石油烴降解菌Pseudomonas sp.及其生物表面活性劑對(duì)原油處理效果分析

王衛(wèi)強(qiáng)， 崔 靜， 吳尚書(shū)， 董 美， 張海娟

(遼寧石油化工大學(xué) 石油天然氣工程學(xué)院，遼寧 撫順 113001)

原油在管道輸送過(guò)程中，蠟組分常常會(huì)因?yàn)榄h(huán)境溫度降低而結(jié)晶析出[1]，導(dǎo)致管道輸送半徑變小，情況嚴(yán)重會(huì)造成凝管停運(yùn)；此外，若原油黏度過(guò)大，則流動(dòng)性較差，輸送成本大大提高。針對(duì)原油輸送過(guò)程中所帶來(lái)的問(wèn)題，20世紀(jì)80年代，以美國(guó)為代表的西方國(guó)家將微生物技術(shù)應(yīng)用到石油開(kāi)采運(yùn)輸中[2]。微生物能夠以原油中的蠟分子為碳源，其生長(zhǎng)代謝過(guò)程就是對(duì)烷烴的降解過(guò)程，削弱蠟晶結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，從而降低原油的黏度及蠟含量，提高原油流動(dòng)性；同時(shí)，有些菌株在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生生物表面活性物質(zhì)，易吸附在微小蠟晶表面，防止蠟晶之間互相聚集、長(zhǎng)大和沉積，從而起到防蠟作用[3-4]。因此，微生物清防蠟技術(shù)在原油開(kāi)采及運(yùn)輸過(guò)程中具有重要意義。

綜上所述，微生物技術(shù)作用于原油中有多方面效果，可以降解原油中的脂肪烴，降低原油凝點(diǎn)、黏度及蠟含量。筆者從受石油污染土壤中篩選出1株能夠降解石油烴類的W12#菌株。對(duì)該菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列比對(duì)鑒定，測(cè)試其是否產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，鑒定細(xì)胞表面對(duì)烴類的黏附性以及對(duì)正十六烷烴的乳化性能；通過(guò)菌株與原油作用，測(cè)定原油中的蠟含量、黏度及粒徑變化，進(jìn)一步證明W12#菌株對(duì)原油的除蠟降黏作用，以期提高原油流動(dòng)性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

1.1.1 菌株與原油

從遼河油田附近長(zhǎng)期經(jīng)受石油污染土壤中篩選出1株以液體石蠟為唯一碳源，產(chǎn)生表面活性物質(zhì)的菌株，命名為W12#。菌株于4 ℃保存。

實(shí)驗(yàn)所用原油取自于遼河油田。

1.1.2 試劑與儀器

胰蛋白胨、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4、NaCl、NH4Cl、瓊脂粉、三氯甲烷、甲醇、Urea、Tris硼酸(TEB)，均為AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；液體石蠟，CP，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NaNO3，AR，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；正十六烷烴，AR，北京百奧萊博科技有限公司；乙醇，CP，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；戊二醛，生化試劑BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；裂解液，生物試劑，日本TaKaRa公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖凝膠，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Super DNA Marker(含有Buffer和Marker溶液)，上海研謹(jǐn)生物科技有限公司。

CF-B-10H生化儀配套純水機(jī)，四川德立世科技有限公司；SHZ-82水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；Z326K高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)賀默公司；Vortex-5渦旋振蕩器，Kylin-bell公司；梯度PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)，上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；Q2000 DSC差示熱量掃描儀，美國(guó)TA公司；HAKKE流變儀，上海珩璟科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：去離子水1000 mL，K2HPO41 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 5 g，NH4Cl 1 g, NaNO31 g。

Luria-Bertani (LB)液體培養(yǎng)基：超純水1000 mL，胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g。

LB固體培養(yǎng)基：由LB液體培養(yǎng)基中添加15%瓊脂得到。

液體石蠟培養(yǎng)基：超純水1000 mL，NaCl 5 g，NH4Cl 1 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KH2PO41.25 g，K2HPO41.25 g，NaNO32 g，液體石蠟1 mL。

PUM緩沖液：超純水1000 mL，K2HPO422.2 g，KH2PO47.26 g，Urea 1.8 g，MgSO4·7H2O 0.2 g。

以上培養(yǎng)基的制備條件：壓力,0.105 MPa；溫度,121 ℃；時(shí)間,20 min。

1.2 W12#菌株代謝產(chǎn)物——表面活性物質(zhì)的分析

1.2.1 排油圈實(shí)驗(yàn)

