三七總皂苷在促進骨折愈合的信號通路基礎(chǔ)實驗研究概況

李晉玉 康晟乾 孫旗 鄭晨穎 白春曉 劉楚吟 劉文靜 趙學(xué)千 賈育松

三七[Panaxnotogiseng(Burk.)F.H.Chen]為五加科人參屬植物三七的干燥根和根莖，是中國傳統(tǒng)的中草藥，具有散瘀止血，消腫定痛的功效，因此三七在傳統(tǒng)治療上用于跌打損傷所致的各種出血性疾病[1]。近年來，對于三七的主要成分三七總皂苷(total saponins of panax notoginseseng，PNS)在骨傷科領(lǐng)域的研究日益增多。研究表明，PNS在促進骨折愈合方面有雙向調(diào)節(jié)的作用機制，一方面參與調(diào)控骨形成，通過促進相關(guān)信號蛋白的合成與釋放起到促骨形成的作用；另一方面通過抑制骨吸收的相關(guān)信號通路抑制骨吸收，進而減少骨量流失，加快骨折愈合；同時還可以有效調(diào)節(jié)骨折愈合微環(huán)境，進而促進快速骨折愈合。不僅能發(fā)揮促骨形成作用，又能抑制骨吸收，在成骨與骨吸收之間保持平衡，被廣泛應(yīng)用于骨折、骨缺損及骨關(guān)節(jié)病等多種骨科疾病的治療中[2-3]。現(xiàn)將PNS在促進骨折愈合方面的基礎(chǔ)實驗研究情況總結(jié)如下。

1 三七總皂苷促進骨形成的相關(guān)信號通路

1.1 三七總皂苷對轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad信號通路表達的作用

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)在骨細胞的早期增殖、分化、成熟及凋亡過程中有著重要的作用[4]。TGF-β超家族系包括轉(zhuǎn)化生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、激活素和抑制素等眾多細胞因子，而TGF-β和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bne morphogenetic prtein,MBP)都屬于TGF-β超家族。BMP主要是調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和激活Smads蛋白信號傳導(dǎo)發(fā)揮成骨相關(guān)作用，BMP-Smads信號通路在成骨細胞(osteoblast，OB)分化和成熟全過程中發(fā)揮極其關(guān)鍵的作用。其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是一類多功能的生長相關(guān)因子[5],它能促進未分化的間充細胞向成骨細胞分化，進而促進軟骨、骨、韌帶、肌腱和神經(jīng)等組織的形成，它可以調(diào)控靶細胞的分化和生長[6]，并在促進骨折愈合中發(fā)揮重要作用。Liu[7]在探究三七總皂苷對大鼠骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2表達和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的影響時，采用不同濃度的PNS成骨培養(yǎng)基來誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖。使用MTT法檢測及Western blotting檢測骨髓間充質(zhì)干細胞BMP-2的表達。結(jié)果表明，PNS可增強BMP-2表達，并提高ALP活性，達到促進BMSCs向成骨細胞分化。證實了PNS可以通過BMP-Smads信號通路來促進成骨分化作用，進而促進骨折愈合。

