1株桑葉內(nèi)生生防多黏類(lèi)芽孢桿菌可濕性粉劑的制備及應(yīng)用效果

王娜 王彪 蔡灝漾 戚昱琦 陳愛(ài)明 唐子恒 古扎來(lái)?達(dá)吾坎爾

摘要：以篩選自健康桑樹(shù)葉片的1株多黏類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）為研究對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)結(jié)合生物相容性確定可濕性粉劑的最佳配方，探討可濕性粉劑的促生效應(yīng)和安全毒理性，在此基礎(chǔ)上探索菌株促生和拮抗機(jī)制。結(jié)果表明，可濕性粉劑的最佳配方為發(fā)酵液70%、載體硅藻土10%、分散劑聚乙烯醇5%、濕潤(rùn)劑十二烷基苯磺酸鈉10%、穩(wěn)定劑磷酸鉀2.5%、保護(hù)劑糊精2.5%。可濕性粉劑主要性能檢測(cè)結(jié)果顯示，菌含量約為7.0×108 CFU/g，懸浮率為92.99%，濕潤(rùn)時(shí)間為20 s，細(xì)度為96.2%，pH值為 6.8，含水量為1.81%?？蓾裥苑蹌岱€(wěn)定性較好，耐受弱酸弱堿環(huán)境。平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，可濕性粉劑對(duì)桑青枯病病原菌5號(hào)小種和灰霉菌仍有較高的拮抗性能，灌根處理對(duì)番茄幼苗有明顯促生效果。浸根和莖穿刺處理對(duì)番茄幼苗無(wú)害;經(jīng)口灌胃試驗(yàn)小鼠表明可濕性粉劑低毒性，對(duì)雄性個(gè)體影響較小，對(duì)雌性個(gè)體的傷害較大。培養(yǎng)基定性分析結(jié)果顯示菌株可產(chǎn)生鐵載體，能產(chǎn)生有機(jī)酸、胞外纖維素酶和蛋白酶，從而直接或間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)和抑制病原菌的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生菌;多黏類(lèi)芽孢桿菌;可濕性粉劑;促生;毒性;抑菌活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S482.2+92? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）23-0115-10

收稿日期：2021-04-09

基金項(xiàng)目：江蘇科技大學(xué)博士啟動(dòng)基金（編號(hào)：1102931901）。

作者簡(jiǎn)介：王 娜（1976—），女，山東煙臺(tái)人，博士，副教授，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：biojustwn@126.com。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受多方面制約，植物病害是其中主要因素之一。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，化學(xué)藥劑是防治植物病害的主要手段，雖然防治效果顯著，但是由于長(zhǎng)期不合理使用，病原菌抗藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染嚴(yán)重、生物多樣性破壞以及高毒高殘留等[1-4]負(fù)面問(wèn)題層出不窮。隨著人們環(huán)保意識(shí)以及農(nóng)產(chǎn)品安全意識(shí)的不斷增強(qiáng)，生物防治受到了國(guó)內(nèi)外植物保護(hù)工作者的重視，其中對(duì)環(huán)境友好的微生物農(nóng)藥受到人們青睞[5]。

生防細(xì)菌作為微生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)源之一，同其他生防微生物相比具有存在廣泛、群體龐大、繁殖迅速、代謝活動(dòng)復(fù)雜、對(duì)病原菌作用方式多樣等特點(diǎn)，成為開(kāi)發(fā)熱點(diǎn)。目前研究者已從不同來(lái)源分離并鑒定出多種具有抗植物病原菌活性的生防細(xì)菌，其中以芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）生防細(xì)菌研究應(yīng)用最多[6-9]。生防細(xì)菌來(lái)源廣泛[10]，但植物內(nèi)生細(xì)菌因與植物互利共生、抗逆性強(qiáng)、危害小、定殖快等優(yōu)點(diǎn)，成為微生物農(nóng)藥研究的主要對(duì)象[11-12]。

目前，利用植物內(nèi)生菌作為微生物農(nóng)藥防治植物病害還存在一定問(wèn)題。植物內(nèi)生菌本身是一個(gè)生物活體，運(yùn)輸和保存對(duì)藥效保持有重要影響。用于生物防治時(shí)，田間環(huán)境（土壤、植株表面及根際分泌物等）和植物體微生態(tài)環(huán)境中許多因子都會(huì)影響內(nèi)生菌的生長(zhǎng)和防病作用的發(fā)揮，從而造成內(nèi)生菌的防治效果不穩(wěn)定。同時(shí)內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)研究尚不成熟，難以得到較為純凈的有效成分，進(jìn)而也影響了內(nèi)生菌的實(shí)際應(yīng)用。劑型的制備有利于生防菌的保護(hù)、稀釋和緩釋有效成分，擴(kuò)大微生物農(nóng)藥的使用范圍?？蓾裥苑蹌╓P）是以包括生防菌在內(nèi)的發(fā)酵液作為劑型化研究對(duì)象，既包含生防菌菌體又包含其產(chǎn)生的對(duì)植物病害有抑制作用的物質(zhì)，制劑的防效作用更大。同時(shí)成本低、活性穩(wěn)定，便于生產(chǎn)和商品化，是微生物農(nóng)藥的主要?jiǎng)┬蚚13]。

多黏類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是芽孢桿菌科（Bacillaceae）類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在自然界中分布廣泛[14]。多黏類(lèi)芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種性能穩(wěn)定的抗菌抑菌物質(zhì)，可以防治多種由卵菌、真菌、細(xì)菌和線蟲(chóng)等引起的植物病害;同時(shí)還可以作為植物根際促生菌，通過(guò)產(chǎn)生激素、鐵載體、溶磷性等直接或間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)[15-18]。多黏類(lèi)芽孢桿菌是被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）列為可商業(yè)應(yīng)用的微生物種類(lèi)之一，可用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和水處理等方面[19];2006年也被我國(guó)農(nóng)業(yè)部列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種，是一種重要的病害生物防治微生物。