排油圈實(shí)驗(yàn)可以比較直觀地反映樣品的表面活性能力[11]。排油圈法中常使用油相有橄欖油、機(jī)用柴油和液體石蠟[12]。這些油相與水相顏色差別不大，效果圖不明顯。筆者對(duì)排油圈檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后以原油為油相。將W12#菌發(fā)酵液經(jīng)離心機(jī)離心，取100 μL上清液備用；取30 mL的超純水置于90 mm的培養(yǎng)皿中，滴入1 mL已預(yù)熱到40 ℃的原油，當(dāng)原油均勻地平鋪在水面形成一層薄膜之后，滴加上清液，觀察是否產(chǎn)生排油圈，若產(chǎn)生排油圈，則表明W12#菌株產(chǎn)生表面活性物質(zhì)[13]。

1.2.2 W12#菌株對(duì)石油烴的黏附性(BATH)測(cè)試

BATH測(cè)定法用于測(cè)量菌株對(duì)正十六烷作為底物的細(xì)胞表面疏水性[14]，表示細(xì)胞對(duì)疏水性的黏附百分比。借鑒Zhou等[15]和Bharali等[16]對(duì)細(xì)胞疏水性的測(cè)定方法，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行改良。

將W12#菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，取其發(fā)酵液經(jīng)離心機(jī)離心，去除上清液，得到已分離出的細(xì)胞；加入PUM緩沖液對(duì)細(xì)胞外物質(zhì)進(jìn)行清洗，搖勻，獲得菌懸液，備用。以PUM緩沖液為空白，將菌懸液的光學(xué)密度(OD400 nm)調(diào)試至(0.3～0.6)。取 1 mL 的菌懸液于1.5 mL離心管中，加入0.2 mL的正十六烷烴至離心管中，于25 ℃下溫育5 min，劇烈振蕩60 s，室溫靜置1 h后進(jìn)行相分離，用移液槍快速?gòu)碾x心管菌懸液層吸取200 μL于比色皿中，采用UV紫外分光光度計(jì)在400 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量菌液的光學(xué)密度OD。通過(guò)測(cè)量菌懸液初始的光密度值以及處理后菌懸液的光密度值，計(jì)算生物體的細(xì)胞表面疏水性y。

y=(1-a/b)×100%

(1)

式中：y為細(xì)胞疏水性，%；a為初始菌液的OD400 nm值；b為終末菌液的OD400 nm值。

1.2.3 W12 #菌株對(duì)烷烴的乳化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Parhamfar等[17]的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)對(duì)測(cè)量表面活性物質(zhì)的乳化活性進(jìn)行改進(jìn)。取4 mL液體石蠟和等體積的菌發(fā)酵液上清液置于離心管中，渦旋振蕩器充分振蕩2 min，25 ℃條件下靜置24 h。采用式(2)計(jì)算乳化指數(shù)(Emulsification index，E24)[18]。

(2)

式中：h為乳化層高度，cm；H為混合液體總高度，cm。

1.2.4 W12#菌株代謝產(chǎn)物的鑒定

將10 mL已培養(yǎng)的菌發(fā)酵液置于高速冷凍離心機(jī)，4000 r/min條件下離心20 min，取出上清液，溶于10 mL三氯甲烷與甲醇混合液(V(三氯甲烷)/V(甲醇)=2/1)中進(jìn)行萃取。將萃取后的液體置入44 ℃的烘箱中烘干，稱取烘干后樣品的質(zhì)量，即為W12#菌株代謝產(chǎn)物的質(zhì)量。將1 mg代謝產(chǎn)物與100 mg KBr混合研磨，壓片，通過(guò)THermo公司的iS10傅里葉紅外光譜儀在400～4000 cm-1波數(shù)內(nèi)檢測(cè)。

