生防細菌X33 的鑒定及產抑菌活性物質培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

劉詩宇，陳浩，王棋，張軍政，宋金柱

（哈爾濱工業(yè)大學，哈爾濱 150000）

植物病害是農業(yè)生產的一項主要影響因素，現今全球各國在應對植物病害方面主要采取化學農藥方法，然而化學農藥的長期大量應用可導致諸多不良作用的出現，諸如抗藥性、污染與殘留等。人們希望一種兼有良好防治效果和和環(huán)境友好的防治新方法的出現[1]。近幾十年來，生物防治因其對人畜無害、環(huán)境友好等特點，成為有效的防治方法，已被各國廣泛采用[2-3]。

類芽孢桿菌屬作為一種廣泛存在于自然環(huán)境的、可以形成耐高溫、耐旱、抗紫外線內生孢子的好氧-兼性厭氧細菌，是篩選生防菌的優(yōu)質對象[4]。多粘類芽孢桿菌（Panebacillus polymyxa）為類芽孢桿菌的模式菌種，其作為根際細菌發(fā)揮著重要的積極作用[5]。在對諸多不同植物病害進行防治時，多粘類芽孢桿菌可釋放諸多不同抗菌成分，包括蛋白類、酚類、肽類、吡嗪類與核苷類等，能夠發(fā)揮關鍵性抑菌效能[6-10]。另外，其能夠自土壤內移動定殖于植物根部[11]，宿主植物能夠經由此菌固氮與溶磷效能獲取營養(yǎng)成分[12]。同時，為了明確田間環(huán)境下相關菌種的抑菌活性，學者還開展了田間試驗，所得結果顯示，在穩(wěn)定性、兼容化學農藥性、防效一致性等方面，相較真菌與非芽孢桿菌生防菌，芽孢桿菌生防菌劑表現出明顯優(yōu)勢[13-18]。

研究通過平板對峙法，從黑龍江省涼水自然保護區(qū)篩選出一株具有廣譜抑菌效果的拮抗菌株，經鑒定為多粘類芽孢桿菌。下一步對該菌株進行單因素實驗和正交試驗的發(fā)酵條件優(yōu)化，用以提高其抗菌能力，同時也為后續(xù)研究該抑菌物質的性質和結構、防病機理等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

拮抗菌株為X33，課題組在黑龍江省涼水自然保護區(qū)分離并保存。尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、楊樹葉片枯萎病菌（Alternaria tenuissima）、西紅柿鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、甜瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.Sp.melonis）等病原真菌均由實驗室保存。

實驗所用培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基、BPY 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基[19]。

1.2 實驗方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離、純化及拮抗細菌的篩選

1.2.1.1 細菌的分離純化與保存

取2 g 植物根際土壤加入10 mL 無菌水充分研磨，將研磨液按照10-2，10-3，10-4，10-5等4 個梯度進行稀釋，分別取100 μL 涂布于固體LB 平板，各濃度重復實驗3 次。根據顏色、形態(tài)、大小等特征，挑取單菌落純化保存。

1.2.1.2 拮抗細菌的篩選

選擇對峙培養(yǎng)法，將4 類病原菌（A.tenuissima、R.solani、F.oxysporum、F.oxysporum f.Sp.melonis） 的菌餅（直徑為7 mm）分別放到PDA 平板核心處，選擇良好純化的菌種點接于同平板相距3 cm 的4 個角上，接著于28 ℃溫度中進行1 周培養(yǎng)，再對抑菌帶寬進行測定。各處理皆安排3 個重復。將有效抑制病原菌生長，同時邊緣平齊，具備持久拮抗效應的菌株挑選出來。

1.2.1.3 形態(tài)學觀察

對篩選所得拮抗芽孢桿菌開展革蘭氏染色觀察與芽孢染色處理，借助光學顯微鏡與掃描電鏡，對菌體形態(tài)特征進行觀察。

1.2.1.4 生化鑒定

在生理生化測定環(huán)節(jié)，皆參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》與《常見細菌鑒定手冊》[20]所示方法。

