殼聚糖/富含血小板血漿凝膠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究*

吳廣升 王亞男 馬叢叢 惠光艷

殼聚糖（chitosan，CS）是一種來源于蝦、蟹殼等 材料的天然大分子多糖，以CS為基礎(chǔ)制備的殼聚糖溫敏凝膠具有優(yōu)秀的生物學(xué)特性，如：生理中性、溫敏性、可注射性、可降解性、對大分子藥物的緩釋性等。將殼聚糖溫敏凝膠作為載體，負(fù)載細(xì)胞及藥物用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等方面的研究已經(jīng)取得了良好的效果［1-3］。富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）可以從血液中提取并含有多種生長因子，如，轉(zhuǎn)化生長因子-β、血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子-1等。PRP制備過程具有取材方便、低成本、微創(chuàng)等特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于骨組織再生、牙周組織再生、皮膚及粘膜損傷修復(fù)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用［4］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）可以從患者自身骨髓中提取，具有來源充足、增殖能力強(qiáng)、無免疫源性、易于接種成活等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程研究領(lǐng)域是應(yīng)用最廣泛的種子細(xì)胞［5，6］。

本實(shí)驗(yàn)將犬BMMSCs植入CS/PRP凝膠中并在體外培養(yǎng)7d，觀察BMMSCs在CS/PRP凝膠中成骨分化情況，為CS/PRP凝膠作為支架材料應(yīng)用于骨組織再生提供初步的研究依據(jù)。

1.材料和試劑

1.1 主要試劑與儀器CS（博益特生物公司，醫(yī)用級，脫乙酰度91%，青島），β-GP、維生素C、地塞米松、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、牛凝血酶（Sigma，美國），淋巴細(xì)胞分離液（索萊寶生物公司，北京），培養(yǎng)板（Corning，美國），茜素紅、油紅O染色液（雷根生物，北京），乙酸（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)），OCN一抗抗體（Abcam，美國）、OPN一抗抗體（Santa，美國）、二抗免疫組化試劑盒（中杉金橋生物，北京），磁力攪拌器（金壇榮華，江蘇），振蕩攪拌器（躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，上海），倒置顯微鏡（Olympas，日本），離心機(jī)（飛鴿，北京），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，德國）。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 犬BMMSCs原代培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn) 參考相關(guān)文獻(xiàn)［2］，將成年雄性雜種犬（青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供并通過青島大學(xué)動物倫理委員會審核）麻醉、常規(guī)消毒鋪巾后，采用髂后上棘穿刺法抽取骨髓5ml（含肝素100U/ml）。加等體積PBS稀釋后置于淋巴細(xì)胞分離液的液面，以1500rpm的速度離心20min，吸取中層云霧狀有核細(xì)胞層。PBS液洗兩次后以1.0×106/ml的密度置于37℃，5% CO2和飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)到第3d時首次換液，之后每隔2d換液一次，取第3代BMMSCs進(jìn)行成骨及成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。

2.2 CS溫敏凝膠的制備 參考相關(guān)文獻(xiàn)［7］，將0.2gCS加入8ml 0.1mol/l乙酸溶液中，磁力攪拌器上持續(xù)攪拌2h；0.56gβ-GP溶于2ml雙蒸水中后，兩種溶液冰浴15min，并將β-GP逐滴加入到CS溶液中，并持續(xù)攪拌10min。獲得CS質(zhì)量濃度為2%，β-GP質(zhì)量濃度為5.6%的CS/β-GP溶液。最后將CS/β-GP溶液置于37℃恒溫孵箱內(nèi)10min，觀察凝膠形成情況。

2.3 PRP的制備 參考相關(guān)文獻(xiàn)［8］靜脈抽取犬全血9ml放入含有1ml3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑的15ml離心管內(nèi)，輕柔的上下翻轉(zhuǎn)離心管，使血液與抗凝劑充分混勻。采用2步法離心，常溫下1500轉(zhuǎn)/分離心10min，將紅細(xì)胞與血漿分離，再3000rpm的速度離心10min，使富血小板血漿與乏血小板血漿分開，獲得約1ml的PRP。

2.4 CS/PRP凝膠制備 如文獻(xiàn)所述方法［8］，將PRP按體積比1∶1的比例逐滴加入CS/β-GP溶液中，先用牙周探針充分?jǐn)噭駽S/β-GP與PRP的共混液，再加入適量的1000U/ml牛凝血酶（含0.1g/ml CaCl2），然后在振蕩攪拌器震蕩2min，進(jìn)一步混勻，獲得CS/β-GP與PRP體積比為1∶1的CS/PRP共混液。最后將CS/PRP共混液置于37℃恒溫孵箱內(nèi)10min，觀察凝膠形成情況。

