柴胡皂苷d抗肝纖維化模型中的大鼠脂質(zhì)過氧化作用分析

金紅陽 張坤 胡海 孫潔

【摘要】目的：分析柴胡皂苷 d 抗肝纖維化模型中的大鼠脂質(zhì)過氧化作用。方法：將 24例 SPF 級雄性 SD 大鼠隨機(jī)分為三組，即預(yù)防組、模型組、正常組，每組8 例。統(tǒng)計分析三組大鼠的血清酶活性、血清透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅳ型膠原（IV-C）水平及血清、肝組織超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平、肝纖維化程度、膠原總面積、面積比。結(jié)果：模型組、正常組、預(yù)防組大鼠的血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、佛甲草提取液（SLT）水平均逐漸降低（P <0.05），模型組、預(yù)防組、正常組大鼠的血清 HA、 LN、IV-C 水平均逐漸降低（P <0.05）。模型組、預(yù)防組大鼠的血清 SOD 水平均低于正常組（P <0.05）;模型組、正常組、預(yù)防組大鼠的血清、肝組織 MDA 水平逐漸降低（P <0.05），肝組織 SOD 水平逐漸升高（P <0.05）。模型組、預(yù)防組大鼠的肝纖維化0 級比例均低于正常組（P <0.05）;預(yù)防組大鼠的肝纖維化Ⅱ級比例高于模型組、正常組（P <0.05）;模型組大鼠的肝纖維化Ⅲ級比例高于正常組、預(yù)防組（P <0.05）。模型組、預(yù)防組、正常組大鼠的膠原總面積、面積比均逐漸降低（P <0.05）。結(jié)論：柴胡皂苷 d 抗肝纖維化機(jī)制可能和抗脂質(zhì)過氧化作用相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】抗肝纖維化模型;大鼠;柴胡皂苷 d;脂質(zhì)過氧化;肝纖維化程度;膠原總面積

【中圖分類號】R258.5 R575【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-5249（2021）18-0001-03

Analysis of effect of saikosaponin d on lipid peroxidation in rats with hepatic fibrosis

Jin Hong-yang1， Zhang Kun2， Hu Hai2， Sun Jie2

1.Baotou Medical College， Inner Mongolia University of science and technology， Baotou 014060， China;

2.Department of pathophysiology， Baotou Medical College， Inner Mongolia University of science and technology， Baotou 014060，China

【Abstract】Objective：To analyze the e?ect of saikosaponin d on lipid peroxidation in rats with hepatic ?brosis.Methods：24 SPF male SD rats were randomly divided into three groups：prevention group，model group and normal group，with 8 cases in each group.The levels of serum enzyme activity，serum hyaluronic acid（HA），laminin（LN），type Ⅳ collagen（Ⅳ-C），serum and liver superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），degree of liver ?brosis，total area and area ratio of collagen were statisti- callyanalyzed.Results：The levels of serum aspartate aminotransferase（AST） and SLT in model group，normal group and preven- tion group decreased gradually（P<0.05），and the levels of serum HA，LN and Ⅳ-C in model group，prevention group and normal group decreased gradually（P<0.05）.The levels of serum SOD in model group and prevention group were lower than those in normal group（P<0.05）;The levels of MDA in serum and liver tissue of model group，normal group and prevention group decreased grad- ually（P<0.05），and the level of SOD in liver tissue increased gradually（P<0.05）.The proportion of grade 0 liver ?brosis in model group and prevention group was lower than that in normal group（P<0.05）;The proportion ofgrade Ⅱ liver ?brosis in the prevention group was higher than that in the model group and normal group（P<0.05）;The proportion of grade Ⅲ liver ?brosis in model group was higher than that in normal group and prevention group（P<0.05）.The total area and area ratio of collagen in model group，pre- vention group and normal group decreased gradually（P<0.05）.Conclusion：The anti ?brosis mechanism of saikosaponin d may be related to its anti lipid peroxidation e?ect.

