非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤突變負(fù)荷異質(zhì)性研究進(jìn)展

米熱阿依·阿布都熱孜克 陳鵬

隨著免疫治療時(shí)代的到來，免疫治療的生物標(biāo)志物正在逐步成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden, TMB），一種新興的免疫治療標(biāo)志物，被定義為腫瘤細(xì)胞基因組中某一特定區(qū)域中的體細(xì)胞突變總數(shù)，精確定義隨測序區(qū)域的大小以及突變性質(zhì)的不同而變化[1‐3]。理論上，腫瘤細(xì)胞中的的體細(xì)胞突變?cè)蕉啵琓MB值就會(huì)越高，形成新抗原的可能性也越大。但是并非細(xì)胞表面的所有新肽都具有免疫原性，因?yàn)轶w細(xì)胞突變后產(chǎn)生的肽鏈中只有一小部分會(huì)經(jīng)加工后加載到主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC）復(fù)合物上，其中只有部分能夠被T細(xì)胞識(shí)別，引起抗腫瘤免疫反應(yīng)[4,5]。第二代測序（next‐generation sequencing, NGS）對(duì)TMB的評(píng)估涉及全基因組測序（whole genome sequencing,WGS）、全外顯子測序（whole exome sequencing, WES）或者靶向基因面板。TMB在臨床實(shí)踐中更可能由基于不同面板的NGS評(píng)估[6,7]。目前已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)用于TMB檢測的面板包括FoundationOne面板和MSK‐IMPAKT面板[8,9]。WES覆蓋了編碼區(qū)大概2.2萬個(gè)基因（約18萬個(gè)外顯子，基因組大小為30 Mb），占整個(gè)基因組的1%[10]。由于WES成本較高、樣本需求量較大、數(shù)據(jù)分析較復(fù)雜，在臨床應(yīng)用中受限[11]。因此，采用聚焦于大量腫瘤相關(guān)基因的靶向測序面板進(jìn)行腫瘤基因組分析在臨床檢測中更加常見。與WES相比，靶向面板可以達(dá)到更深入的測序。也有越來越的研究[12,13]證明基于靶向面板的TMB（targeted panel sequencing‐based TMB, pTMB）與基于WES的TMB（WES sequencing‐based TMB, wTMB）高度相關(guān)。但是，不同面板之間TMB報(bào)告缺乏協(xié)調(diào)性，分析前因素也會(huì)對(duì)TMB的評(píng)估產(chǎn)生重大影響，例如樣本的收集和處理、樣本的質(zhì)量和純度、福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本（formalin‐fixed, paraffin‐embedded samples, FFPE）誘導(dǎo)的脫氨偽影以及DNA文庫的制備等[13‐15]，以上均不可避免的導(dǎo)致了TMB值的異質(zhì)性。為了篩選出真正能夠從免疫治療中獲益的人群，區(qū)分出可靠的TMB值，臨床醫(yī)生需要對(duì)導(dǎo)致TMB異質(zhì)性的因素有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