筆者所在課題組在前期工作中從健康桑樹(shù)葉片中分離篩選出1株多黏類(lèi)芽孢桿菌，對(duì)多種植物病原細(xì)菌和病原真菌具有廣譜抗性，根際澆灌植物，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在生物防治方面具有一定的潛能[20]。本研究以此菌株發(fā)酵液為原藥，研究不同載體、濕潤(rùn)劑、分散劑和保護(hù)劑等助劑與菌細(xì)胞的生物相容性，通過(guò)正交試驗(yàn)篩選可濕性粉劑的優(yōu)良配方，并測(cè)定該制劑對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響以及應(yīng)用安全性和毒理性，并初步探究該菌株的促生長(zhǎng)和拮抗特性，為此多黏類(lèi)芽孢桿菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019—2020年在江蘇省鎮(zhèn)江市四擺渡江蘇科技大學(xué)西校區(qū)植物生物技術(shù)試驗(yàn)室開(kāi)展。

1.2 供試菌株

供試內(nèi)生菌株381分離自健康桑樹(shù)（Morus alba L.）葉片，桑葉于2018年4月采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所國(guó)家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹(shù)圃（桑樹(shù)品種為9703）。生防細(xì)菌對(duì)多種病原細(xì)菌和病原真菌有較強(qiáng)拮抗作用。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征以及16S rRNA序列分析鑒定其為多黏類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）[20]，現(xiàn)保存在江蘇科技大學(xué)植物生物技術(shù)試驗(yàn)室。

供試病原細(xì)菌為桑青枯菌5號(hào)小種（Ralstonia solanacearum race 5），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所桑病研究室提供。供試病原真菌為灰霉菌（Botrytis cinerea），由江蘇科技大學(xué)植物生物技術(shù)試驗(yàn)室提供。

1.3 可濕性粉劑的制備

1.3.1 菌株粉劑制備液制備

用接種環(huán)將菌株接種于LB（lysogeny broth）液體培養(yǎng)基中（50 mL/150 mL），37? ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，即得種子液。將種子液以體積分?jǐn)?shù)3%接種量接入裝液量為125 mL/250 mL的LB液體培養(yǎng)基中，32 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng) 20 h，即得粉劑制備液。經(jīng)測(cè)定制備液中菌含量為2.0×108～7.0×108 CFU/mL，芽孢率≥90%。

1.3.2 載體與助劑的初步篩選

分別將載體（滑石粉、高嶺土、硅藻土、輕質(zhì)碳酸鈣）按照質(zhì)量濃度為5%的比例，分散劑[木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、聚乙烯醇（PVA）]按1.5 mg/mL的比例，濕潤(rùn)劑[十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、皂莢粉]按照0.25 mg/mL的比例，穩(wěn)定劑[碳酸鈣（CaCO3）、磷酸鉀（K3PO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）]按照1.0 mg/mL的比例添加進(jìn)LB培養(yǎng)基內(nèi)，高壓蒸汽滅菌后，制成平板。吸取1 mL粉劑制備液稀釋105倍，分別取0.1 mL稀釋液涂布在含有不同載體、分散劑、濕潤(rùn)劑和穩(wěn)定劑的LB培養(yǎng)基平板上，以LB培養(yǎng)基作對(duì)照，每組3次重復(fù)。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h，記錄各平板菌落數(shù)量，初步篩選出優(yōu)勢(shì)載體和助劑[21]。

1.3.3 可濕性粉劑的母粉制備

將生防菌粉劑制備液與初步篩選出的優(yōu)勢(shì)載體、分散劑、濕潤(rùn)劑和穩(wěn)定劑按照制備液70%、載體15%、分散劑5%、濕潤(rùn)劑5%和穩(wěn)定劑5%的比例混合攪勻，真空冷凍干燥24 h。干燥后的粉劑研磨成粉，制成可濕性粉劑母粉，用于復(fù)篩分散劑和濕潤(rùn)劑。

1.3.4 分散劑與濕潤(rùn)劑的復(fù)篩

在母粉制作中，制備液、載體、濕潤(rùn)劑和穩(wěn)定劑種類(lèi)及比例不變，分別將3種分散劑按照5%比例添加進(jìn)母粉中，以不添加分散劑為對(duì)照，綜合懸浮率、潤(rùn)濕力和生物相容性考慮，選擇效果最佳分散劑。

在母粉制作中，制備液、載體和穩(wěn)定劑種類(lèi)及比例不變，按5%比例添加上述篩選的最佳分散劑，分別將3種濕潤(rùn)劑按照5%比例添加進(jìn)母粉中，以不添加濕潤(rùn)劑為對(duì)照，綜合懸浮率、潤(rùn)濕力和生物相容性考慮，選擇效果最佳的濕潤(rùn)劑。

1.3.5 正交設(shè)計(jì)

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了使可濕性粉劑的濕潤(rùn)時(shí)間和懸浮率達(dá)到最優(yōu)，利用正交試驗(yàn)法（表1），以懸浮率和濕潤(rùn)時(shí)間為考察因素，對(duì)篩選出的載體和助劑進(jìn)行考察，以確定最佳添加比例。

1.3.6 紫外保護(hù)劑的篩選

將4種紫外保護(hù)劑抗壞血酸、熒光素鈉、糊精和黃原膠按與穩(wěn)定劑添加量相同的比例添加到已確定的最佳配比中，制成可濕性粉劑。將可濕性粉劑和無(wú)菌蒸餾水按照1 g ∶9 mL的比例混合均勻，置于距離紫外燈（254 nm，20 W）40 cm處照射12、24 h。將粉劑液用無(wú)菌蒸餾水稀釋104倍，取0.1 mL涂布在LB平板上，37 ℃ 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h，計(jì)算存活率。以不加保護(hù)劑作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 可濕性粉劑指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 粉劑懸浮率、濕潤(rùn)時(shí)間、細(xì)度和pH值

