外泌體改善心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制研究進(jìn)展

李 勝，李 瀾，郭 蕊，樊官偉，2

外泌體是直徑為30～100 nm并具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡。1981年，Trams 等[1]在體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清液中發(fā)現(xiàn)了有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，并命名為外泌體。當(dāng)時(shí)推測(cè)外泌體的作用為細(xì)胞排泄廢物的一種方式。隨著外泌體的研究日益增多，研究者發(fā)現(xiàn)其在機(jī)體免疫應(yīng)答、細(xì)胞分化、抗原呈遞、腫瘤發(fā)生發(fā)展等各種生物過(guò)程中起作用[2]。目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，外泌體的形成過(guò)程為：細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成內(nèi)體，再形成多泡體，最后分泌到胞外成為外泌體。幾乎所有類型的細(xì)胞都能分泌外泌體，同時(shí)外泌體也廣含核酸[microRNA(miRNA)、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等]、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等，其表面標(biāo)志物主要有CD63、CD81、CD9、ALG-2 互作蛋白 X(Alix)、腫瘤易感基因 101(TSG101)、熱休克蛋白27(HSP27)等。目前對(duì)于外泌體的鑒定主要有4種方法：透射電子顯微鏡、Nanosight、免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)[3]。關(guān)于外泌體的分離方法主要有基于差速離心的分離技術(shù)、基于大小的分離技術(shù)、基于免疫吸附的分離技術(shù)、沉淀法、基于微流控的分離技術(shù)[4]。

1 心肌缺血再灌注損傷機(jī)制

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是全球死亡和致殘的主要病因，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)應(yīng)用于ST段抬高型心肌梗死病人所表現(xiàn)出的缺血性損傷是及時(shí)而有效的，但心肌再灌注本身可能進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡故而加重心肌損傷，這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion，MIR)損傷[5]，因此，再灌注被描述為“雙刃劍”[6]。MIR損傷是心血管疾病病理學(xué)的核心，由多種因素介導(dǎo)，包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增加，尤其是在再灌注過(guò)程中，造成氧化應(yīng)激損傷，而還原酶Ⅱ(NADPH)氧化酶同源物家族的線粒體呼吸鏈和NADPH氧化酶是心肌細(xì)胞中活性氧的主要來(lái)源[7]。細(xì)胞凋亡也可導(dǎo)致MIR損傷，但可能是通過(guò)對(duì)非心肌細(xì)胞的作用引起的，通過(guò)凋亡和壞死引起的心肌細(xì)胞死亡也是心力衰竭發(fā)病機(jī)制中的重要組成部分，并由死亡受體和線粒體信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)[8]。另外，在MIR后的缺血期，局部缺血抑制脯氨酰羥化酶活性導(dǎo)致細(xì)胞缺氧和炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的翻譯后激活，控制缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的穩(wěn)定性增加血管通透性、引發(fā)炎癥反應(yīng)，再灌注期間補(bǔ)體系統(tǒng)激活，白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附和血小板與白細(xì)胞的聚集加重了微血管功能障礙[9]。

2 外泌體的功能

細(xì)胞間的通訊是各種生理和病理過(guò)程所必需的，累積的證據(jù)表明細(xì)胞除了釋放可溶性因子外，還可以通過(guò)外泌體進(jìn)行通信[10]。外泌體作為細(xì)胞間通訊的信使在細(xì)胞之間傳遞各種信號(hào)分子，尤其是蛋白質(zhì)、mRNA和非編碼RNA，其中最值得注意的是miRNA。Valadi等[11]報(bào)道m(xù)iRNA可以通過(guò)外泌體在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，細(xì)胞釋放的外泌體中miRNA與相關(guān)媒介共同循環(huán)到達(dá)鄰近細(xì)胞和遠(yuǎn)處的細(xì)胞，miRNA被遞送至受體細(xì)胞后發(fā)揮功能性作用，盡管不能完全排除其他外泌體內(nèi)容物對(duì)受體細(xì)胞的影響，但miRNA被認(rèn)為是外泌體中關(guān)鍵的功能元件。近年來(lái)，外泌體作為多種細(xì)胞[如心臟祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS)等]的旁分泌因子成為各種疾病模型的研究熱點(diǎn)，并被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)中最有希望的治療策略之一[12]。文獻(xiàn)證實(shí)外泌體作用于心肌MIR損傷模型具有抗氧化應(yīng)激、抗心肌細(xì)胞凋亡、抗炎、促血管新生以及修復(fù)心肌損傷等功能[13-17]。外泌體改善MIR損傷的機(jī)制如下。