1 不同實(shí)驗(yàn)室及平臺(tái)間TMB的異質(zhì)性

NGS檢測TMB的精確度及特異度取決于腫瘤內(nèi)的突變頻率及所使用的面板能夠?qū)崿F(xiàn)的測序深度及覆蓋范圍。2019年歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會(huì)（European Society for Medical Oncology, ESMO）推薦精確評(píng)估TMB面板所需最小覆蓋深度為>200倍[16]。目前使用最廣泛的靶向面板包括含有468個(gè)目標(biāo)基因的MSK‐IMPACT面板（基因組大小為1.22 Mb）以及含有324個(gè)目標(biāo)基因的the Foundation Medicine面板（基因組大小為1.2 Mb）。Rizvi及其合作者的研究[17]發(fā)現(xiàn)，使用MSK‐IMPACT面板時(shí)，腫瘤樣本的平均測序覆蓋率達(dá)744倍，使用WES時(shí)，覆蓋率為232倍。由此可以得出，在腫瘤細(xì)胞純度較低或異質(zhì)性較高的樣品中，相比WES，進(jìn)行靶向面板可以實(shí)現(xiàn)更深入的測序以保持較高靈敏度[16]。Jan Budczies等[18]在2020年通過篩選已發(fā)表的包含NSCLC患者檢測結(jié)果在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室基于pTMB、建立誤差模型以及量化影響pTMB結(jié)果的各個(gè)混雜因素，提出與面板大小相關(guān)的隨機(jī)誤差是最重要的誤差來源，面板尺寸每增加一倍，隨機(jī)誤差將減少1.4倍，減半隨機(jī)誤差需要將面板大小增加4倍。11個(gè)具有不同NGS目標(biāo)基因面板和生物信息學(xué)方法的實(shí)驗(yàn)室參加了癌癥研究之友（Friends）TMB協(xié)調(diào)項(xiàng)目的第一階段，該項(xiàng)目初步分析了包含肺腺癌在內(nèi)的8種癌癥類型（8種癌癥的TMB值的動(dòng)態(tài)范圍均在40 mut/MB以內(nèi)），通過對(duì)這些癌癥進(jìn)行單獨(dú)評(píng)估，F(xiàn)irends提出在肺腺癌中，pTMB與wTMB無明顯差異[19]。2019年，Endris等[20]提出對(duì)于TMB遵循雙峰分布的腫瘤，小于1 Mbp的測序面板足以可靠地區(qū)分出TMB高與TMB低的人群，然而由于絕大多數(shù)NSCLC患者的TMB值呈連續(xù)分布，對(duì)于這種情況，需要較高分析能力的面板來更靠地區(qū)分TMB高和TMB低的人群。2019年，Buchhalte等[21]通過建立模擬面板，比較了0.5 MBP、1 MBP和1.5 MBP大小的面板對(duì)TMB檢測的敏感性和特異性。在此研究中，對(duì)于肺腺癌，用三種不同大小的面板檢測TMB的敏感性分別為0.78、0.82和0.85，特異性分別為0.89、0.93和0.94。

2 腫瘤異質(zhì)性對(duì)TMB影響

2017年，Jamal‐Hanjani等[22]對(duì)100例在全身治療前切除的早期NSCLC腫瘤進(jìn)行了327個(gè)區(qū)域全外顯子組測序，指出體細(xì)胞拷貝數(shù)改變和突變存在廣泛的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。因此，TMB也避免不了會(huì)受到腫瘤異質(zhì)性的影響。2018年，Jia等[23]通過對(duì)15例NSCLC患者的腫瘤組織的多個(gè)區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因突變的數(shù)量在同一患者的不同標(biāo)本上有很大的差異，提出腫瘤局部突變負(fù)荷不能有效地預(yù)測腫瘤的整體免疫激活狀態(tài)。在晚期NSCLC患者中，在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤之間也存在著不可忽視的突變異質(zhì)性[24]。Kazdal等[25]在2019年通過24例肺腺癌的多區(qū)域樣本和5例患者的匹配原發(fā)腫瘤、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的樣本分析TMB（使用TruSight Oncology 500 targeted sequencing panel）的空間異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)在30%的患者中TMB有明顯的瘤內(nèi)異質(zhì)性（最大差異可達(dá)14.13 mut/Mbp），淋巴結(jié)源性TMB評(píng)分顯著降低，原發(fā)腫瘤與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤之間存在TMB差異，但差異不顯著。2018年Gandara等[26]首次證實(shí)了從血液中測得的TMB（blood‐based tumor mutational burden, bTMB）是接受阿替唑單抗治療的NSCLC患者無進(jìn)展生存期（progression‐free survival, PFS）的預(yù)測性生物標(biāo)志物，并指出外周血中循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）中必須包含等位基因突變頻率≥1%時(shí)bTMB才有意義。2019年Wang等[27]提出基于NCC‐GP150（使用TCGA設(shè)計(jì)的，覆蓋150個(gè)腫瘤相關(guān)基因外顯子區(qū)域的靶向基因面板）的bTMB與基于組織活檢wTMB具有較好的相關(guān)性。TMB在不同腫瘤亞型中的表達(dá)水平各不相同，由于腫瘤異質(zhì)性，即使在同一腫瘤類型中，TMB的表達(dá)也存在顯著差異。也有研究表明，在NSCLC中，TMB與吸煙呈負(fù)相關(guān)，性別與TMB的無明顯相關(guān)性，伴隨驅(qū)動(dòng)突變（如EGFR、ALK和ROS1）的患者的TMB通常較低，而部分基因（如BRCA1、TP53和POLE）的突變會(huì)引起TMB顯著升高[22,28‐32]。