TGF-β具有多種亞型[8]，其中TGF-β1是促進骨組織形成和調(diào)節(jié)骨吸收的重要因子，在骨形成或重塑過程中誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化或調(diào)節(jié)相關(guān)細胞的分化，促進細胞外基質(zhì)的合成與分泌，從而介導(dǎo)間充質(zhì)細胞、成骨細胞和破骨細胞的活動，趨化OB的活性，促進骨組織修復(fù)[9-11]。有研究使用外源性TGF-β1促進骨折愈合和治療骨缺損[12]。另有研究表明，骨代謝活動受到血清中ALP含量變化的影響，當骨折愈合、骨肉瘤等骨代謝旺盛時，相應(yīng)的ALP的水平升高，活性也相應(yīng)提升，進一步促進成骨細胞的活性[13]。另一項研究證實TGF-β1可以促使細胞中的ALP活性升高，促使細胞分化[14]。楊璐等[15]在通過對比研究PNS與NS對兔牙齒移動過程中牙周組織TGF-β1表達的影響時發(fā)現(xiàn)，PNS通過TGF-β1信號通路增強ALP的活性，增強OB的活性，促進成骨，在牙周組織的重建中起到調(diào)節(jié)作用。證明，PNS能通過促進TGF-β1信號通路表達來促進骨組織形成，達到促進骨折愈合的作用。Wang Y[16]在研究PNS作用于沉默TGF-β1基因的兔骨髓間充質(zhì)干細胞時，發(fā)現(xiàn)PNS可以有效的通過TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的機制發(fā)揮成骨潛能，在實驗組中顯著提高了ALP的生物活性，完成成骨細胞礦化，證明了PNS可通過上調(diào)TGF-β1的基因表達來促進兔骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。通過以上研究結(jié)果，可以得出三七總皂苷在促進骨折愈合方面的機制與激活TGF-β/Smad信號通路有關(guān)，而且通過TGF-β信號傳導(dǎo)途徑有效的提高ALP及OB的活性，促進骨折愈合。

1.2 三七總皂苷對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控

Wnt/β-catenin信號通路在維持骨量，調(diào)控骨重塑、骨分化方面均起到關(guān)鍵作用[17]，尤其在骨折早期該信號通路可顯著促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[18-19]，進行骨折修復(fù)。Chen[20]通過研究表明PNS可以調(diào)節(jié)β-catenin與Cyclin D1蛋白的表達，進而激活Wnt/β-catenin信號通路，通過此信號通路，可以上調(diào)mRNA的骨保護素的表達，并抑制RANKL和PPARγ2表達，同時使用Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)的經(jīng)典抑制劑DKK-1時可以逆轉(zhuǎn)此效果，證實了PNS可通過Wnt/β-catenin信號通路達到調(diào)控骨重塑、骨分化的作用，可以促進骨折愈合。通過以上研究，可以得出三七總皂苷通過激活Wnt/β-catenin信號通路從而激活成骨細胞的增殖、分化，得以實現(xiàn)促進骨折愈合的作用。

1.3 三七總皂苷對MAPK信號通路的調(diào)控

MAPK信號通路是成骨細胞分化和礦化的重要細胞信號通路。MAPK信號通路包含：ERK通路、p38通路、JNK通路[21]。其中第一條信號通路對成骨細胞增殖及ALP活性產(chǎn)生影響，可以促進ERα、p-ERK和Osterix蛋白的表達[22]。第二條信號通路可促進成骨細胞礦化和ALP、BMP-2表達[23]。第三條信號通路中JNK相關(guān)蛋白失活，相應(yīng)降低骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)和骨橋蛋白( osteopontin，OPN)的表達[24]。

陳斌等[25]在研究骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響因素時發(fā)現(xiàn)，PNS可以呈濃度依賴性促進BMSCs的增殖、ALP活性、鈣結(jié)節(jié)形成,研究中PNS濃度為100 mg/L時其作用最顯著，對其機制探究時，闡明PNS促進BMSCs向OB定向分化是通過MAPK信號通路中ERK1/2及P38信號通路起作用。同時在另一項研究中，研究者通過茜素紅檢測發(fā)現(xiàn)PNS可顯著增加BMSC的礦化作用，并增加其堿性磷酸酶表達，同時提高核心結(jié)合因子a1和骨唾液蛋白的mRNA水平，降低PPARγ2mRNA的水平[26]。在使用ERK的抑制劑PD98059和p38的抑制劑SB203580后，可以明顯抑制PNS的成骨作用，表明PNS可以通過激活ERK和p38信號通路來促進BMSC成骨。由以上研究可以發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷通過激活P38 MAPK信號通路及ERK通路，促進成骨細胞增殖、分化，從而使成骨細胞的總數(shù)增加，促進骨折愈合。由此也可以說明三七總皂苷促進成骨細胞增殖分化及抑制成骨細胞凋亡可能與 MAPK 信號通路相關(guān)，而PNS作用于JNK通路的研究還有待繼續(xù)探究。