2.5 CS凝膠及CS/PRP凝膠負(fù)載BMMSCs體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 將適量BMMSCs離心棄上清后分別滴加入CS/β-GP溶液及CS/PRP溶液，震蕩混勻（BMMSCs濃度為1×106/ml），分別滴加入24孔板中（每孔0.6ml），置于37℃恒溫孵箱內(nèi)10min形成凝膠后，再分每孔加入1ml DMEM培養(yǎng)液，隔天換液。

2.6 HE染色及免疫組化分析 負(fù)載了BMMSCs的CS凝膠及CS/PRP凝膠體外培養(yǎng)7d后，先使用PBS液沖洗3遍，再用多聚甲醛侵泡24h固定，最后用石蠟包埋標(biāo)本、切片，分別進(jìn)行HE染色及免疫組化觀察。組織切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、酒精梯度脫水、高壓抗原修護(hù)后滴加一抗4℃過夜，二抗免疫組化試劑盒進(jìn)行染色。光鏡下觀察BMMSCs在CS凝膠組及CS/PRP凝膠組中OPN和OCN的表達(dá)情況。將樣本置于400倍光鏡下，隨機(jī)選擇5個高倍視野進(jìn)行觀察并拍照，通過Image J2x圖像分析軟件對每個的樣本的灰度值進(jìn)行計算分析。Image J軟件灰度值計算的原理是：陽性結(jié)果越強(qiáng)，棕褐色染色越深，白光的穿透效率越低，得到的灰度值越小，默認(rèn)灰度值范圍為0～255［1］。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±S）形式表示，通過SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用one-way ANOVA方法進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.結(jié)果

3.1 BMMSCs形態(tài)學(xué)觀察原代接種2d后，BMMCSs貼附于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，形態(tài)呈多邊型、星型、三角形，并伴有散在分布的小細(xì)胞克隆。經(jīng)過7～10d的培養(yǎng)，BMMCSs鋪滿80%的瓶底面積時，可以進(jìn)行傳代。第3代BMMCSs呈三角形及長梭形形態(tài)，并且輪廓清晰、伸展充分。

3.2 多向分化誘導(dǎo)結(jié)果 經(jīng)過成骨誘導(dǎo)21d后，BMMCSs茜素紅染色陽性，大量圓形或橢圓形的紅色礦化結(jié)節(jié)位于呈鋪路石樣緊密排列的BMMCSs表面上（圖1A）。油紅O染色顯示：BMMCSs在體外成脂誘導(dǎo)14d后，小氣泡樣的圓形紅色脂滴呈弧形排列在BMMCSs內(nèi)（圖1B）。

3.3 CS/β-GP溶液成膠過程及性狀CS/β-GP溶液在室溫下為透明且流動性好的液體，pH值為6.8～7.0。置于37℃恒溫水浴箱，8～10min后可見CS/β-GP溶液已凝膠化，呈白色或淡黃色。

3.4 BMMCSs在CS凝膠及CS/PRP凝膠中生長情況 如圖2所示，體外培養(yǎng)7d后，BMMCSs在CS凝膠及CS/PRP凝膠中均可以存活，細(xì)胞核呈藍(lán)色橢圓形。

3.5 BMMCSs在CS凝膠及CS/PRP凝膠中OCN及OPN表達(dá)情況 如圖3所示，CS/PRP凝膠組中，OCN在BMMCSs胞漿中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，黃褐色（圖3A)。OPN在BMMCSs胞漿中呈陽性表達(dá)，黃色（圖3C)。CS凝膠組中，OCN和OPN在BMMCSs胞漿中均呈弱陽性表達(dá)（圖3B，3D)。圖4為OCN及OPN在CS凝膠及CS/PRP凝膠中表達(dá)水平半定量分析結(jié)果。在OCN灰度值分析中，CS/PRP組顯著小于CS組（P＜0.01)。在OPN灰度值分析中，CS/PRP組也顯著小于CS組（P＜0.05）。說明CS/PRP組中，OPN和OCN的表達(dá)水平均高于CS組。

圖1 BMMCSs多向分化潛能鑒定（A，茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色，×100；B，油紅O脂滴染色， ×400）

圖2 BMMCSs在體外培養(yǎng)7d后HE染色（A，BMMCSs在CS凝膠中生長情況， ×100；B，BMMCSs在CS/PRP凝膠生長情況，×100），示BMMCSs，示PRP。

圖3 BMMCSs在CS凝膠及CS/PRP凝膠中OCN及OPN表達(dá)情況（×400）

圖4 通過灰度值半定量分析OCN及OPN在CS凝膠及CS/PRP凝膠中表達(dá)水平（*P＜0.05，**P＜0.01)