1.2.1.5 PCR 鑒定

借助細菌DNA 提取試劑盒進行X33 基因組DNA 的提取。PCR 擴增環(huán)節(jié)所用引物為27F-Fan：5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′以及1492R：5′-CAG GAAACAGCTATGAC-3′，并完成0.05 mL 反應體系擴增16S rDNA 序列片段的制備。以下為0.05 mL PCR反應體系：5 μL 的buffer（10×），5 μL 的dNTP（2.5 mM），以及皆為2 μL 的27F-Fan、1492R、DNA 模板，還有33.6 μL 的雙蒸水、0.4 μL 的Taq DNA 聚合酶。以下為PCR 擴增條件：于95 ℃下停留0.5 min；于52 ℃下停留0.5 min；于72 ℃下停留1.5 min；于72 ℃下停留10 min，共計30 個循環(huán)。待對PCR 擴增產物完成切膠純化回收處理，同菌株16S rDNA 開展序列比對分析。

1.2.2 發(fā)酵上清液的制備

取出部分培養(yǎng)于LB 培養(yǎng)基內的種子液，接種至BPY 培養(yǎng)基內，接種量為1%。接著于37 ℃溫度下行2 d 培養(yǎng)（期間轉速為180 rpm），再實施25 min 的高速離心處理（溫度與轉速分別為4 ℃、15 000 r·min-1），之后將沉淀舍棄，借助濾膜（0.22 μm）過濾上清，得到發(fā)酵上清液[10]。

1.2.3 抑菌效價的測定

測定方法為菌絲生長速率法，具體為：把無菌的發(fā)酵上清液和熔融態(tài)PDA 培養(yǎng)基（溫度約為55 ℃）根據1∶10 的量充分混合，再移至平板上。打取直徑7 mm的植物病原菌菌餅倒置于平板中央[10]。在28 ℃條件下倒置培養(yǎng)7 d 后，通過十字交叉法測定菌落直徑，并計算抑菌率。每組3 次重復。

抑菌率（%）為“對照組菌落直徑”與“實驗組菌落直徑”的差值同“對照組菌落直徑”之比。

1.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.1 培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化

碳源的篩選：BPY 培養(yǎng)基所含葡萄糖分別用甘露醇（1%）、糊精、蔗糖、麥芽糖、乳糖與可溶性淀粉替代，其他成分不做調整[10]。向液體培養(yǎng)基內接種種子液，接種量為1%，之后于37 ℃溫度下，進行2 d 培養(yǎng)（期間轉速為180 rpm），再進行無菌上清液的提取。借助菌絲生長速率法測定抑菌率，各組處理皆安排3遍重復。

氮源的篩選：BPY 培養(yǎng)基內蛋白胨分別用1%的NaNO3、NH4H2PO4、NH4Cl 與（NH4）2SO4替代，其他條件參考碳源篩選部分，各組處理皆安排3 遍重復。

無機鹽的篩選：BPY 培養(yǎng)基所含NaCl 分別用LiCl、MgCl2、KCl 與CaCl2替代，其他條件參考碳源篩選部分，各組處理皆安排3 遍重復。

多因素正交試驗：將經單因素實驗確定最優(yōu)碳源、氮源與無機鹽當做變異因素，借助L9（34）正交表，開展培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗，評判指標為“抑菌率”，對各組分培養(yǎng)最優(yōu)配比加以明確。

1.3.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

將已優(yōu)化的培養(yǎng)基當做發(fā)酵培養(yǎng)基，考察指標為“抑菌率”，優(yōu)化X33 菌株各項發(fā)酵條件，包括接種量、裝液量、溫度、發(fā)酵時間、初始酸堿度等。接種量分別設置為裝液量的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%和8%；溫度等級包括25、28、31、34、37、40、43 ℃；在培養(yǎng)基初始酸堿度上，等級包括4、5、6、7、8 與9；發(fā)酵時間分別設置為12、24、36、48、60、72、84 和96 h；在250 mL 錐型瓶中，分別裝入25、50、75、100、125和150 mL 發(fā)酵培養(yǎng)液。每組處理重復三次，測定抑菌率。