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14825—2006[22]、GB/T5451—2001[23]、GB/T16150—1995[24]、GB/T1601—1993[25]分別對(duì)粉劑的懸浮率、濕潤(rùn)時(shí)間、細(xì)度、pH值進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 粉劑含水量

稱(chēng)取 10 g 樣品放在已準(zhǔn)確稱(chēng)量的培養(yǎng)皿（m1）中，105 ℃烘箱中持續(xù)烘干至恒質(zhì)量（m2）。含水率=（m1+10-m2）/10×100%。

1.4.3 粉劑穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性：1 g粉劑用500 mL無(wú)菌蒸餾水稀釋?zhuān)骄殖?份，分別置于25、30、50、75、100 ℃溫度下水浴20 min，冷卻至室溫。各取 0.1 mL 稀釋液均勻涂布在LB平板上，每組重復(fù)3次。將平板放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，記錄平板菌落數(shù)。

酸堿穩(wěn)定性：1 g粉劑用500 mL蒸餾水稀釋制成稀釋液。取稀釋液8份，每份50 mL，分別用 0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)至pH值為 4、5、6、7、8、9、10、11。各取0.1 mL稀釋液均勻涂布在LB平板上，每組重復(fù)3次。將平板放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，記錄平板菌落數(shù)[26]。

1.5 可濕性粉劑安全性和毒理性試驗(yàn)

1 g粉劑用500 mL蒸餾水稀釋制成稀釋液。取在盆缽中培育30 d且生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄幼苗20株（1株/盆），分為4組，每組5株。對(duì)2組試驗(yàn)組幼苗進(jìn)行浸根和針穿刺莖處理。浸根處理時(shí)將幼苗小心拔起，流水清洗去掉浮土，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗多次。將幼苗根完全浸泡在粉劑稀釋液中 30 min，以無(wú)菌水處理作對(duì)照，處理后重新移栽在滅菌營(yíng)養(yǎng)土中，常規(guī)培養(yǎng)14 d后觀察生長(zhǎng)情況。針穿刺莖處理時(shí)在幼苗莖高度一半的位置用滅菌刀片劃5 mm的小口并用移液槍吸取40 μL粉劑稀釋液接種，以無(wú)菌水作對(duì)照。常規(guī)培養(yǎng)14 d后觀察生長(zhǎng)情況。

依據(jù)文獻(xiàn)[27]，以小鼠為材料，運(yùn)用霍恩氏法將小白鼠分為劑量組1（0.316 mg/20 g）、劑量組2（1.000 mg/20 g）、劑量組3（3.160 mg/20 g）、劑量組4（10.000 mg/20 g）、空白對(duì)照組（0 mg/20 g）以測(cè)定半數(shù)致死量（LD50）。每組10只，雌雄各半（5雄5雌），灌胃前隔夜禁食但不禁水，稱(chēng)質(zhì)量后1次灌胃給藥，灌胃后至少間隔3 h進(jìn)食。4組分別按劑量組用量 2 mL 無(wú)菌水稀釋后經(jīng)口灌胃。以14 d（每天固定時(shí)間灌胃1次）為1個(gè)周期測(cè)試粉劑急性經(jīng)口毒性，并分析小鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù)變化，確定粉劑毒理性。

1.6 可濕性粉劑對(duì)病原菌的抑制效果

取直徑為6 mm的病原菌菌塊接種在KB培養(yǎng)基（病原細(xì)菌）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（病原真菌）平板中央，兩側(cè)適當(dāng)距離處各放一無(wú)菌濾紙片（直徑6 mm）。0.1 g粉劑用50 mL無(wú)菌蒸餾水稀釋?zhuān)?0 μL粉劑稀釋液滴加在濾紙片上，37 ℃ 靜置培養(yǎng)24 h，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.7 可濕性粉劑促生效果試驗(yàn)

取生長(zhǎng)良好、生長(zhǎng)勢(shì)一致的15 d盆栽番茄幼苗（1棵/盆），試驗(yàn)組每2 d澆灌1次粉劑稀釋液，每次50 mL，以澆灌蒸餾水為對(duì)照。每組重復(fù)10次，培養(yǎng)30 d，觀察番茄幼苗生長(zhǎng)效果[28]。

1.8 菌株的促生長(zhǎng)和拮抗特性分析

1.8.1 促生長(zhǎng)特性分析

溶磷性分析：將菌株點(diǎn)接在NBRIP培養(yǎng)基[葡萄糖10.00 g，MgCl2·6H2O 5.00 g，Ca3（PO4）2 5.00 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.20 g，（NH4）2SO4 0.10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0]平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)4 d，觀察是否有無(wú)色透明圈[29]。

產(chǎn)鐵載體分析：將菌株點(diǎn)接在CAS培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)4 d，觀察是否有黃色光圈[30]。

產(chǎn)吲哚-3-乙酸（IAA）分析：將菌株接種于濃度為100 mg/L色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。取100 μL菌懸液滴于白色瓷板上，同時(shí)加入等量的Salkowski顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)。同時(shí)以加入100 μL IAA（50 mg/L）的標(biāo)準(zhǔn)溶液為陽(yáng)性對(duì)照。室溫避光條件下30 min后，若顏色變紅則表示有IAA產(chǎn)生[31]。

1.8.2 拮抗特性

產(chǎn)有機(jī)酸分析：將菌株點(diǎn)接在產(chǎn)有機(jī)酸分析培養(yǎng)基（葡萄糖6.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白胨1.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCO3 1.0 g，溴甲酚紫微量，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.2～7.4）平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察是否有黃色的光圈[32]。

