紅豆杉提取物維康醇對膀胱癌T24細胞增殖抑制的實驗研究

劉宏偉 左玲 柳建軍 許志堅 桂志明

【摘 要】 目的：探討紅豆杉提取物維康醇抑制膀胱癌T24細胞增殖的機制。方法：用維康醇處理膀胱癌T24細胞，MTS法檢測維康醇對細胞增殖的影響;流式細胞術檢測維康醇對細胞周期的影響;實時熒光定量PCR和westernblot檢測Cyclin D1、CDK4、p21 mRNA和蛋白表達水平的影響。結果：維康醇呈濃度和時間依賴性抑制T24細胞的增殖;維康醇誘導細胞周期阻滯于G1期，并下調Cyclin D1、CDK4表達，上調p21表達。結論：維康醇能夠抑制膀胱癌T24細胞的增殖，可能與下調Cyclin D1和CDK4表達，上調p21表達，導致細胞周期于G1期阻滯有關。

【關鍵詞】 紅豆杉;維康醇;膀胱癌;增殖;Cyclin D1

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2021）21-0015-04

Inhibitory Effect of Alteronol， an Extract from Taxus Chinensis， on the Proliferation of Bladder Cancer T24 cells

LIU Hongwei1 ZUO Ling2 LIU Jianjun1 XU Zhijian1 GUI Zhiming1

1.Department of Urology， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524001， China;

2.Department of Traditional Chinese Medicine， the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524003，China

Abstract：Objective To investigate the mechanism of the inhibitory effect of Alteronol on the proliferation of bladder cancer T24 cells.Methods Bladder cancer T24 cells were treated with Alteronol. MTS assay was performed to test the effect of Alteronol on cell proliferation. Flow cytometry was used to detect the effect of Alteronol on cell cycle， and real-time quantitative PCR and western blot were performed to detect the expression of cyclin D1， CDK4 and p21.Results Alteronol inhibited the proliferation of T24 cells in a concentration and time-dependent manner. Alteronol induced cell arrest in G1 phase， down-regulated the expression of cyclin D1 and CDK4， and up-regulated the expression of p21.Conclusion Alteronol can inhibit the proliferation of bladder cancer T24 cells， which may be related to the down-regulation of the expression of Cyclin D1 and CDK4 and up-regulation of p21 expression， leading to cell cycle arrest in G1 phase.

Keywords：Taxus Chinensis; Alteronol;Bladder Cancer;Proliferation; Cyclin D1

紅豆杉又名紫杉、赤柏松。辛、甘，大溫，歸胃、肝經。紅豆杉的根、莖、葉都可以入藥，具有利尿消腫、通經止痛的作用?！侗静菥V目》記載紅豆杉具有治療傷寒、霍亂、排毒等功效。紅豆杉是世界上公認的瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌中藥，具有解毒散結之療效，在1992年被FDA批準用于治療晚期肺癌、卵巢癌、子宮癌等[1]。藥理研究[2]表明紅豆杉具有誘導癌細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和轉移、抑制血管生成、影響癌細胞代謝周期、逆轉腫瘤多耐藥性等抗癌藥理作用，其提取物紫杉醇對晚期乳腺癌、卵巢癌、消化道腫瘤、非小細胞肺癌等有明顯療效，總有效率高達75%以上，對膀胱癌也有較好的療效[3-5]。維康醇（Alteronol）是從云南紅豆杉樹皮中分離提取出微生物菌誘變株，對其菌絲體進行特殊發(fā)酵、純化而獲取的一種新型單體化合物，其分子式為C20H14O6，分子量為350.3，是維泰醇（Alternol，C20H16O6，分子量為352.3）的同型異構體[6]，與臨床上常用抗腫瘤藥物紫杉醇的來源相同[7]。