1.4 色譜分析

對未優(yōu)化時與已優(yōu)化的發(fā)酵液成分開展色譜分析。此環(huán)節(jié)應用到反相色譜柱Agilent。在流動相方面，A、B 依次是H2O、乙腈，兩者皆內含0.5%的甲酸。梯度洗脫步驟：0~2 min 時，B 為5%，2~6 min 時，B上調到99%，6~10 min 時，B 為99%，10~10.1 min時，B 下調到5%，10.1~12 min 時，B 為5%；設定的柱溫、流速分別為30 ℃、0.6 mL·min-1，在線性洗脫方面，設定的測定波長、進樣量依次是214 nm、0.02 mL。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的篩選

通過反復分離純化，最終篩選得到了一株具有廣譜抑菌活性的X33 菌株，對楊樹葉枯病菌、立枯絲核菌、西紅柿鐮刀菌、甜瓜枯萎病菌等4 種病原真菌具有顯著的拮抗作用，呈現出明顯的抑菌圈（圖1）。相應的抑菌半徑分別為（12.2±0.8）mm、（11.5±0.3）mm、（11.2±0.4）mm、（11.8±1.4）mm。

圖1 對4 種病原真菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of four pathogenic fungi

2.1.1 菌落形態(tài)及鏡檢染色結果

對菌落大小與形態(tài)進行查看，借助光學顯微鏡查看X33 的個體形態(tài)、芽孢染色與革蘭氏染色結果。觀察結果如圖2 所示。鑒定結果表明：拮抗菌株X33在PDA 培養(yǎng)基上生長良好，菌落不透明，邊緣不規(guī)則，表面有褶皺，乳白色，隆起，有粘性。顯微鏡與掃描電鏡顯示菌體細胞呈桿狀，有莢膜與芽孢產生。革蘭氏反應顯示陽性。

圖2 形態(tài)學觀察結果Fig.2 Morphological observation

2.1.2 生理生化實驗結果

甲基紅實驗、厭氧生長實驗、碳源利用實驗、硫化氫實驗、檸檬酸鹽利用試驗、觸酶反應、淀粉水解及明膠液化實驗等皆顯示陽性。耐鹽性實驗中，當NaCl 濃度達到5%時不能生長，檸檬酸鹽實驗和動力培養(yǎng)基實驗為陰性（表1）。測量結果和常見的細菌系統(tǒng)鑒定手冊中的多粘類芽孢桿菌相符合。

表1 X33 菌株的生理生化鑒定Table 1 Physiological and biochemical identification of X33 strain

2.1.3 PCR 鑒定結果

使用試劑盒對X33 菌株的基因進行提取，電泳結果顯示條帶大小約為15 000 bp。X33 菌株用Eubac27F 和Eubac1492R 為引物進行PCR 擴增，電泳結果顯示在1 500 bp 處有特異性條帶。測序結果顯示X33 菌株16S rDNA 序列長度是1 547 bp，在NCBI 內借助BLAST 同一些已錄入菌株的16S rDNA基因序列開展相似性對比，發(fā)現對比多粘類芽孢桿菌，可達99%的相似度。

參考以上個體形態(tài)、革蘭氏染色結果、菌落形態(tài)表現、芽孢染色觀察結果，同時基于分子學鑒定與生理生化表現，可以確定篩選得到的拮抗菌株X33 為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。

2.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

對于X33 代謝抑菌活性的影響，不同碳源有著顯著區(qū)別。當碳源選擇甘露醇時，可實現最強的發(fā)酵濾液抑菌活性，達33%抑菌率；當碳源為麥芽糖時，發(fā)酵濾液顯示為最低抑菌活性。因此選用甘露醇作為碳源（圖3）。不同氮源的發(fā)酵濾液均有抑菌效果。以NH4Cl 為氮源時，發(fā)酵濾液抑菌活性最強，抑菌率可達28%；以NaNO3為氮源時，抑菌活性最差。故氮源選擇NH4Cl（圖4）。對于X33 抑菌活性的影響，不同無機鹽有所區(qū)別。NaCl 為無機鹽時，抑菌效果最好，抑菌率達到27%；MgCl2為無機鹽時，抑菌效果最差。因此選用NaCl 作為無機鹽（圖5）。