1.3 W12#菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及鑒定

1.3.1 W12#菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

在LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線，觀察菌落形態(tài)。

將W12#菌發(fā)酵液經(jīng)高速冷凍離心機(jī)離心分離出菌株，采用日本日立公司的S-4800掃描電鏡觀察菌株形態(tài)。掃描電鏡樣品制備前期工作[19]：取2 mL的菌發(fā)酵液在1000 r/min下離心分離，去除上清液，使用pH值7.2～7.4的0.1 mol PBS緩沖液清洗2次，每次15 min；菌株經(jīng)清洗后立即加入戊二醛溶液(V(戊二醛)/V(水)=2.5/97.5)內(nèi)固定4 h，用V(乙醇)/V(水)分別為30/70、50/50、70/30、80/20、90/10的乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行脫水，不同體積比乙醇溶液脫水 15 min；在乙醇中脫水2次，每次15 min；第2次做真空冷凍干燥24 h。

1.3.2 W12#菌株鑒定

取50 μL裂解液置于離心管中，從LB平板上取W12#菌株加入離心管中，密封，離心，置于恒溫水浴鍋中，在80 ℃下加熱15 min，取出，再微離心。以16S rDNA為目的基因，設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增在Mastercycler上進(jìn)行。

正向引物為27F，反向引物為1492R。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的反應(yīng)體系如表1所示。反應(yīng)條件如表2所示，其中變性(Denaturation)、退火(Annealing)、延伸(Extension)過(guò)程循環(huán)30次。

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠置入25 mL TBE溶液，振蕩均勻，置于微波爐中加熱2 min，倒入已經(jīng)插好梳子的配膠槽中，冷卻30 min。將PCR 產(chǎn)物取出，準(zhǔn)備Marker溶液；將膠板取出，置入電泳儀；用移液槍取6 μL Buffer溶液均勻滴成2個(gè)點(diǎn)，取5 μL Marker溶液加入第1個(gè)點(diǎn)，第2個(gè)點(diǎn)加入5 μL PCR產(chǎn)物，即3 μL Buffer+5 μL Marker/PCR 產(chǎn)物。取各點(diǎn)溶液吹打均勻后加入凝膠板孔中，打開(kāi)電泳儀，電泳30 min。通過(guò)電泳檢測(cè)確定目的片段長(zhǎng)度，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16SrDNA測(cè)序。通過(guò)Blast軟件將獲得的基因序列與GenBank中的核酸序列進(jìn)行相似性比較，用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[20]。

表1 聚合酶鏈反應(yīng)體系Table 1 PCR system

表2 聚合酶鏈反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction conditions

1.4 W12#菌株對(duì)原油處理效果檢測(cè)

將W12#菌株以3%的接種量接種于100 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入50 mL的原油，置于水浴恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)7 d，測(cè)定原油蠟含量、黏度與分子粒徑的變化。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：40 ℃，150 r/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 W12#代謝產(chǎn)物——生物表面活性劑的分析結(jié)果

2.1.1 排油圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將W12#菌株的上清液加入到油膜中，油膜向四周排開(kāi)，結(jié)果如圖1所示。通過(guò)Nano measure測(cè)量所得，排油圈直徑為57.47 mm，證明W12#菌株代謝產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，可提高原油中不溶性化合物的溶解度，增加菌株與原油接觸面積[21]。

2.1.2 W12#菌株對(duì)正十六烷烴的黏附性

細(xì)胞表面疏水性是決定碳?xì)浠衔锱c細(xì)胞表面黏附性的主要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，W12#菌株的細(xì)胞表面疏水性為89.55%，說(shuō)明該菌株具有非常高的表面疏水能力，對(duì)原油的親和力高于對(duì)水親和力，對(duì)烴的黏附性較強(qiáng)[22]，易附著于疏水性物質(zhì)表面。這有助于微生物在疏水性底物上生長(zhǎng)并提高其生物利用度[23-25]，從而有利于改善儲(chǔ)層和地面設(shè)施的烴降解。與Mishra等[26]所研究銅綠假單胞菌在加入十六烷烴的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的細(xì)胞疏水性的結(jié)果相一致。

圖1 排油圈Fig.1 Oil-displacement activity(a) Untreated oil sample;(b) Oil spreading enclosure formed by W12 #

2.1.3 W12#菌株對(duì)烷烴的乳化作用

W12#菌株與液體石蠟混合，靜止24 h后可觀察到明顯穩(wěn)定的乳化層，結(jié)果如圖2所示。

圖2 W12#菌株乳化效果Fig.2 Emulsification effect of the strain W12#(a) Untreated sample； (b) After treatment by W12#

