HPLC法測(cè)定金酸萍顆粒中蒽醌類成分的含量

杜繼權(quán) 吳春玲 張志君

【摘 要】 目的：建立中成藥金酸萍顆粒中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚3種蒽醌類成分的HPLC含量測(cè)定方法。方法：采用Thermo Hypersill GOLD C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）; 流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液液（85∶15）;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)選擇254 nm;柱溫在25 ℃。結(jié)果：大黃素、大黃酚以及大黃素甲醚分別在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系均良好（r≥0.9999）;平均加樣回收率分別為96.12%、104.22%和97.41%，RSD分別為2.47%、1.57%和1.96% 。結(jié)論：本方法操作方便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于金酸萍顆粒的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 金酸萍顆粒;蒽醌類成分;HPLC

【中圖分類號(hào)】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）21-0028-04

Determination of Anthraquinones in Jinsuanping Granules by HPLC

DU Jiquan WU Chunling ZHANG Zhijun*

School of Pharmacy， Hubei University of Science and Technology， Xianning? 437100， China

Abstract：Objective An HPLC method was established for the simultaneous determination of three anthraquinones （emodin， chrysophanol and physcion） in Jinsuanping Granules （Siphonostegiae Herba， Rumicis acetosae Radix， Marsileae Herba）.Method The Thermo Hypersill GOLD（4.6 mm×250 mm，5 μm）was adopted and the mobile phase was methanol-0.1% phosphoric acid aqueous solution（85∶15，V/V） with a flow rate at 1.0mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm and the column temperature was kept at 25 ℃.Results Emodin， chrysophanol and physcion showed a good linear relationship with peak areas in the corresponding concentration range （ r≥0.9999 ）. Whose average recovery rates were 96.12%， 104.22% and 97.41%， respectively， and the RSD was 2.47%，1.57% and 1.96%， respectively.Conclusion It’s a convenient， accurate and reproducible method ， and can be used to control the quality of Jinsuanping Granules.

Key words：Jinsuanping Granules; Anthraquinone; HPLC

中成藥金酸萍顆粒由北劉寄奴（Siphonostegia chinensis Benth.）、酸模（Rumex acetosa L.）、萍（Marsilea quadrifolia L.）3味藥組成，具有清熱解毒、利濕退黃的功效[1]，主要用于治療急性黃疸型、慢性、重癥等類型肝炎，有降低轉(zhuǎn)氨酶、恢復(fù)肝功能的作用[2-4]。方中臣藥酸模，系蓼科酸模屬植物，在我國(guó)廣泛分布，民間作“土大黃”使用，根主要含有大黃素型蒽醌類化合物，具有清熱解毒、涼血止血之功[5-7]。

金酸萍顆粒標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-1561-93收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑第八冊(cè)），原標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)性狀、酸模的薄層鑒別和通則進(jìn)行檢測(cè)[8]，而無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，不能全面反映酸模質(zhì)量。因此，金酸萍顆粒中3個(gè)蒽醌類成分的定量測(cè)定方法的建立，為金酸萍顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂與提高提供依據(jù)，更好的控制金酸萍顆粒的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 北京清博華LC300型高效液相色譜儀，UV檢測(cè)器;Hypersill GOLD C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備研究所 ）;GWP十萬(wàn)分之一分析天平（型號(hào)：XS105DU）。

1.2 試藥 大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-201512）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110757-201607）和大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201817）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;金酸萍顆粒（批號(hào)：20190204，20200707，20200901，20201001，20201002，20201003，20201004，20201005，20201101，20201102，20201103）和缺酸模的陰性樣品均由湖北福人金身藥業(yè)有限公司提供;甲醇為色譜級(jí)（天津歐博凱化工有限公司）;實(shí)驗(yàn)用水為CM-RO-C2型超純水機(jī)制水，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱： Hypersill GOLD C18柱（4.6mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇（A）：0.1%磷酸水溶液（B）=85∶15;流速為：1.0mL/min;UV：254 nm;柱溫控制在25 ℃;進(jìn)樣體積20 μL。所檢測(cè)成分理論塔板數(shù)不低于5000。

2.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液：分別精密稱得適量上述對(duì)照品于量瓶，加甲醇溶解并定容，得對(duì)照品貯備液，4 ℃避光保存。精密移取1.25 mL貯備液于10mL棕色量瓶，定容得濃度為大黃素20 μg/mL、大黃酚9 μg/mL以及大黃素甲醚16 μg/mL的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精準(zhǔn)稱取金酸萍顆粒粉末1 g到具塞錐形瓶中，加25 mL甲醇，超聲提取30 min，放冷后用甲醇補(bǔ)重，取5 mL續(xù)濾液水浴蒸干，然后依次加入水10 mL、濃鹽酸2 mL及二氯甲烷10 mL，熱回流水解30 min，待冷確后倒到60 mL分液漏斗中，用少量二氯甲烷洗滌2次，并入分液漏斗中，靜置后分取二氯甲烷層，酸液再以二氯甲烷萃取，共2次，每次10 mL，合并并回收二氯甲烷，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)到10 mL量瓶定容，即得[10-12]。