圖3 不同碳源對多粘類芽孢桿菌X33 菌株的發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on fermentation of X33 strain

圖4 不同氮源對多粘類芽孢桿菌X33 菌株發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on fermentation of X33 strain

圖5 不同無機鹽對多粘類芽孢桿菌X33 菌株的影響Fig.5 Effects of different inorganic salts on Bacillus polymyxa X33 strain

經由以上單因素實驗，對最佳碳源、氮源與無機鹽進行了明確。為了使配方更具優(yōu)化性，借助L9（34）正交表進行正交試驗的設計，考察指標為“發(fā)酵濾液的抑菌活性”，對培養(yǎng)基內各組分最優(yōu)配比加以明確。經極差分析發(fā)現，A＞B＞C，可見，在影響抑菌活性程度方面，甘露醇影響力最大，其次為NH4Cl，影響力最弱的為NaCl。處理組內，最優(yōu)水平組合是A2B1C2，具體為：H2O、NH4Cl、甘露醇、酵母粉、牛肉膏、NaCl依次為0.1 L、0.9、0.7、0.5、0.5、0.3 g。

然基于K 值確定的理論最優(yōu)水平組合則是A2B1C1，并未出現于正交試驗表內。依然應在此基礎上接著進行對比優(yōu)化，結果顯示，就抑菌率而言，相比組合A2B1C2，組合A2B1C1偏高。因此X33 菌株產抑菌物質的最佳培養(yǎng)基配方為甘露醇0.7 g、NH4Cl 0.9 g、NaCl 0.1 g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、H2O 100 mL。這時，對尖孢鐮刀菌可實現43.2%的抑菌率，并上調防治效果至88%。下表所示為正交試驗結果。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的正交設計L9（34）Table 2 Orthogonal design of fermentation medium components L9（34）

續(xù)表2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的正交設計L9（34）Continued table 2 Orthogonal design of fermentation medium components L9（34）

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基條件的優(yōu)化

2.2.2.1 接種量對發(fā)酵液抑菌活性的影響

當接種量小于6%時，其正向相關于X33 菌株發(fā)酵液的抑菌活性；若接種量為6%，可實現最強抑菌活性，達53.7%抑菌率。若接種量在6%以上，其負向相關于抑菌活性。原因可能為，接種量過高使得營養(yǎng)成分消耗過多，對其次級代謝物質的產生不利。故可確定6%是最佳接種量（圖6）。

圖6 接種量對多粘類芽孢桿菌X33 菌株的影響Fig.6 Effect of inoculum size on Bacillus polymyxa X33 strain

2.2.2.2 溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響

溫度條件在一定程度上影響發(fā)酵液的抑菌活性。當溫度處于25～43 ℃范圍時，X33 菌株皆可生長，同時在31 ℃培養(yǎng)溫度下，可實現最強發(fā)酵液抑菌活性，達53%抑菌率（圖7）。當溫度為25 ℃時，顯示為最低抑菌活性?？梢?，31 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。

圖7 溫度對多粘類芽孢桿菌X33 菌株的影響Fig.7 Effect of temperature on Bacillus polymyxa X33 strain

2.2.2.3 初始pH 值對發(fā)酵液抑菌活性的影響

X33 菌株在pH4~9 時均可生長，在酸性條件下，均保持了較好的抑菌活性。在酸堿度上調下，前期抑菌活性為升高表現，后期則為不斷降低。若酸堿度為8，可實現最高抑菌活性，達53%抑菌率（圖8）。

圖8 初始pH 值對多粘類芽孢桿菌X33 菌株的影響Fig.8 Effect of initial pH on Bacillus polymyxa X33 strain

2.2.2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌活性的影響

從12~72 h 的時間段內，隨著培養(yǎng)時間的增加，發(fā)酵液抑菌活性逐漸增強，并在第72 h 時達到峰值，抑菌率為51%（圖9）；此后，抑菌活性為不斷輕微降低表現，這可能是因為培養(yǎng)時間過長使得營養(yǎng)成分大量消化，對次級代謝產物的積累不利。