產(chǎn)纖維素酶分析：配制產(chǎn)纖維素酶分析培養(yǎng)基（葡萄糖1.0 g，酵母浸膏0.1 g，蛋白胨0.5 g，瓊脂15.0 g，羧甲基纖維素鈉5.0 g，蒸餾水1 000 mL），將菌株點(diǎn)接在平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)皿中加入0.2 %剛果紅染液，40 min后倒掉染色液，再加入1 mol/L NaCl脫色15 min，觀察是否有黃色降解圈[33]。

產(chǎn)蛋白酶分析：配制產(chǎn)蛋白酶分析培養(yǎng)基（葡萄糖1.0 g，酵母浸膏0.1 g，蛋白胨0.5 g，瓊脂 15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為6.0。高壓滅菌后再加入50 mL滅菌的8%明膠溶液），將菌株點(diǎn)接在平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)皿中加入飽和硫酸銨溶液浸沒(méi)菌落，30 min后倒掉溶液，觀察是否有無(wú)色透明圈[33]。

產(chǎn)幾丁質(zhì)酶分析：將菌株點(diǎn)接在產(chǎn)幾丁質(zhì)酶分析培養(yǎng)基（膠體幾丁質(zhì)5.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母浸膏2.5 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.4）平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察是否有無(wú)色透明圈[34]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)和制圖，采用SPSS軟件Duncans多重分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體及助劑的初篩

以粉劑活菌量為檢測(cè)指標(biāo)，從生物相容性的角度來(lái)分析，高嶺土、滑石粉和輕質(zhì)碳酸鈣3種載體顯著抑制生防菌的生長(zhǎng)，而硅藻土與對(duì)照組差異不顯著（圖1-A）;SDS、SDBS和皂莢粉3種濕潤(rùn)劑中，SDS對(duì)生防菌生長(zhǎng)影響最大，SDBS的影響次之，而皂莢粉對(duì)菌生長(zhǎng)基本無(wú)影響（圖1-B）;木質(zhì)素磺酸鈉和PVA對(duì)生防菌生長(zhǎng)有一定的影響，但CMC-Na與對(duì)照組相比差異不顯著（圖1-C）;碳酸鈣、磷酸鉀、磷酸二氫鉀、CMC-Na 4種穩(wěn)定劑中，磷酸鉀對(duì)生防菌的活性影響很小，與對(duì)照組差異不顯著（圖1-D）。初步確定選擇硅藻土、皂莢粉、CMC-Na和磷酸鉀制備可濕性粉劑的母粉。

2.2 助劑中分散劑和濕潤(rùn)劑的復(fù)篩

濕潤(rùn)時(shí)間和懸浮率是評(píng)價(jià)可濕性粉劑的2個(gè)重要指標(biāo)，國(guó)標(biāo)要求可濕性粉劑懸浮率≥70%，濕潤(rùn)時(shí)間≤120 s，因此對(duì)濕潤(rùn)劑和分散劑進(jìn)一步復(fù)篩。將分散劑木質(zhì)素磺酸鈉、CMC-Na和PVA分別按照5%比例添加進(jìn)母粉中，測(cè)定母粉懸浮率和濕潤(rùn)時(shí)間。結(jié)果（表2）表明，PVA的分散效果[（88.09±2.03）%]和濕潤(rùn)時(shí)間[（74.00±5.29）s]均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。又因?yàn)槠渖锵嗳菪暂^好，最終確定分散劑為PVA。以相同方法測(cè)定濕潤(rùn)劑對(duì)母粉的影響，結(jié)果（表3）表明SDBS的分散性和濕潤(rùn)時(shí)間均最佳，由于其生物相容性較好，最終確定濕潤(rùn)劑為SDBS。

2.3 載體和助劑最佳配比優(yōu)化

經(jīng)過(guò)上述篩選，確定可濕性粉劑的載體為硅藻土，濕潤(rùn)劑為十二烷基苯磺酸鈉（SDBS），分散劑為聚乙烯醇（PVA），穩(wěn)定劑為磷酸鉀。由表4可知，A因素載體對(duì)懸浮率和濕潤(rùn)時(shí)間的影響均較大，說(shuō)明載體的用量不易過(guò)少，但是載體為A2和A3時(shí)懸浮率都達(dá)不到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（懸浮率≥70%），所以選擇載體A1（10%）。各組合中濕潤(rùn)時(shí)間均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（濕潤(rùn)時(shí)間≤120 s），因此懸浮率為主要選擇指標(biāo)。正交試驗(yàn)表中A1B3C3D1組合的懸浮率為最佳配方組合，此組合不在試驗(yàn)組合中。補(bǔ)充試驗(yàn)結(jié)果表明，A1B3C3D1的懸浮率不符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。而組合A1B3C3D3的懸浮率達(dá)到了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，所以選擇A1B3C3D3作為試驗(yàn)配比，制備可濕性粉劑。

2.4 紫外保護(hù)劑的篩選

當(dāng)可濕性粉劑施用時(shí)，菌體會(huì)受到紫外線照射，影響活性，使粉劑生防效果大大減弱。在粉劑中加入紫外保護(hù)劑，可吸收掉大部分的紫外輻射從而保持生防菌的活性。按照“2.3”節(jié)中確定的最優(yōu)配方并加入2.5%的紫外線保護(hù)劑，篩選最佳保護(hù)劑。由表5可知，在經(jīng)過(guò)紫外線（UV）照射12 h后，添加黃原膠和糊精的可濕性粉劑芽孢存活率和菌含量均較高，但是經(jīng)24 h UV照射后，添加黃原膠的粉劑芽孢存活率和菌細(xì)胞含量都有所下降，因此選擇糊精作為紫外保護(hù)劑。

2.5 可濕性粉劑指標(biāo)檢測(cè)