【Key words】Anti hepatic ?brosis model;Rats;Saikosaponin d;Lipid peroxidation;Degree of hepatic ?brosis;Total collagenarea

肝纖維化在分子水平上一方面和氧化應(yīng)激相關(guān)分析關(guān)系密切，另一方面還和化學(xué)因子、細(xì)胞因子等關(guān)系密切[1]。相關(guān)促進(jìn)其減慢。近年來，在興起的自由基醫(yī)學(xué)作用下，臨床發(fā)現(xiàn)中藥能夠?qū)Ⅶ匪犷?、黃酮類等自由基成分清除，從而直接清除超氧陰離子，同時還能夠促進(jìn)機(jī)體抗氧化能力的增強，途徑為對機(jī)體內(nèi)氧化- 抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[3]。本研究分析了柴胡皂苷d抗肝纖維化模型中的大鼠脂質(zhì)過氧化作用，報道如下。

1材料與方法

1.1 實驗動物

選取由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供的24例健康SPF 級雄性 SD 大鼠[動物飼養(yǎng)許可證號 SCXK（京）2002-0003，動物合格證號SYXK（京）2005-0019]，所有大鼠體重70～90（80±10）g，均在中日友好醫(yī)院臨床研究所動物室屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)，并讓其自由飲食水。

1.2 藥物與試劑、儀器

于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所藥物藥理室購買柴胡皂苷d（Saikosaponind，SSd）白色粉末，從北柴胡中提取，純度經(jīng)高效液相色譜法分析為92%，能夠在生理鹽水中部分溶解，實驗時配制，煮沸滅菌。

透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）放射免疫分析測定盒購自北京北方生物技術(shù)研究所;二甲基亞硝胺（DMN）購自日本東京化成工業(yè)株式會社; Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）放射免疫分析測定盒購自美國TPI公司;超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。采用美國 CD-1600全自動生化分析儀，上海第三分析儀器廠生產(chǎn)的722光柵分光光度儀，北京核儀廠生產(chǎn)的放射免疫γ 計數(shù)儀（BFG0152型），日本SAKURA公司生產(chǎn)的滑走式切片機(jī)，日本 KUBOTA-5310臺式低速離心機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠肝纖維化模型建立

給予大鼠腹腔注射DMN 10 mg/kg，每天1次，每周2天，共4周。采血后立即處死大鼠并常規(guī)摘取大鼠肝臟。

1.3.2 動物分組及處理

將24例大鼠隨機(jī)分為三組，即預(yù)防組、模型組、正常組，每組8 例。預(yù)防組從造模第1天給其腹腔注射 SSd1.8mg/ kg，直到實驗結(jié)束。 4周后給予預(yù)防組、模型組大鼠腹腔注射3.5 mL/kg 10%水合氯醛，對其進(jìn)行麻醉，然后取腹主動脈血液，離心將血清分離出來，分裝后保存在-20℃的溫度下備用。正常組不接受任何處理。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）對比血清酶活性。采用全自動生化分析儀對谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、佛甲草提取液（SLT）活性進(jìn)行測定;（2）對比血清HA、LN、Ⅳ-C水平。應(yīng)用放射免疫分析測定盒對血清HA、 LN、IV-C水平進(jìn)行測定;（3）對比血清、肝組織 SOD、MDA水平。應(yīng)用 SOD、MDA測定盒對血清、肝組織 SOD、MDA水平進(jìn)行測定;（4）病理組織觀察。肝纖維化分級標(biāo)準(zhǔn)為無膠原纖維增生、具有正常的肝組織評定為0級;膠原纖維從中央靜脈周圍或匯管區(qū)輕度向外延伸評定為Ⅰ級;膠原纖維顯著延伸但還沒有相互連接將整個肝小葉包繞起來評定為Ⅱ級;膠原纖維顯著延伸、相互連接將整個肝小葉包繞起來評定為Ⅲ級;膠原纖維將肝小葉包繞起來并分隔、破壞正常肝小葉結(jié)構(gòu)、形成假小葉、主要為大方形假小葉評定為Ⅳ級;完全破壞假小葉、形成假小葉、大方形和小方形假小葉分別占1/2評定為Ⅴ級;小圓形假小葉布滿肝、有粗大增生的膠原纖維出現(xiàn)在假小葉中評定為Ⅵ級[4]。（5）對比膠原總面積、面積比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料用（ ±s）表示，用 t檢驗;計數(shù)資料用率（%）表示，用Fisher χ2檢驗。當(dāng) P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 三組大鼠的血清酶活性、血清HA、LN、Ⅳ-C水平比較模型組、正常組、預(yù)防組大鼠的血清 AST、SLT 水平均逐漸降低（P<0.05），模型組、預(yù)防組、正常組大鼠的血清HA、 LN、IV-C水平均逐漸降低（P<0.05），見表1。