1.4 三七總皂苷對PI3K/AKT信號通路表達的作用

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)是一類多能干細胞，具有多向分化潛能，可以分化為成骨細胞，所以，BMSCs成骨分化不僅是目前研究促進骨折愈合的熱點，對BMSCs細胞凋亡的保護也是未來研究的重點，而在成骨細胞增殖、分化及抗凋亡的過程中，PI3K/AKT信號通路有重要的作用。有研究[27]在探索PNS對過氧化氫誘導(dǎo)的BMSCs凋亡的影響時，證明PNS作為生物抗氧化劑，通過降低氧化應(yīng)激和下調(diào)caspase-3，對H2O2誘導(dǎo)的兔BMSCs細胞凋亡具有保護作用，從而促進成骨細胞增殖，加速骨折的愈合[28]。Qiang H等[29-30]在采用PNS預(yù)處理被氧化應(yīng)激損傷的BMSCs時，發(fā)現(xiàn)其可以顯著逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的Bcl-2表達抑制和Bax與Caspase-3表達的增加。表明PNS對骨髓間充質(zhì)干細胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡的保護作用是通過清除ROS和調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax通路實現(xiàn)的。通過以上研究結(jié)果，可以得出三七總皂苷促進骨折愈合與激活PI3K/AKT通路有關(guān)，而且三七總皂苷不是作用于該通路的一個蛋白位點，而是多靶向的治療，包括該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及的信號分子，如Bcl-2，Bax及Caspase-3等。

2 三七總皂苷抑制骨吸收的相關(guān)信號通路

2.1 三七總皂苷對OPG/RANKL/RANK信號通路表達的作用

骨保護素(osteoprotegerin，OPG)是一種RANKL誘餌受體，可抑制破骨細胞的增殖、分化，導(dǎo)致破骨細胞凋亡，所以，OPG的表達水平升高或OPG/RANKL比值增加都能降低破骨細胞的活性，抑制破骨細胞的分化成熟，進而抑制骨吸收作用[31-32]。李學(xué)東等[33]研究體外PNS對骨髓基質(zhì)細胞的影響作用時，發(fā)現(xiàn)PNS可抑制破骨細胞生成、分化及活性表達，抑制骨吸收，從而起到促進骨折愈合的作用。Wang T等[34]人發(fā)現(xiàn)，三七皂苷(NGR1)R1(notoginsenoside R1，NGR1)能夠降低RANKL表達和RANKL/OPG比率，表明其能夠抑制破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收作用，進而起到促進骨折愈合的作用。通過以上研究結(jié)果可以說明OPG/RANKL/RANK信號通路是三七總皂苷促進骨折愈合的重要途徑之一。

2.2 三七總皂苷對腫瘤壞死因子-α信號通路表達的作用

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)在骨吸收過程中會誘導(dǎo)破骨細胞產(chǎn)生[35]，并抑制ALP活性，并增加一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量，阻礙成骨細胞增殖，抑制成骨作用。吳麗萍等[36]在研究中發(fā)現(xiàn)，PNS對TNF-α mRNA表達有抑制作用，減少組織內(nèi)TNF-α和NO的產(chǎn)生，明顯抑制骨吸收。同時研究發(fā)現(xiàn)PNS作用于骨質(zhì)疏松的大鼠時，能有效的降低破骨細胞活性，促進成骨作用。由此推斷，三七總皂苷可能通過TNF-α信號通路來達到抑制破骨細胞的增殖分化，抑制骨吸收，從而發(fā)揮其骨保護的作用。