圖9 發(fā)酵時間對多粘類芽孢桿菌X33 菌株的影響Fig.9 Effect of fermentation time on Bacillus polymyxa X33 strain

2.2.2.5 裝液量對發(fā)酵液抑菌活性的影響

若250 mL 錐形瓶為100 mL 的裝液量，顯示為最強發(fā)酵液抑菌作用，能夠實現43.8%的抑菌率。若裝液量增加至150 mL，發(fā)酵液抑菌性減弱，可見，X33菌株產代謝產物需具備一定的通氣量條件。對裝液量做出最佳選擇，對菌株生長與發(fā)酵有利，此項研究明確的最適宜裝液量為250 mL 錐形瓶內100 mL 的裝液量（見圖10）。

圖10 裝液量對多粘類芽孢桿菌X33 菌株的影響Fig.10 Effect of liquid volume on Bacillus polymyxa X33 strain

2.3 色譜分析

繼續(xù)對優(yōu)化前后的發(fā)酵液成分進行液相分析。由圖11 知，在此梯度洗脫條件下，發(fā)酵產物得到了很好的分離，峰形對稱且尖銳。已經優(yōu)化的發(fā)酵液于第1 min 時、第2 min 時與第4.5 min 時，不管峰高抑或峰面積皆相比未優(yōu)化時偏大。可見，此3 類次級代謝產物經過優(yōu)化在積累量上有所升高，可能同抑菌活性增強存在直接關系。待至第7.5 min 時，已優(yōu)化的基線峰高繼續(xù)升高，然面積繼續(xù)減少。可見，優(yōu)化期間相關旁路代謝受到了抑制，顯著提升了某一具體成分的分泌和積累，從而提升了抑菌活性。

圖11 發(fā)酵液的色譜分析Fig.11 Chromatographic analysis of fermentation liquid

3 討論

現今，在全球研究生防微生物方面，芽孢桿菌已成為研究主流。經研究，Liang 等[21]發(fā)現，蠟狀芽孢桿菌可較強抑制葡萄孢菌，在抑制葡萄孢菌方面，其發(fā)酵液可實現75.8%的抑制率。樊陳等[22]對地衣芽孢桿菌LY12 進行了研究。并從其發(fā)酵液中分離得到了一種的抗菌肽，其顯示很好的抑菌效果，包括革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和真菌。

課題篩選得到了一株具有廣譜抑菌活性的多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa），并對其培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，抑菌率可超過50%。同時多粘類芽孢桿菌還具有促生作用，從而提高農作物的整體健康水平，增強其對病害致病菌的抵御能力，具有實際應用的潛力。液相色譜分析的結果也很好地佐證了抑菌能力的提升主要是因為4 類次級代謝產物的積累明顯增加。但是并未對這4 類物質進行進一步的分離純化，并未得知具體某一種或哪幾種物質共同起抑菌作用。為了更好地利用類芽孢桿菌防治植物病害，仍需要深入的了解生防芽孢桿菌的防病機理，研究其抑菌調控體系；改良類芽孢桿菌的功能基因，通過基因工程的手段對目的基因進行克隆表達，增強其抑菌活性；開展芽孢桿菌生防制劑的研究，使其具有良好的儲存行和實用性。在這些方面加以突破，使其更快應用于田間。

4 結論

研究篩選得到一株具有廣譜抑菌活性的多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。為了進一步探究其生防潛能，通過正交試驗獲得最適宜X33 菌株抑菌產物的發(fā)酵配方為甘露醇7 g·L-1，NH4Cl 9 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，牛肉膏5 g·L-1，酵母粉5 g·L-1。此時，在抑制尖孢鐮刀菌方面，可實現43.2%的抑菌率，與基礎培養(yǎng)基相比，在抑菌率方面上調了88%。在發(fā)酵方面，最佳條件為：接種量6%、培養(yǎng)時間3 d、初始酸堿度8、培養(yǎng)溫度31 ℃、裝液量100 mL·250 mL-1。當處于上述最優(yōu)條件時，能夠實現50.44%的抑菌率，使抑菌率上調了119.3%。