研究[6，8]表明維泰醇類化合物能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，但對維康醇的研究不多。維康醇不僅可以抑制白血病HL-60細胞[9]、肝癌細胞[10]的增殖，而且可以誘導肺癌及前列腺癌細胞的凋亡[11-12]。目前維康醇對膀胱癌細胞的作用未明，本研究擬探討維康醇對膀胱癌細胞增殖、周期的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人膀胱癌T24細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 藥物、試劑及儀器 維康醇（汕頭市雙駿生物科技有限公司）;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司;青霉素/鏈霉素、MTS、Propidium Iodide、RNase A購自Sigma公司;細胞培養(yǎng)箱購自BINDER公司;SPARK 10 M酶標儀（TECAN公司）;流式細胞儀（美國BD公司）;QuantstudioTM DX system實時熒光定量 PCR儀（Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液將T24細胞制備成細胞懸液，置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每1～2天換液，取對數生長期細胞用于實驗研究。

1.2.2 MTS法檢測維康醇對T24細胞增殖的影響將T24細胞鋪于24孔板，24 h后分別用不同濃度的維康醇（4、8、12、16 μmol/L）進行處理，對照組用等體積RPMI-1640培養(yǎng)基替代，48 h后收集上述五組細胞，重懸細胞并計數，以1×103個/孔接種于 96 孔板中，每個孔 200 μL，放在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，然后向每個孔加入 20 μL MTS 溶液，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育 2 h，選取 492 nm 波長，在酶標儀上測定OD值，重復三次，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=（Atreat-Ablank）/（Acontrol-Ablank）×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞周期 收集經維康醇處理24 h后的T24細胞于離心管中，離心去培養(yǎng)液，加入3 mL預冷的70%乙醇，用槍頭吹打使細胞分散，置于4 ℃冰箱過夜，然后離心去乙醇，用PBS洗滌2次，加入0.05 mg/mL的Propidium Iodide和0.5 mg/mL的RNase A，避光下染色30min，上流式細胞儀檢測細胞周期比例。

1.2.4 實施熒光定量PCR 收集經維康醇不同處理組的T24細胞，RNAiso提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。將cDNA稀釋10倍，按10uL反應體系采用兩步法進行PCR擴增。所用引物如下：CyclinD1-F：GCATGTTCGTGGCCTCTAAG，[JP4]CyclinD1-R：CGTGTTTGCGGATGATCTGT;CDK4-F： [JP]AGTGTGAGAGTCCCCAATGG;

CDK4-R： CCTTGATCTCCCGGTCAGTT;p21-F： TGCCCAAGCTC TACCTTC C，p21-R： CAGGTCCACATGGTCTTCCT;GAPDH-F：GGAGCGAGATCCCT CCAAAAT;GAPDH-R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。反應條件：95? ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸40 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt統(tǒng)計分析。

1.2.5 Western blot 用12 μmol/L的維康醇孵育T24細胞，48 h后棄培養(yǎng)基，PBS清洗一次，加入RIPA裂解液，收集對照組和處理組蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按比例加入loadingbuffer，98 ℃ 5min進行蛋白變性。每孔加入30 μg蛋白進行電泳，濃縮膠設置80 V，分離膠設定100 V，電泳90min。然后采用PVDF膜進行轉膜，250 mA，2h。5%脫脂奶粉封閉1 h，分別孵育Cyclin D1、CDK4、p21兔多克隆抗體（1∶1000，proteintech公司）及GAPDH鼠單克隆抗體（1∶10000，ABclonal公司），4 ℃過夜。TBST洗膜，室溫下孵育二抗1 h，洗膜后加入化學發(fā)光液曝光拍照。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計分析采用SPSS20.0軟件包，計量資料采用均數加減標準差（x±s）表示，均通過正態(tài)性檢驗，組間計量資料比較采用本t檢驗，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 維康醇呈濃度依賴性抑制膀胱癌細胞增殖 以不同濃度的維康醇（4、8、12、16 μmol/L）處理膀胱癌T24細胞48 h，細胞增殖抑制率逐漸增加，分別為9.33%、16.26%、50.56%和61.03%。不同濃度維康醇組OD值與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 維康醇呈時間依賴性抑制膀胱癌細胞增殖 以12 μmol/L的維康醇作用于膀胱癌T24細胞，分別作用24、48、72、96 h，MTS結果顯示隨著時間的延長，維康醇對T24細胞的抑制率逐漸增加，維康醇處理96 h后，細胞的抑制率達74.30%，說明維康醇抑制T24細胞增殖存在時間依賴性。見表2。

