(shí)這一觀點(diǎn)?；c此觀點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)使用ION處理成熟WT及S100A4-/-BMMC誘導(dǎo)其活化，結(jié)果顯示β-hex水平明顯低于WT-ION處理組(P<0.05)，S100A4-/-ION處理組胞內(nèi)相關(guān)炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α水平也低于WT-ION處理組(P<0.05)，這一結(jié)果提示S100A4基因的缺失抑制BMMC的活化。這或許是一個(gè)證實(shí)S100A4在體內(nèi)參與過(guò)敏性疾病調(diào)節(jié)的潛在研究方向，但還需進(jìn)一步在體內(nèi)進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，本研究通過(guò)體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明S100A4蛋白能夠直接誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化及炎性炎性因子的產(chǎn)生，S100A4基因的缺失抑制肥大細(xì)胞活化及其炎性因子的產(chǎn)生，為后續(xù)其參與過(guò)敏性疾病中的作用機(jī)制研究提供了前期研究基礎(chǔ)。