通過(guò)式(2)計(jì)算E24，W12#菌株的乳化層高度及E24如表3所示。由表3可知，W12#菌產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)具有良好的乳化性能，可將石油烴乳化到基質(zhì)中，并形成穩(wěn)定的乳狀液，使菌發(fā)酵液與石蠟充分接觸，加快石蠟降解[27]。

2.1.4 代謝產(chǎn)物鑒定

W12#菌株代謝產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)的紅外吸收光譜如圖3所示。由圖3可知，W12#菌株代謝產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)中存在糖脂的典型峰。3144.16 cm-1為N—H鍵的伸縮振動(dòng)峰；2923.73 cm-1和2858.57 cm-1為脂肪族的—CH2—的對(duì)稱拉伸振動(dòng)；1642.89 cm-1為酰胺的CO—N鍵拉伸振動(dòng)，屬于脂肽；1389.25 cm-1處為—CH3基團(tuán)做不對(duì)稱形變振動(dòng)；1154.85 cm-1處為糖環(huán)縮醛結(jié)構(gòu)C—O—C的振動(dòng);證實(shí)糖脂存在。971.75 cm-1為C—O鍵伸縮振動(dòng)造成。與Sakthipriya等[28]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，證明W12#菌株代謝產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)為糖脂類。

表3 W12#菌株的乳化能力測(cè)定Table 3 Determination of emulsification capability of W12#

圖3 W12#菌株代謝產(chǎn)物的紅外吸收光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of metabolites of the strain W12#

2.2 W12#菌株的形態(tài)觀察及鑒定結(jié)果

2.2.1 W12#菌株的形態(tài)觀察

W12#菌株的形態(tài)如圖4所示。由圖4(a)可見(jiàn)，W12#菌株在LB固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，在LB固體平板上，菌株W12#呈油滴狀，米黃色，表面光滑。由圖4(b)可知，W12#菌株呈長(zhǎng)桿狀，無(wú)鞭毛，邊緣光滑濕潤(rùn)，大小為(0.5～0.7) μm×(3～3.5) μm。

圖4 W12#菌形態(tài)Fig.4 Morphology of W12# strain(a) Colony morphology on LB medium； (b) SEM image

2.2.2 W12#菌株16S rRNA鑒定結(jié)果

經(jīng)過(guò)16S rRNA測(cè)定，W12#菌株的目的基因片段長(zhǎng)度為1050 bp。經(jīng)過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST對(duì)比可知，該菌株屬于假單胞菌(Pseudomonassp.)，其GenBank序列號(hào)為MF948933.1，同源性達(dá)到99.9%。W12#菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖5所示。

圖5 菌株W12#的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of W12#

2.3 W12#菌株對(duì)原油作用效果分析

2.3.1 W12#菌株對(duì)原油中蠟的影響

采用差示掃描量熱儀測(cè)定經(jīng)W12#菌株處理后原油的含蠟量、析蠟點(diǎn)[29]，結(jié)果列于表4。由表4可知，經(jīng)W12#菌株作用后，原油的析蠟點(diǎn)、析蠟峰點(diǎn)和析蠟潛熱均下降，原油的蠟含量降低。W12# 菌株能夠以原油中的長(zhǎng)鏈烷烴為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，長(zhǎng)鏈烷烴的減少有助于削弱蠟析出后形成的蠟晶網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，從而使原油中的蠟含量降低；同時(shí)，W12#菌株在代謝過(guò)程中產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，吸附在蠟晶表面上，增加蠟晶表面的疏水性，不利于蠟晶積聚，使蠟晶保持細(xì)小狀態(tài)，阻止或減弱微小蠟晶之間互相聚集、長(zhǎng)大和沉積，從而起到防蠟作用[30]。

表4 原油經(jīng)W12#菌株處理前后蠟的變化Table 4 Wax changes of the oil sample with W12# treatment