根據(jù)篩選的載體和助劑及紫外保護(hù)劑制備生防菌可濕性粉劑（表6），經(jīng)測(cè)定懸浮率為92.99%，濕潤(rùn)時(shí)間為20 s，細(xì)度為96.2%，pH值為6.8，含水量為1.81%，菌含量約7.0×108 CFU/g，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)值。

可濕性粉劑經(jīng)不同溫度（25、35、50、75、100 ℃）處理20 min后，溫度低于50 ℃時(shí)菌含量保持穩(wěn)定;隨著溫度的上升，菌含量逐漸降低但是仍保持在一定水平，表明可濕性粉劑的耐熱性較強(qiáng)（圖2-A）。因此在大田使用時(shí)不會(huì)受到實(shí)際環(huán)境溫度的影響。從酸堿處理結(jié)果可以看出，粉劑在pH值為6～9時(shí)保持較高的菌含量，且彼此間差異不顯著，表明粉劑在弱酸弱堿環(huán)境下菌活性保持穩(wěn)定（圖2-B）。自然界中潔凈水的pH值范圍基本上都在6～9之間，實(shí)際使用時(shí)只需用常規(guī)潔凈水稀釋即可。

2.6 可濕性粉劑抑菌效果和盆栽促生效果

用平板對(duì)峙法檢測(cè)可濕性粉劑對(duì)2種指示菌的抑制效果，結(jié)果（圖3）表明該粉劑對(duì)桑青枯病病原菌5號(hào)小種和灰霉菌有良好的抑制效果。說(shuō)明粉劑制備過(guò)程中仍然保持了生防菌的抑菌特性。

1 g粉劑用500 mL蒸餾水稀釋制成稀釋液澆灌番茄幼苗。經(jīng)15 d和30 d灌根處理，試驗(yàn)組番茄長(zhǎng)勢(shì)良好，無(wú)病變發(fā)生，高度和增長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組（表7）。表明可濕性粉劑能促進(jìn)番茄生長(zhǎng)，保持了生防菌的促生長(zhǎng)特性。

2.7 可濕性粉劑安全性和毒理性分析

經(jīng)過(guò)稀釋液浸根和穿刺處理的番茄幼苗移栽后生長(zhǎng)發(fā)育狀況正常，番茄幼苗的葉片未出現(xiàn)黃葉和枯萎狀況，莖部和根系無(wú)病變狀況發(fā)生，與對(duì)照組無(wú)明顯差異，表明可濕性粉劑對(duì)植物無(wú)危害。

對(duì)小鼠經(jīng)口灌胃14 d后，高劑量組（劑量組3和劑量組4）小鼠行動(dòng)遲緩、精神低郁;低劑量組（劑量組1和劑量組2）小鼠活動(dòng)正常，行動(dòng)靈敏。通過(guò)霍恩氏法測(cè)定半數(shù)致死量LD50>500 mg/kg，確定可濕性粉劑為低毒性（表8）。各組小鼠在經(jīng)口灌胃后，雌雄小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率受影響程度不同。低劑量組對(duì)雄性小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)影響，但高劑量組顯著抑制小鼠體質(zhì)量增加（P<0.05）;雌性小鼠中劑量組1顯著增加小鼠體質(zhì)量，而劑量組2和劑量組3對(duì)生長(zhǎng)無(wú)影響，劑量組4則明顯抑制雌性小鼠生長(zhǎng)（P<0.05）（表9）。4個(gè)劑量組粉劑對(duì)雄性小鼠的心臟、脾臟、腎臟和胃均無(wú)傷害，甚至在一定程度上能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育，但對(duì)肝臟有顯著影響（P<0.05）;雌性小鼠中除了對(duì)胃無(wú)影響外，4個(gè)劑量組對(duì)心臟、脾臟、腎臟和肝臟均有顯著影響（P<0.05）（表10）。表明可濕性粉劑具有一定毒性，但對(duì)雄性個(gè)體影響較小，對(duì)雌性個(gè)體影響較大。

2.8 菌株的促生長(zhǎng)和拮抗特性分析

在定性分析試驗(yàn)中，溶磷性檢測(cè)培養(yǎng)基和幾丁質(zhì)酶檢測(cè)培養(yǎng)基平板上菌落周?chē)鸁o(wú)無(wú)色透明圈，液體培養(yǎng)加入顯色劑后無(wú)紅色產(chǎn)生，表明菌株無(wú)溶磷性、不能產(chǎn)生IAA和胞外幾丁質(zhì)酶。產(chǎn)鐵載體、有機(jī)酸、蛋白酶和纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基平板上菌落周?chē)忻黠@的透明圈或光圈形成， 表明菌株381可產(chǎn)生鐵載體、有機(jī)酸、蛋白酶和纖維素酶（圖4）。

3 討論與結(jié)論

生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)利用既提高了經(jīng)濟(jì)效益，又保護(hù)生態(tài)環(huán)境，是當(dāng)前農(nóng)藥行業(yè)綠色發(fā)展的重要方式[35]。生物農(nóng)藥菌劑的研制，微生物活性是決定生防菌能否走向市場(chǎng)的關(guān)鍵[36]。農(nóng)藥中可濕性粉劑不使用溶劑和乳化劑，對(duì)植物較為安全。但可濕性粉劑中的載體和助劑，不僅影響菌劑的理化性質(zhì)，還與微生物活性密切相關(guān)，因此必須考慮載體和助劑與微生物的相容性，保證生防菌的數(shù)量。本試驗(yàn)以單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法探究載體和各種助劑與生防菌多黏類(lèi)芽孢桿菌381的相容性，并測(cè)定可濕性粉劑的重要指標(biāo)，以此篩選出最佳的載體和助劑及其配比。通過(guò)對(duì)載體、濕潤(rùn)劑、分散劑、穩(wěn)定劑、紫外保護(hù)劑的篩選，確定多黏類(lèi)芽孢桿菌381可濕性粉劑的最佳配比為發(fā)酵液70%、硅藻土10%、聚乙烯醇（PVA）5%、十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）10%、磷酸鉀2.5%、糊精 2.5%。該配方的可濕性粉劑的懸浮率為92.99%，濕潤(rùn)時(shí)間為 20 s， 菌含量約7.0×108 CFU/g，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