3 生物信息學(xué)管道對(duì)TMB值的影響

到目前為止，對(duì)于哪些突變應(yīng)該包括在TMB計(jì)算中還沒有達(dá)成共識(shí)[33]。2020年的一項(xiàng)回顧性研究表明，在計(jì)算過程中缺乏胚系突變的剔除的會(huì)導(dǎo)致TMB偏高[34]。2019年，Benayed指出有形成新抗原潛能的染色體重排可能無法被靶向基因面板檢測，從而導(dǎo)致PTMB偏低[35,36]。CheckMate 026臨床試驗(yàn)對(duì)312例接受一線Nivolumab治療或標(biāo)準(zhǔn)化療的NSCLC患者進(jìn)行了回顧性分析，結(jié)果表明，與僅包含錯(cuò)義突變的測序方式相比，包含同義突變、插入突變、移碼和無義突變的測序會(huì)引起TMB水平升高，尤其是與肺腺癌一樣與同義突變和錯(cuò)義突變有密切相關(guān)的腫瘤類型[37]。Buchhalter等[21]也建議在TMB的計(jì)算中包括所有的同義和錯(cuò)義突變，以提高計(jì)算的精確度。Foundation One CDx（一種基于定性的下一代測序的體外診斷試驗(yàn)）是通過人群數(shù)據(jù)庫過濾確定腫瘤細(xì)胞內(nèi)的體細(xì)胞突變，WES和MSK‐IMPACT是通過患者白細(xì)胞對(duì)照過濾腫瘤樣本中檢測到的遺傳性突變，以確保用于計(jì)算TMB的突變均為體細(xì)胞突變，F(xiàn)oundation One CDx則是通過SGZ（somatic‐germline‐zygosity）算法確定腫瘤細(xì)胞內(nèi)的體細(xì)胞突變[38]。目前公開的人群數(shù)據(jù)庫均以歐美人群為主，雖有人曾提出使用足夠全面的數(shù)據(jù)庫可以減輕種系有關(guān)的差異，有研究[39]提出在確定體細(xì)胞突變時(shí)，使用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行種系突變篩選（而不是配對(duì)正常樣本）會(huì)增加TMB與種族相關(guān)的異質(zhì)性。在臨床中，準(zhǔn)確報(bào)告分析管道的具體參數(shù)（例如，包括的突變類型、用于過濾及識(shí)別突變的數(shù)據(jù)庫），有助于對(duì)來自不同生物學(xué)分析管道的TMB數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)。2020年，德國病理學(xué)家協(xié)會(huì)（Quality in Pathology, QuIP）使用15個(gè)測試中心的6個(gè)面板，評(píng)估包含肺腺癌的三種腫瘤類型的20個(gè)樣本的TMB值，提出在面板的生物信息管道中添加附加的過濾器，可以進(jìn)一步改進(jìn)上述提到的種系突變所引起的差異[40]。2020年Yao等[41]建議依賴于頻繁更新的數(shù)據(jù)庫的過濾器，也會(huì)進(jìn)一步惡化計(jì)算的不一致性、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性。為了促進(jìn)pTMB的校準(zhǔn)及pTMB間的可比性，F(xiàn)riends建議，參考標(biāo)準(zhǔn)生成的校準(zhǔn)曲線可以應(yīng)用于面板的標(biāo)準(zhǔn)化和面板間的比較，Spearman比Pearson方法更適合于psTMB與WESTMB相關(guān)性的評(píng)估，線性回歸模型適用于從pTMB到wesTMB的轉(zhuǎn)換，TMB報(bào)告應(yīng)協(xié)調(diào)為：突變/megabase（mut/Mb）[19]。2020年，Yao等[41]為了解決TMB測量的分析中不一致性以及TMB分類缺乏確定的閾值描述了一種新的方法來解決這一問題：使用統(tǒng)計(jì)模型對(duì)TMB進(jìn)行估計(jì)和分類（Estimation and Classification of TMB, ecTMB），并使用貝葉斯框架（Bayesian framework）對(duì)TMB進(jìn)行預(yù)測以系統(tǒng)地糾正面板設(shè)計(jì)產(chǎn)生的偏差。作者提出，ecTMB比標(biāo)準(zhǔn)方法能更準(zhǔn)確地預(yù)測背景突變。與目前的計(jì)數(shù)方法相比，ecTMB的優(yōu)點(diǎn)還包括：①通過對(duì)面板設(shè)計(jì)偏差的系統(tǒng)修正，能夠提高TMB值的一致性；②ecTMB包含了同義突變；③esTMB不是基于單個(gè)計(jì)數(shù)值來預(yù)測TMB，而是通過將每個(gè)基因視為一個(gè)獨(dú)立的負(fù)二項(xiàng)過程來預(yù)測TMB。