2.3.2 W12#菌株對(duì)原油黏度的影響

采用流變儀對(duì)W12#菌株處理前后原油黏度進(jìn)行測(cè)量，原油黏度變化及降黏率如圖6所示。由圖6可見(jiàn)，在W12#菌株處理前，原油非牛頓流體溫度段的黏度范圍為7.49～78.98 mPa·s；處理后，該溫度段黏度范圍下降至4.9～50.47 mPa·s，原油降黏率隨溫度升高而提高，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，原油降黏率最高，為63.75%。而當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，原油降黏率開(kāi)始降低，黏度變化甚微。20～40 ℃溫度范圍內(nèi)，原油屬于非牛頓流體，此時(shí)，菌株隨溫度升高而生長(zhǎng)能力增強(qiáng)，因此對(duì)原油處理效果增強(qiáng)；而當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，超過(guò)菌株生長(zhǎng)的最適溫度范圍，高溫破壞菌株的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使菌株失活，對(duì)原油處理效果降低。溫度本身會(huì)對(duì)原油黏度產(chǎn)生影響，當(dāng)溫度升高時(shí)，原油黏度降低，但是下降幅度偏小。

圖6 原油經(jīng)W12#菌株處理前后黏度變化及降黏率曲線Fig.6 Profiles of viscosity changes and viscosity reductionratio for the crude oil treated with W12#Shear rate: 27 s-1

微生物影響原油黏度，一方面是因?yàn)槲⑸镌谏L(zhǎng)過(guò)程中利用石油中的長(zhǎng)鏈烴作為碳源，將原油中的大分子烴轉(zhuǎn)化為小分子烴，降低原油黏度[7,31]；另一方面，菌株在代謝作用下產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)有潤(rùn)濕及乳化作用，乳化原油中烷烴分子，可以降低原油的黏度，增加其溶解度，改善原油的流動(dòng)性[28,32]。

2.3.3 W12#菌株對(duì)原油組分粒徑的影響

采用FBRM監(jiān)測(cè)原油經(jīng)W12#菌株處理后形成O/W乳狀液分散相的粒徑分布變化。為了排除溫度因素對(duì)蠟晶的干擾，考慮到選用的溫度應(yīng)高于原油析蠟點(diǎn)，最終本次實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)定為50 ℃[33-34]。

原油經(jīng)W12#菌株處理前后的分散相粒徑分布變化如圖7所示。由圖7可見(jiàn)，經(jīng)W12#菌株處理后，原油在40～60 μm區(qū)間的粒徑所占的比率均低于2%；在60～100 μm區(qū)間的粒徑所占比率最少，且均不超過(guò)1%；處于1～50 μm區(qū)間的粒徑大幅度增加，最高比率達(dá)到8%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照油樣。而大于50 μm的粒徑所占的比率由原來(lái)的3%降為1.5%，尤其是在60～100 μm區(qū)間的粒徑，其長(zhǎng)鏈烴幾乎被完全降解。

圖7 原油經(jīng)W12#菌株處理前后的粒徑分布Fig.7 Chord length distribution of the crude oil before andafter W12# treatmentTemperature: 50 ℃; Rotation rate: 300 r/min

這一方面是由于微生物的直接降解，將原油中的大分子烴降解成小分子烴，使原油的粒徑尺寸減?。涣硪环矫?，微生物代謝產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，對(duì)石油烴類物質(zhì)起到增溶分散的作用[35-36]，使得石油烴類物質(zhì)乳化成更細(xì)小的顆粒，更利于微生物的附著降解。

3 結(jié) 論

(1)從遼河油田石油污染土壤中篩選出一株能夠除蠟降黏的W12#菌株，經(jīng)16S rRNA進(jìn)行測(cè)定，該菌株為假單胞菌。

(2)W12#菌株在生長(zhǎng)代謝時(shí)產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，能夠形成排油圈；W12#菌株疏水性高達(dá)89.55%；W12#菌株和液體石蠟混合后，形成明顯穩(wěn)定的乳化層，乳化指數(shù)為62.5%。經(jīng)傅里葉紅外光譜測(cè)定，代謝產(chǎn)物為糖脂類物質(zhì)。

(3)原油經(jīng)W12#菌株處理后，析蠟點(diǎn)、析蠟峰點(diǎn)以及析蠟過(guò)程中釋放的析蠟潛熱均降低；同時(shí)，蠟含量明顯降低，除蠟率為34.66%；原油在 20～40 ℃ 黏度由7.49～78.98 mPa·s降低至4.9～50.47 mPa·s，在40 ℃下，原油降黏率達(dá)到63.75%； W12#菌株可以起到除蠟降黏提高原油流動(dòng)性的作用。