2.3 維康醇對膀胱癌細胞周期及相關蛋白的影響 流式細胞術測定細胞周期結果顯示，當以12 μmol/L的維康醇處理T24細胞24 h后，G1期比例由38.77%升至52.01%，S期比例由47.30%降至38.11%，G2期比例稍有下降（圖1A），進一步對周期相關蛋白基因進行qRT-PCR和western blot檢測，結果顯示，與對照組相比，維康醇作用的T24細胞中CDK4和Cyclin D1的mRNA和蛋白水平顯著降低，p21的mRNA和蛋白水平明顯上調（圖1B、1C）。

3 討論

維康醇是從云南昆明紅豆杉樹皮中提取、合成的一種新型單體化合物。研究[13]表明，維康醇可通過引起細胞周期阻滯、抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡等發(fā)揮其抗癌作用。如維康醇可能通過線粒體調控的內源通路誘導肺癌A549細胞的凋亡[11]，通過下調細胞周期蛋白CyclinD1和細胞周期蛋白依賴性激酶的底物磷酸化的Rb蛋白表達抑制白血病HL-60的增殖[9]。維康醇還可以抑制Akt/mTOR和TGFβ/Smad3通路，與自噬抑制劑3-MA聯合應用不僅能顯著抑制黑色素瘤的生長，而且能抑制腫瘤的侵襲和遷移[14]。維康醇和阿霉素聯合應用可顯著抑制乳腺癌4T1細胞周期相關蛋白CDC2和Cyclin B1的表達水平[15]，誘導細胞周期阻滯于G2/M期，從而抑制細胞增殖[16]。維康醇誘導前列腺癌細胞死亡的方式主要為時間依賴性的晚期凋亡，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)化療藥物伊立替康（CPT-11）、多西他賽及紫杉醇[12]。本研究采用不同濃度的維康醇干預膀胱癌T24細胞，結果表明維康醇顯著抑制細胞增殖，存在時間和劑量依賴性，說明維康醇亦對膀胱癌發(fā)揮一定的抗癌作用。

G1/S期和G2/M期是細胞周期的兩個關鍵限制點，其中G1/S期在啟動細胞周期過程中發(fā)揮關鍵作用。為了探討維康醇抑制膀胱癌增殖的作用機制，進一步檢測了其對細胞周期的影響，結果顯示維康醇處理后T24細胞的G1期比例明顯增加，S期比例明顯下降，與既往研究結果一致。劉亮亮等[9]研究發(fā)現以1.6 μg/mL維康醇孵育白血病HL-60細胞24 h后，細胞的G1期比例由34.9%增加至53.0%，S期比例由54.4%減少至32.9%。在G1/S限制點，CyclinD1、CyclinE分別與CDK4、CDK2形成激酶復合物，促進細胞周期G1/S轉化，促進細胞異常增殖、惡變。HeLa細胞經維康醇處理后，Cyclin D1和CDK4蛋白水平顯著下降[17]。本研究同樣表明，維康醇處理膀胱癌細胞24 h后 Cyclin D1和CDK4表達明顯下調，p21表達上調，說明維康醇可能通過下調Cyclin D1和CDK4表達，上調p21表達，使T24細胞在G1期受阻，進而抑制膀胱癌細胞的增殖。

誘導細胞凋亡是抗腫瘤藥物研發(fā)的作用機制之一，目前研究報道大多數腫瘤細胞經維康醇處理后出現了凋亡現象，如30 μmol/L維康醇作用于HepG2細胞48 h后，細胞凋亡率顯著升高[10]。唐宇哲等通過維康醇孵育前列腺癌PC3細胞12 h，PC3晚期細胞凋亡率達14.8%±1.2%，明顯高于正常前列腺細胞株BPH1的6.8%±1.1% [12]，但經維康醇處理的前列腺癌細胞株DU145和白血病HL-60的凋亡比例較低，均低于10%[9， 12]。維康醇是否也誘導膀胱癌細胞凋亡有待進一步研究。

綜上所述，維康醇能夠抑制膀胱癌T24細胞的增殖，其可能與下調Cyclin D1和CDK4表達，上調p21表達，導致細胞G1期阻滯有關，但其深入機制有待后續(xù)進一步研究。

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（收稿日期：2021-03-12 編輯：劉斌）