2.1 抗氧化應(yīng)激 有研究表明，再灌注損傷的關(guān)鍵特征為三磷酸腺苷(ATP)/NADH的喪失、氧化應(yīng)激的增加和細(xì)胞死亡，這是由缺血再灌注心肌的蛋白質(zhì)組學(xué)缺陷所導(dǎo)致[15]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose mesenchymal stem cells，ADMSC)外泌體通過(guò)補(bǔ)充MIR損傷丟失的氧化磷酸化途徑中的關(guān)鍵酶來(lái)恢復(fù)生物能以減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[18]。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可增加ATP水平，減少氧化應(yīng)激并激活PI3K/Akt途徑以增強(qiáng)心肌活力防止MIR后的心臟重塑[19]。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞外泌體/微囊泡通過(guò)受Nanog和缺氧誘導(dǎo)因子-1α調(diào)控的miR-21和miR-210抑制Caspase 3/Caspase 7的激活，從而保護(hù)H9C2細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[20]。由此可見，外泌體通過(guò)升高ATP水平、抑制凋亡途徑從而減少M(fèi)IR的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.2 抗心肌細(xì)胞凋亡 間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體增強(qiáng)心肌細(xì)胞H9C2缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型的細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平，降低LC3-Ⅱ/Ⅰ比例并增加p62的表達(dá)，從而抑制自噬并上調(diào)離體大鼠MIR模型的Bcl-2和mTORC1/p-4eBP1信號(hào)通路，下調(diào)Traf6減少M(fèi)I/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬[21]。Wang等[22]采用H2O2和CoCl2處理新生大鼠心肌細(xì)胞模擬體內(nèi)MIR損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并建立大鼠MIR模型，結(jié)果顯示外泌體攜帶miR-126靶向ERRFI1減少細(xì)胞凋亡和活性氧的積累從而改善心功能。遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理(remote ischemic preconditioning，RIPC)誘導(dǎo)的大鼠血漿外泌體可以通過(guò)旁分泌方式轉(zhuǎn)移miR-24下調(diào)H2O2處理的H9C2細(xì)胞表達(dá)，減少大鼠MIR模型中心肌細(xì)胞的凋亡，縮小梗死面積并改善心臟功能[23]。Cui等[24]研究發(fā)現(xiàn)ADMSC可能通過(guò)激活Wnt/-catenin信號(hào)通路拮抗MIR和H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)外泌體調(diào)控miR-486-5p激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制H/R模型和MIR模型中受損心肌細(xì)胞的凋亡[16]。另有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體攜帶miR-125b靶向SIRT7下調(diào)Bax、Caspase-3凋亡相關(guān)蛋白和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)炎性因子水平，并上調(diào)Bcl-2表達(dá)，以減輕MIR大鼠心肌組織的病理?yè)p傷[25]。因此，外泌體大多通過(guò)抑制凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)保護(hù)心肌細(xì)胞而改善心臟功能。

2.3 抑制炎癥反應(yīng) 大鼠M2型巨噬細(xì)胞外泌體攜帶miR-148a下調(diào)硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)的表達(dá)并使Toll樣受體4 (TLR4)/NF-κB/NLRP3炎性體信號(hào)通路失活以減輕MIR損傷[26]。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體調(diào)控miR-182靶向TLR4/PI3K /Akt/信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型極化，從而減輕炎癥反應(yīng)、緩解心肌MIR損傷[13]。另有實(shí)驗(yàn)表明，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體傳遞的miR-181a可能通過(guò)c-Fos抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)Treg細(xì)胞的極化保護(hù)MIR損傷后的心臟[27]。ADMSC靶向PI3K/Akt/GSK3β、pm-TOR/p-AMKP和NF-κB信號(hào)通路抑制內(nèi)在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和炎癥保護(hù)心臟免受MIR損傷[28]。此外，從大鼠和健康志愿者中分離和表征血漿外泌體并用于離體，體內(nèi)和體外MIR或H/R模型驗(yàn)證了血漿外泌體通過(guò)熱休克蛋白70(HSP70)/TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)的心臟保護(hù)作用[29]。綜上所述，外泌體主要通過(guò)TLR4/PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)途徑抑制MIR后的炎癥反應(yīng)。