4.討論

PRP是一種取材方便、微創(chuàng)、成本低廉并能提供大量自體生長因子的血液制品。PRP中的血小板通過脫顆粒作用被激活后，可以釋放多種生長因子，其含量是全血中的3-5倍，可以促進(jìn)組織修復(fù)再生。將PRP復(fù)合入合適的支架中，通過釋放生長因子在可以促進(jìn)骨細(xì)胞的趨化、分化、增殖，可以調(diào)節(jié)骨的重建與重塑［4］。有文獻(xiàn)報道［9］PRP中血小板的激活方式對各類生長因子持續(xù)釋放的時間及累計釋放的量有重要影響。PRP中生長因子可持續(xù)釋放8-10d，即在血小板的整個生命周期中均有生長因子釋放，并且PRP可以維持這些生長因子的正常生理比例。本課題組前期研究結(jié)果中證實(shí)，CS與PRP共混后，可以通過控釋PRP中生長因子的釋放促進(jìn)BMMSCs增殖及堿性磷酸酶的分泌達(dá)7天之久［10］。

許多文獻(xiàn)指出CS具有良好的生物相容性，可以作為生長因子、細(xì)胞、基因、納米粒等載體并維持其活性［11-13］。Ma等［14］將巨噬細(xì)胞與siRNA同時加入CS水凝膠中體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CS水凝膠可保持細(xì)胞較高的活力（＞88%），并且對RANK基因沉默效果可長達(dá)9d。本課題組前期通過掃描電鏡觀察凍干后的CS/PRP凝膠呈多孔的海綿狀結(jié)構(gòu)，CS/PRP比率為1∶1時孔徑為100～200μm［7］。本實(shí)驗(yàn)中，如圖2所示，BMMSCs可以在CS及CS/PRP凝膠中呈圓形，存活良好，由于CS與BMMSCs的胞漿均嗜伊紅被染成紅色而不易區(qū)分，這可能和BMMSCs在CS凝膠中呈球形生長有關(guān)。Huang等［15］從人脂肪和胎盤中分離得到的MSCs，分別在殼聚糖膜和透明質(zhì)酸修飾的殼聚糖膜上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這兩種MSCs均呈三維球體附著在CS膜上生長，并且維持MSCs干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)。李華杰等［16］發(fā)現(xiàn)臍帶組織來源的MSCs在CS膜上成球生長，與規(guī)貼壁培養(yǎng)相比，CS膜培養(yǎng)可顯著促進(jìn)MSCs的遷移趨化特性及遷徙相關(guān)基因表達(dá)水平。本課題在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中通過掃描電鏡觀察，也發(fā)現(xiàn)BMMSCs在殼聚糖凝膠內(nèi)具有呈球形生長的特性，說明CS不僅具有良好的生物形容性，還可以為BMMSCs提供一個呈球形生長并維持干細(xì)胞特性的環(huán)境。

OCN是由成骨細(xì)胞合成、分泌到骨基質(zhì)中的非膠原蛋白，是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志［17］。OPN是由成骨細(xì)胞分泌一種糖基化的磷蛋白，通過調(diào)節(jié)羥磷灰石晶體的生長可以調(diào)節(jié)骨的礦化功能和速度，是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志［18］。本研究中，BMMSCs在CS/PRP凝膠中培養(yǎng)7d后，OCN呈強(qiáng)陽性表達(dá)（圖3A)，OPN陽性表達(dá)（圖3C)，說明CS/PRP凝膠可以為BMMSCs提供一個成骨誘導(dǎo)分化的環(huán)境。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果［2］也表明CS/PRP凝膠負(fù)載BMMSCs注射入犬的牙周缺損模型中可以取得更佳的骨再生效果，可能與CS/PRP凝膠可以緩釋PRP中的多種生長因子，持續(xù)地促進(jìn)BMMSCs增殖和成骨分化有關(guān)。農(nóng)桔安等［19］以明膠海綿負(fù)載MSCs和PRP植入羊椎間盤纖維環(huán)缺損，通過馬松三色、免疫組化的方法證實(shí)取得了良好的纖維環(huán)修復(fù)效果。Liao等［20］以含有PRP和雙相磷酸鈣的可注射熱凝水凝膠作為支架，負(fù)載脂肪干細(xì)胞修復(fù)兔顱骨缺損，通過一系列體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)此凝膠體系在體外可以促進(jìn)ALP、OCN等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不僅促進(jìn)兔顱骨缺損的再生，通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新骨中高表達(dá)OCN。

綜上所述，盡管以多種凝膠支架材料復(fù)合PRP可以到達(dá)促進(jìn)軟骨、骨等組織再生的效果，但為了更好地讓PRP應(yīng)用于臨床，仍需進(jìn)行大量的臨床前研究以及臨床驗(yàn)證探索。