2.3 三七總皂苷對類雌激素信號通路表達的作用

雌激素可以通過雌激素受體ERα和ERβ的表達來刺激成骨細胞分化。植物雌激素是指從各種植物和種子中分離提取的天然的雌激素化合物，植物雌激素的生物活性基于它們的結(jié)構(gòu)與雌激素相似性，是通過它們與ERs的結(jié)合而被發(fā)現(xiàn)[37]。Wang T等[34]人在研究三七皂苷R1(notoginsenoside R1，NGR1)對成骨細胞分化和礦化過程的影響時，評估NGR1的雌激素特性，尤其是它對ERs的影響，使用pERE-Luc轉(zhuǎn)染的成骨細胞研究了NGR1的雌激素活性的潛在機制，結(jié)果表明NGR1通過ER激活起作用，NGR1對成骨細胞分化的影響與17β-雌二醇相似，表明NGR1的成骨方面具有類雌激素特性。表明三七總皂苷主要通過選擇性結(jié)合雌激素受體β產(chǎn)生類雌激素作用，通過雌激素受體激動機制促進骨折愈合。

3 三七總皂苷促進骨折愈合的其他相關(guān)信號通路及細胞

3.1 三七總皂苷對血管內(nèi)皮生長因子分子通路的作用

血管方面因素是影響骨折修復(fù)的重要因素之一[38-39]。其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)的活性在骨折修復(fù)中對于正常血管生成、骨痂形成和礦化發(fā)揮著重要作用[40]。彭時雨等[41]在前交叉韌帶重建術(shù)后使用PNS，觀察其對腱骨愈合的影響，PNS在腱骨的愈合過程中促進腱骨愈合面的血供供應(yīng)。并發(fā)現(xiàn)在研究的第4周、第6周采用PNS治療的實驗組中新生血管生成對比空白組明顯增多，探究其作用機理與促使新生血管生成及各種細胞作用因子表達相關(guān)，最終以促進VEGF表達為主。上述研究表明，三七總皂苷通過VEGF分子通路表達促進骨折斷端新生血管形成，發(fā)揮促進骨折愈合的作用。

3.2 三七總皂苷對相關(guān)細胞的影響

褚金龍等[42]通過研究發(fā)現(xiàn)，PNS可改善再生障礙性貧血的骨髓抑制，改善組織造血微循環(huán)，同時對造血祖細胞的增殖有積極的影響作用，保護造血干細胞，其促進造血作用在造血干細胞階段就已經(jīng)出現(xiàn),為促骨折愈合提供細胞學(xué)方面的支持。蔣劍鋒等[43]在進行研究時，得出在PNS的作用下，前列腺素I2顯著增加，并且血小板血栓素A2可以降低。同時，它可以改變紅細胞膜的流動性，改變紅細胞的變形能力，進而降低了紅細胞膜微黏度，調(diào)節(jié)紅細胞的免疫作用，減少紅細胞在血管中的粘附，改善其流動性，以便于促進其順利通過毛細血管，改善局部微循環(huán)，促進血流順暢，可在一定程度上降低全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后DVT的發(fā)生率，減少血栓形成，促進骨折愈合。上述研究表明，三七總皂苷通過影響相關(guān)細胞狀態(tài)，改善造血微循環(huán)狀態(tài)，確保骨折斷端血流順暢，發(fā)揮促進骨折愈合的作用。

4 結(jié)語

傳統(tǒng)中藥三七一直以來被廣泛應(yīng)用于骨傷科疾病的治療中，特別是骨折、骨缺損、骨關(guān)節(jié)炎等疾病，近年來，關(guān)于三七總皂苷的基礎(chǔ)研究逐步成為熱點，以一步了解三七總皂苷在疾病治療中的作用機制，目前研究證明三七總皂苷可通過具有不同作用機制的分子信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮促進骨折愈合的作用，并可以調(diào)節(jié)骨折愈合微環(huán)境，最終達到促進骨折愈合的目的，因此，三七總皂苷在治療骨折、骨缺損、骨關(guān)節(jié)病等方面具有良好的臨床研究價值，但對三七總皂苷作用于不同分子通路間的影響作用還有待進一步明確，以求進一步為組織工程學(xué)的應(yīng)用提供新的研究方案，也為促進骨折愈合方面提供新的治療思路。