可濕性粉劑是以包括生防菌在內(nèi)的發(fā)酵液作為劑型化研究的對(duì)象，既包含生防菌菌體又包含其產(chǎn)生的對(duì)植物病害有抑制作用的物質(zhì)，防治作用更大。目前可濕性粉劑是微生物農(nóng)藥的主要?jiǎng)┬?，在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用[26]。多黏類(lèi)芽孢桿菌是具有極高應(yīng)用價(jià)值的安全生防菌株，對(duì)青枯病、枯萎病、根腐病、軟腐病等多種土傳植物病害有較好的防控效果[37-38]。多名學(xué)者對(duì)多黏類(lèi)芽孢桿菌可濕性粉劑的制備及其應(yīng)用進(jìn)行了研究[39-41]。本試驗(yàn)測(cè)定的可濕性粉劑主要性能指標(biāo)均明顯高于其他研究研制的可濕性粉劑，但菌含量略低，這可能與381菌株粉劑制備液的配制有關(guān)。

可濕性粉劑的載體是一種惰性填料，具有多網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)或片、層狀結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的吸附能力和吸附容量。載體在可濕性粉劑中占有較大比例，對(duì)制劑的性能和微生物活性有主要影響。賀振寧等制備枯草芽孢桿菌 B1514可濕性粉劑[42]，李磊等制備解淀粉芽胞桿菌Ht-q6可濕性粉劑[43]，凡超等制備發(fā)光桿菌可濕性粉劑[44]時(shí)，都選用硅藻土作為載體，與本試驗(yàn)確認(rèn)的載體一致。而硅藻土與蘇云金芽孢桿菌、白僵菌[45]以及解淀粉芽孢桿菌BA-12[26]的相容性較差。由此可見(jiàn)，不同種類(lèi)的載體對(duì)微生物的存活和活性影響差異很大，即使同一載體，不同微生物也會(huì)產(chǎn)生不一樣的效果。

助劑不僅可以提高防效，延長(zhǎng)貨架期，還能降低成本。倪榮等的研究表明，PVA和CMC-Na對(duì)可濕性粉劑的濕潤(rùn)時(shí)間有不同的影響。本研究中PVA大大降低可濕性粉劑的濕潤(rùn)時(shí)間，與其結(jié)果一致[46]。此外，明亮等研究發(fā)現(xiàn)，可濕性粉劑的理化因素會(huì)在干燥、粉碎過(guò)程中受到影響[47]。因此，生防菌381可濕性粉劑的工藝優(yōu)化還可以進(jìn)行進(jìn)一步完善。

本試驗(yàn)制備的可濕性粉劑的耐熱性良好，溫度低于50 ℃時(shí)菌含量保持穩(wěn)定，溫度較高時(shí)菌含量仍保持在較高水平。因此，田間葉片噴施或者灌根使用時(shí)，實(shí)際環(huán)境溫度不會(huì)影響粉劑的作用效果。粉劑稀釋液pH值偏中性，在pH值為6～9時(shí)保持較高的菌含量，且彼此間差異不顯著。自然界中潔凈水的pH值范圍基本上都在6～9之間，實(shí)際使用時(shí)只需用常規(guī)潔凈水稀釋?xiě)腋。瑹o(wú)需特殊處理，而且此pH值范圍也不受植物體本身酸堿度的影響。粉劑處理番茄幼苗，對(duì)植物無(wú)毒害作用;小鼠經(jīng)口灌胃試驗(yàn)結(jié)果表明粉劑對(duì)動(dòng)物有一定的毒害作用，但屬于低毒級(jí)別，田間可以放心施用。

鐵是植物生命活動(dòng)的重要營(yíng)養(yǎng)元素，參與或調(diào)控了光合作用、呼吸作用、固氮、DNA合成等多個(gè)代謝過(guò)程。在自然界中，鐵主要以難溶的Fe3+化合物形式存在，可溶性鐵含量相對(duì)較低，使鐵的生物有效性大大降低。鐵載體（siderophore）是生長(zhǎng)在低鐵環(huán)境中的細(xì)菌、真菌合成的一類(lèi)具有高度專(zhuān)一性的低分子量的鐵螯合劑。在缺鐵條件下，微生物依賴其分泌的鐵載體來(lái)溶解、運(yùn)輸環(huán)境中的難溶性鐵，提高土壤中有效鐵的濃度，同時(shí)被微生物同化的鐵在微生物死亡或鐵載體被分解后可釋放出來(lái)被植物所利用[48]。試驗(yàn)菌株381及其粉劑均能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，鐵載體的分泌發(fā)揮著一定的作用。

鐵載體在生防菌抑制病原菌中也發(fā)揮著重要作用。大部分病原微生物不具有分泌鐵載體的能力或能力很低。低鐵環(huán)境中生防菌分泌鐵載體到環(huán)境中，螯合鐵來(lái)維持自身生長(zhǎng)的需要，并且分泌的鐵載體一般不會(huì)被病原微生物利用，因此創(chuàng)造了鐵濃度更低的環(huán)境從而抑制植物病原菌的生長(zhǎng)[49]。菌株381及其粉劑可有效抑制檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)，定性平板檢測(cè)除了能夠分泌鐵載體外，還能夠分泌有機(jī)酸，產(chǎn)生胞外纖維素酶和蛋白酶。有機(jī)酸可通過(guò)能量競(jìng)爭(zhēng)、透化細(xì)菌外膜、提高胞內(nèi)滲透壓、抑制生物大分子合成、誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗菌肽等方式抑制微生物生長(zhǎng)[50-52];蛋白酶屬于水解酶類(lèi)，可有效分解蛋白質(zhì)，通過(guò)抑制細(xì)菌體外生物膜的形成、破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的結(jié)構(gòu)或真菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)成分等方式達(dá)到抑制微生物生長(zhǎng)的效果[53-54];低等真菌細(xì)胞壁成分以纖維素為主，而高等真菌則以幾丁質(zhì)為主，纖維素酶或幾丁質(zhì)酶可有效破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步影響真菌的生長(zhǎng)。前期試驗(yàn)中菌株381還可能代謝產(chǎn)生生物堿、黃酮或萜類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)在一定程度上均有殺菌抑菌的作用[20]。因此菌株381及其粉劑對(duì)多種病原細(xì)菌或真菌的廣譜抗性可能是其產(chǎn)生的多種物質(zhì)綜合作用的結(jié)果。