2.2 三組大鼠的血清、肝組織SOD、MDA水平比較

模型組、預(yù)防組大鼠的血清 SOD 水平均低于正常組（P<0.05），但模型組、預(yù)防組大鼠的血清SOD 水平差異不顯著（P>0.05）;模型組、正常組、預(yù)防組大鼠的血清、肝組織 MDA水平逐漸降低（P<0.05），肝組織 SOD水平逐漸升高（P<0.05），見表2。

2.3 三組大鼠的肝纖維化程度比較

模型組、預(yù)防組大鼠的肝纖維化0級比例均低于正常組（P<0.05），但模型組、預(yù)防組大鼠的肝纖維化0級比例對比差異不顯著（P>0.05）;預(yù)防組大鼠的肝纖維化Ⅱ級比例高于模型組、正常組（P<0.05），但模型組、正常組大鼠的肝纖維化Ⅱ級比例對比差異不顯著（P>0.05）;模型組大鼠的肝纖維化Ⅲ級比例高于正常組、預(yù)防組（P<0.05），但正常組、預(yù)防組大鼠的肝纖維化Ⅲ級比例對比差異不顯著（P>0.05）;三組大鼠

的肝纖維化Ⅰ級、Ⅳ級比例對比差異均不顯著（P>0.05）。見表 3。

2.4 三組大鼠的膠原總面積、面積比比較

模型組、預(yù)防組、正常組大鼠的膠原總面積、面積比均逐漸降低（P<0.05）。見表4。

3討論

小柴胡湯的主要功效為保肝利膽、抗炎，近年來在慢性肝病的治療中得到了廣泛應(yīng)用。其君藥為柴胡，主要功效為疏肝解郁、解表退熱等;主要活性成分為柴胡皂苷，其中SSd最具活性[5]。現(xiàn)階段相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[6]，SSd能夠?qū)⒖鼓[瘤作用發(fā)揮出來。還有醫(yī)學(xué)研究表明[7]，SSd能夠促進(jìn)四氯化碳引發(fā)的肝功能損傷的減輕，對原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積的減少。

相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[8]，SSd可能通過抗脂質(zhì)過氧化作用在極大程度上對肝細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，將抗肝纖維化作用發(fā)揮出來。本研究結(jié)果表明，模型組、正常組、預(yù)防組大鼠的AST、 SLT水平均逐漸降低，模型組、預(yù)防組、正常組大鼠的血清HA、LN、Ⅳ-C水平均逐漸降低。模型組、預(yù)防組大鼠的血清SOD水平均低于正常組;模型組、正常組、預(yù)防組大鼠的血清、肝組織 MDA水平逐漸降低，肝組織SOD水平逐漸升高。模型組、預(yù)防組大鼠的肝纖維化0級比例均低于正常組;預(yù)防組大鼠的肝纖維化Ⅱ級比例高于模型組、正常組;模型組大鼠的肝纖維化Ⅲ級比例高于正常組、預(yù)防組。模型組、預(yù)防組、正常組大鼠的膠原總面積、面積比均逐漸降低（P 均<0.05），此研究結(jié)果和上述研究結(jié)果一致。但本次研究不足之處在于樣本數(shù)量較少、觀察時間較短，造成研究結(jié)果可能存在偏差，今后應(yīng)該擴(kuò)大樣本量、延長隨訪時間，進(jìn)行進(jìn)一步深入細(xì)致的研究。

綜上所述，SSd抗肝纖維化機(jī)制可能和抗脂質(zhì)過氧化作用相關(guān)，值得臨床重視。

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（收稿日期：2021-05-21）