4 DNA文庫濃度、取樣部位、樣本保存方式和樣本保存期對(duì)TMB值的影響

2020年，Valsamo Anagnostou通過對(duì)3,788個(gè)wTMB數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，提出當(dāng)樣本中的腫瘤純度低于50%時(shí)，TMB與腫瘤純度之間的具有較明顯的負(fù)相關(guān)性[42]。隨后由Tae Hong等[43]指出，對(duì)接受免疫治療的NSCLC患者，在腫瘤純度低于30%的樣本中，pTMB（本實(shí)驗(yàn)中使用的面吧包含381個(gè)目標(biāo)基因的靶向面板，基因組大小為1.07 mbMb）仍可以提供可靠的預(yù)測性能，但是全外顯子測序會(huì)嚴(yán)重低估TMB，由于該研究的生存分析主要基于PFS而不是總生存期（overall survival, OS），因此，還需要通過大規(guī)模前瞻性試驗(yàn)加以驗(yàn)證靶向面板在低純度樣本中的臨床價(jià)值。Quy等[44]對(duì)199例實(shí)體瘤患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析發(fā)現(xiàn)：①DNA文庫的濃度<5 nmol/L時(shí)，TMB評(píng)分顯著升高（P<0.01）；②當(dāng)DNA文庫濃度均<5 nmol/L時(shí)，TMB與樣本儲(chǔ)存期呈正相關(guān)（r=0.39, P<0.001, n=195），如果文庫DNA濃度≥5 nmol/L，TMB與樣本保存時(shí)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性消失；③FFPE樣本與高TMB得分顯著相關(guān)；④經(jīng)過放射治療部位樣本的TMB評(píng)分明顯高于非輻射野的樣本；⑤TMB與化療方案數(shù)量無相關(guān)性。理論上，在50倍的覆蓋率下，95%的SNV和具有15%或更高變異等位基因頻率的短插入或缺失突變可以被一致地檢測到[45]。然而，由于非腫瘤細(xì)胞的污染、腫瘤的異質(zhì)性和FFPE誘導(dǎo)的脫氨偽影的影響，在臨床中，我們需要進(jìn)行更深入的測序以保持較高靈敏度。

5 結(jié)語與展望

免疫治療是腫瘤治療的重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)，為腫瘤患者帶來了福音。然而，并非所有患者均能從中獲益，故亟需探索有效預(yù)測免疫治療效果的生物標(biāo)志物。盡管TMB已作為NSCLC患者接受免疫治療的預(yù)測性生物標(biāo)志物，但其仍存在許多局限性。如組織標(biāo)本的質(zhì)量和數(shù)量、腫瘤組織異質(zhì)性、不同的檢測平臺(tái)、相對(duì)較長的檢測時(shí)間、昂貴的價(jià)格等均限制了TMB的應(yīng)用[45]。用于TMB評(píng)估的分析前因素的協(xié)調(diào)和標(biāo)準(zhǔn)化、根據(jù)腫瘤類型選擇合適大小的靶向面板，對(duì)于TMB作為免疫治療療效的生物標(biāo)志物的可靠性至關(guān)重要。不同的測序方式及生物信息學(xué)算法對(duì)TMB的評(píng)估和報(bào)告也存在著較大的影響，由于它們?cè)诓煌幕蛎姘迤脚_(tái)上存在很大差異，因此，需要標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室的測序方式及生物信息學(xué)分析方法。TMB存在瘤內(nèi)異質(zhì)性，因此，單樣本的TMB評(píng)估在臨床工作中具有一定的局限性。雖液體活檢可能不容易受到與瘤內(nèi)異質(zhì)性的影響[44]，但bTMB預(yù)測OS的能力仍有待進(jìn)一步探索，需要更多的支持證據(jù)以提高bTMB臨床價(jià)值。由于部分驅(qū)動(dòng)基因的突變會(huì)影響腫瘤免疫原性和隨后免疫調(diào)節(jié)藥物的潛在療效，并且與TMB具有明顯相關(guān)性，因此在臨床中，這些驅(qū)動(dòng)基因與TMB一起評(píng)估是有必要的。目前對(duì)用預(yù)測免疫治療療效的閾值仍存在爭議。在未來，尚需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)TMB對(duì)于NSCLC患者精確治療的臨床價(jià)值。