本研究中，確定了內(nèi)生生防菌381可濕性粉劑的配方、性質(zhì)、安全性、毒理性、抑菌性及其促生效果，并初步探索了促生和抑菌的可能機(jī)制。但是菌株在植物體內(nèi)的定殖繁殖規(guī)律、粉劑在田間施用的防控效果及防控注意因素、菌株與其他生物間的作用關(guān)等還需要進(jìn)一步探究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王 智. 遼寧省不同地區(qū)番茄灰霉病菌抗藥性研究[D]. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[2]張靜靜. 吉林省主要城市城郊土壤-蔬菜系統(tǒng)中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留及風(fēng)險(xiǎn)研究[D]. 長(zhǎng)春：中國(guó)科學(xué)院研究生院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，2016.

[3]李曉強(qiáng)，孫躍先，葉光祎，等. 使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)農(nóng)業(yè)生物多樣性的影響[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，30（增刊2）：365-369.

[4]卜元卿，孔 源，智 勇，等. 化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染及其防控對(duì)策建議[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2014，16（2）：19-25.

[5]Sturz A V，Christie B R，Nowak J.Bacterial endophytes：potential role in developing sustainable systems of crop production[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，2000，19（1）：1-30.

[6]Sivasakthi S，Usharani G，Saramraj P. Biocontrol potentiality of plant growth promoting bacteria （PGPR）-Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis：a review[J]. African Journal of Agricultural Research，2014，9（16）：1265-1277.

[7]Villegas-Escobar V，Ceballos I，Mira J J，et al.Fengycin C produced by Bacillus subtilis EA-CB0015[J]. Journal of Natural Products，2013，76（4）：503-509.

[8]Lee J Y，Shim J M，Yao Z，et al.Antimicrobial activity of Bacillus amyloliquefaciens EMD17 isolated from Cheonggukjang and potential use as a starter for fermented soy foods[J]. Food Science and Biotechnology，2016，25（2）：525-532.

[9]Kilani-Feki O，Khiari O，Culioli G，et al.Antifungal activities of an endophytic Pseudomonas fluorescens strain Pf1TZ harbouring genes from pyoluteorin and phenazine clusters[J]. Biotechnology Letters，2010，32（9）：1279-1285.

[10]韓長(zhǎng)志. 植物病害生防菌的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J]. 中國(guó)森林病蟲(chóng)，2015，34（1）：33-37.

[11]Etesami H，Alikhani H A，Mirseyed H H.Root bacterial endophytes as potential biological control agents against fungal rice pathogens[J]. Archives of Phytopathology and Plant Protection，2019，52（7/8）：560-581.

[12]Seliem M K，El-Mahrouk M E，El-Banna A N，et al. Micropropagation of Philodendron selloum：influence of copper sulfate on endophytic bacterial contamination，antioxidant enzyme activity，electrolyte leakage，and plant survival[J]. South African Journal of Botany，2021，139：230-240.

[13]劉振華，羅遠(yuǎn)嬋，張道敬，等. 農(nóng)用微生物殺菌劑劑型研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16（5）：497-507.

[14]Ash C，Priest F G，Collins M D.Molecular identification of rRNA group 3 bacilli （ash，farrow，wallbanks and collins） using a PCR probe test[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，1993，64（3/4）：253-260.

[15]Li Y L，Chen S F.Fusaricidin produced by Paenibacillus polymyxa WLY78 induces systemic resistance against Fusarium wilt of cucumber[J]. International Journal of Molecular Sciences，2019，20（20）：5240.

[16]Vater J，Herfort S，Doellinger J，et al.Fusaricidins from Paenibacillus polymyxa M-1，a family of lipohexapeptides of unusual complexity-a mass spectrometric study[J]. Journal of Mass Spectrometry，2017，52（1）：7-15.

[17]Bent E，Chanway C P.Potential for misidentification of a spore-forming Paenibacillus polymyxa isolate as an endophyte by using culture-based methods[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（9）：4650-4652.

[18]Bolwerk A，Lagopodi A L，Wijfjes A H M，et al.Interactions in the tomato rhizosphere of two Pseudomonas biocontrol strains with the phytopathogenic fungus Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2003，16（11）：983-993.

[19]Wang Z W，Liu X L.Medium optimization for antifungal active substances production from a newly isolated Paenibacillus sp.using response surface methodology[J]. Bioresource Technology，2008，99（17）：8245-8251.

[20]王 彪，潘英豪，侯佳藍(lán)，等. 一種桑樹(shù)細(xì)菌性病原內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定及其生防活性[J]. 微生物前沿，2019，8（3）：110-120.

[21]李志禮，龐煜霞，葛圓圓，等. 木質(zhì)素磺酸鈉分散劑的制備及其在農(nóng)藥中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)造紙，2010，29（5）：38-42.