2.4 促血管新生 血管生成在包括傷口愈合和組織修復(fù)在內(nèi)的各種生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，依靠?jī)?nèi)皮細(xì)胞與其周圍環(huán)境之間的緊密相互作用[10]。蛋白組學(xué)分析結(jié)果表明，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體包含血管生成旁分泌效應(yīng)子，NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)被確定為間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，在治療缺血性組織相關(guān)疾病方面具有很大潛力[17]。Vandergriff等[30]使用心臟歸巢肽(cardiac homing peptide，CHP)與心肌干細(xì)胞來(lái)源外泌體結(jié)合將外泌體靶向梗死心臟部位增加血管性血友病因子(vWF)的表達(dá)促進(jìn)血管新生，減少瘢痕大小促進(jìn)心臟修復(fù)。研究表明，在小鼠MIR損傷模型中將心臟祖細(xì)胞衍生的外泌體直接注射到小鼠心臟中可抑制心肌細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步證實(shí)源自NADPH氧化酶的活性氧可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞中的血管生成[31]，這可能是治療缺血性心血管疾病的有效治療策略。

2.5 修復(fù)心肌損傷 間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)旁分泌機(jī)制分泌外泌體減小MIR損傷的離體小鼠Langendorff心臟模型的梗死面積發(fā)揮對(duì)心臟的修復(fù)作用[32]。De Couto等[33]研究發(fā)現(xiàn)，心肌球來(lái)源細(xì)胞(cardiomy-ocyte derived cells，CDC)外泌體miR-181b轉(zhuǎn)移到M?中降低PKCδ轉(zhuǎn)錄水平并改變M?的極化狀態(tài)，縮小大鼠和豬MI/R模型的梗死面積從而保護(hù)心臟。急性心肌梗死和恢復(fù)期心肌梗死豬模型中CDC外泌體經(jīng)心肌原位注射作用于豬MIR損傷模型能減少瘢痕形成，改善心臟不良重塑并縮小梗死面積[34]。Agarwal等[26]評(píng)估新生兒心臟祖細(xì)胞外泌體促進(jìn)MIR損傷后的血管生成，減少纖維化和心肌肥大，修復(fù)心肌組織從而改善心臟功能；此外，研究表明，全身性使用CXCR4過(guò)表達(dá)的心臟祖細(xì)胞外泌體可縮小MIR大鼠梗死面積并提高左室射血分?jǐn)?shù)，從而修復(fù)心肌損傷。

3 臨床研究

Zhang等[35]對(duì)外泌體治療MIR損傷的臨床效果進(jìn)行薈萃分析，根據(jù)危險(xiǎn)區(qū)域占左心室的百分比、梗死面積占危險(xiǎn)區(qū)域的百分?jǐn)?shù)、梗死面積占左心室的百分比、左心室射血分?jǐn)?shù)、左心室縮短分?jǐn)?shù)、舒張末期容積和收縮末期容積評(píng)估外泌體對(duì)心臟功能的影響，其分析表明，目前可獲得的數(shù)據(jù)證實(shí)了間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體在改善心臟功能方面的治療潛力，但對(duì)于MIR損傷后這種心臟再生方法的優(yōu)化和驗(yàn)證，還需要進(jìn)一步的機(jī)制研究、治療安全性的評(píng)估和臨床試驗(yàn)的開展。

4 總結(jié)與展望

在心肌MIR損傷中外泌體通過(guò)抗氧化應(yīng)激、減少心肌細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管新生、修復(fù)心肌損傷等作用來(lái)改善心臟功能。因此，外泌體對(duì)MIR損傷表現(xiàn)出可觀的治療潛力。外泌體作為藥物遞送載體在細(xì)胞間遞送蛋白質(zhì)和核酸等生物活性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了跨越不同生物屏障將藥物有效遞送至靶細(xì)胞的有效治療策略，但是在將外泌體成功轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐之前需要克服許多不可避免的障礙，深入研究外泌體作為藥物載體的可靠療效，針對(duì)包括MIR在內(nèi)的多種疾病的作用靶點(diǎn)以及優(yōu)化的分離方法為新興的“無(wú)細(xì)胞”替代療法提供有益探索。