陰性樣品溶液：取陰性樣品，其制備操作與供試品處理方法相同，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下制備的三種溶液，照“2.1”項(xiàng)下條件采集色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，在既定色譜條件下， A和B中3個(gè)色譜峰的保留時(shí)間均能相對(duì)應(yīng)，而C在相應(yīng)的時(shí)間未出峰，說(shuō)明專屬性較強(qiáng)。

2.4 線性關(guān)系考察 取6個(gè)10 mL棕色量瓶，移液槍依次準(zhǔn)確加入0.3125 mL、0.625 mL、1.25mL、2.5 mL、3.75 mL、5 mL對(duì)照品貯備液，用甲醇稀釋至刻度線，得到6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，濃度從低到高依次測(cè)定，并對(duì)其數(shù)據(jù)處理。峰面積為Y軸，濃度（μg/mL）為X軸，得到3個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線：大黃素y=82.6569x+36.4847，r=1.0000;大黃酚y=142.3478x+18.1365，r=1.0000;大黃素甲醚y=22.9311x+11.4092，r=0.9999。3個(gè)成分依次在5～80 μg/mL， 2.25～36 μg/mL和4～64 μg/mL與峰響應(yīng)值相關(guān)性良好。

2.5 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取20 μL對(duì)照品溶液，依“2.1”色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次測(cè)定3個(gè)成分的峰面積，并計(jì)算得大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.93%、1.13%和0.61%，說(shuō)明該儀器精密度較好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)制備6份供試品溶液（批號(hào)：20190204），照“2.1”項(xiàng)色譜條件，采集峰面積，計(jì)算得大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD分別為1.29%、1.96%、0.88%，表明該法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（樣品批號(hào)：20190204），以“2.1”項(xiàng)色譜條件下，在0～24 h每隔一段時(shí)間測(cè)定大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD（n=6）分別為0.71%、0.83%、1.14%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液比較穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取知道含量的樣品（批號(hào)：20190204）約1 g，精密稱定，以1∶0.5，1∶1，1∶1.5的比例精準(zhǔn)加入對(duì)照品，再按“2.2”項(xiàng)下方法制備，每個(gè)比例平行3份，照“2.1”色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率及RSD。大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為96.12%、104.22%和97.41%，RSD分別為2.47%、1.57%和1.96%。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定 取11批次樣品，依法制備樣品并測(cè)定其峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品3個(gè)成分的含量（按干燥品計(jì)），結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 樣品提取條件的優(yōu)化 在制備供試品溶液時(shí)，摸索了不同提取方式（超聲和加熱回流方式分別提取30 min和45 min）、提取溶劑（甲醇、80%甲醇、乙醇、80%乙醇）、溶劑用量（12.5 mL、25mL、50 mL）、鹽酸用量（1 mL、2 mL、3 mL）和水解時(shí)間（30 min、45 min、60 min）對(duì)待測(cè)組分含量的影響。結(jié)果顯示以加入25 mL甲醇，超聲30min，加入鹽酸2 mL，水解30min的提取條件較佳。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 供試品和對(duì)照品溶液的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示，兩溶液最大吸收波長(zhǎng)均在254nm和285 nm附近，同時(shí)參考2015版中國(guó)藥典大黃中蒽醌類成分的含量測(cè)定方法 [13]，檢測(cè)波長(zhǎng)確定為254 nm。曾對(duì)甲醇-0.1%磷酸溶液的比例進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)以體積比為85∶15時(shí)3種成分的保留時(shí)間適中，理論塔板數(shù)較高，峰形良好，可滿足快速定量檢驗(yàn)的要求。

3.3? 樣品測(cè)定結(jié)果分析 表2含量測(cè)定結(jié)果顯示，樣品中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量分別為1.2468～1.6092 mg/g、0.3259～0.5183 mg/g、0.8122～1.2486 mg/g，該廠提供的不同批次樣品3個(gè)蒽醌成分的含量水平波動(dòng)較大，推測(cè)原因可能與原料藥的質(zhì)量差異有關(guān)，因此應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制原料藥的質(zhì)量，把控生產(chǎn)環(huán)節(jié)，以保證藥品質(zhì)量的穩(wěn)定。

4 結(jié)論

本研究建立了金酸萍顆粒中3個(gè)大黃素型蒽醌類成分的HPLC含量測(cè)定方法，該方法操作簡(jiǎn)單，專屬性強(qiáng)，快速準(zhǔn)確，可為金酸萍顆粒的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2021-03-15 編輯：劉斌）