[22]國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局. 農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率測(cè)定方法：GB/T 14825—1993[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[23]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 農(nóng)藥可濕性粉劑潤(rùn)濕性測(cè)定方法：GB/T 5451—2001[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[24]國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局. 農(nóng)藥粉劑、可濕性粉劑細(xì)度測(cè)定方法：GB/T 16150—1995[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[25]國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局. 農(nóng)藥pH值的測(cè)定方法：GB/T 1601—1993[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1994.

[26]李姝江，方馨玫，曾艷玲，等. 解淀粉芽孢桿菌BA-12可濕性粉劑研制及對(duì)核桃根腐病的防治效果[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2016，32（5）：619-626.

[27]曾建紅，歐賢紅，郭俊平，等. 莪術(shù)醇原藥對(duì)大鼠慢性毒性的試驗(yàn)研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，15（11）：21-23.

[28]羅 洋，滕 應(yīng)，羅緒強(qiáng)，等. 里氏木霉FS10-C可濕性粉劑的研制及其促生效果測(cè)定[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2016，32（8）：194-199.

[29]韓麗珍，林佳靜，鄭 歡，等. 一株溶磷菌的抗逆促生特性及對(duì)種子萌發(fā)的研究[J]. 種子，2019，38（10）：34-40.

[30]楊常娥，魯艷莉，倪捍成，等. 創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)鐵載體菌株的篩選及其誘導(dǎo)條件的響應(yīng)面優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技，2017，38（3）：159-165.

[31]詹壽發(fā)，盧丹妮，毛花英，等. 2株溶磷、解鉀與產(chǎn)IAA的內(nèi)生真菌菌株的篩選、鑒定及促生作用研究[J]. 中國(guó)土壤與肥料，2017（3）：142-151.

[32]楊繼業(yè)，郭曉軍，郭 威，等. 產(chǎn)有機(jī)酸芽孢桿菌的篩選、鑒定及產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化[J]. 飼料工業(yè)，2015，36（4）：44-51.

[33]Sunitha V H，Devi D N，Srinivas C.Extracellular enzymatic activity of endophytic fungal strains isolated from medicinal plants[J]. World Journal of Agricultural Sciences，2013，9（1）：1-9.

[34]譚海剛，李 靜，趙祥穎. 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選及酶解產(chǎn)物鑒定[J]. 糧油食品科技，2013，21（2）：65-67.

[35]郭利京，王 穎. 我國(guó)農(nóng)藥施用的時(shí)空演變[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（14）：327-331.

[36]陳 源，卜元卿，單正軍. 微生物農(nóng)藥研發(fā)進(jìn)展及各國(guó)管理現(xiàn)狀[J]. 農(nóng)藥，2012，51（2）：83-89.

[37]張 楠，陳 巖，王麗麗，等. 多黏類(lèi)芽胞桿菌對(duì)植物土傳病害的防控及促生長(zhǎng)作用研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)雜志，2017，37（5）：91-97.

[38]蒼桂璐，張付云，楊 陽(yáng)，等. 多黏類(lèi)芽孢桿菌的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：487-489.

[39]李暢方，羅時(shí)華，何 強(qiáng)，等. 康地蕾得防治番茄青枯病藥效試驗(yàn)[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，30（6）：38-39.

[40]趙新海，鐘麗娟，張慶華，等. 多黏類(lèi)芽孢桿菌在黃瓜葉面和土壤中定殖能力及其對(duì)土壤微生物的影響[J]. 世界農(nóng)藥，2009，31（5）：25-27.

[41]劉振華. 多黏類(lèi)芽孢桿菌和海洋芽孢桿菌可濕性粉劑的研制及其加工工藝的優(yōu)化與放大[D]. 上海：華東理工大學(xué)，2011.

[42]賀振寧，李海燕，蘇 媛，等. 枯草芽孢桿菌B1514可濕性粉劑的研制及其對(duì)小麥紋枯病的防效[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，44（11）：67-72.

[43]李 磊，許 敏，王美琴.生防菌解淀粉芽胞桿菌Ht-q6可濕性粉劑的研制及對(duì)番茄病害的田間防效[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2018，34（5）：738-745.

[44]凡 超，邵雪花，匡石滋，等. 發(fā)光桿菌可濕性粉劑的研制及對(duì)荔枝采后貯藏的影響[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（12）：110-115，174.

[45]王志英，孫麗麗，張 健，等. 蘇云金桿菌和白僵菌可濕性粉劑研制及殺蟲(chóng)毒力測(cè)定[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（3）：34-41.

[46]倪 榮，李紫嫣，鐘文文，等. 10億芽孢/g解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（24）：111-114.

[47]明 亮，劉程程，楊曉云，等. 生物殺菌劑解淀粉芽孢桿菌B1619水分散粒劑配方及助劑篩選[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2015，31（4）：529-535.

[48]謝小軍. 根際細(xì)菌鐵載體化感作用研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002：9-11.

[49]孫 萌. 鐵載體高產(chǎn)菌株的ARTP選育及其鐵載體產(chǎn)量提高機(jī)理的初步分析[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué)，2017.

[50]劉曉宇，傅海燕，黃國(guó)和，等. 美人蕉有機(jī)酸組分對(duì)銅綠微囊藻的化感作用[J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2015，9（12）：5769-5774.

[51]黃新琦，溫 騰，孟 磊，等. 土壤強(qiáng)還原過(guò)程產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)土傳病原菌的抑制作用[J]. 植物保護(hù)，2015，41（6）：38-43.

[52]張 軍，田子罡，王建華，等. 有機(jī)酸抑菌分子機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42（3）：323-328.

[53]Gaonkar S K，F(xiàn)urtado I J.Characterization of extracellular protease from the haloarcheon Halococcus sp.strain GUGFAWS-3 （MF425611）[J]. Current Microbiology，2020，77（6）：1024-1034.

[54]Tang B L，Yang J E，Chen X L，et al.A predator-prey interaction between a marine Pseudoalteromonas sp. and Gram-positive bacteria[J]. Nature Communications，2020，11：285.