人EPCs來(lái)源外泌體修復(fù)糖尿病大鼠皮膚缺損機(jī)制研究

張雁 徐寧

[摘要]目的：探究人EPCs來(lái)源外泌體修復(fù)糖尿病大鼠皮膚缺損機(jī)制。方法：用隨機(jī)數(shù)字表法將制備成功的糖尿病SD大鼠創(chuàng)面感染動(dòng)物分為外泌體注射組（10只）和陰性對(duì)照組（10只）注射等劑量生理鹽水，紗布覆蓋，比較兩組創(chuàng)面組織VEGF及bFGF水平、創(chuàng)面MVD、創(chuàng)面愈合率等指標(biāo)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面組織VEGF、bFGF水平、CD34陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)、創(chuàng)面愈合率均顯著高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：人EPCs來(lái)源外泌體可以使糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面血管化加快，創(chuàng)面愈合更加迅速，創(chuàng)面中VEGF、bFGF的表達(dá)很可能促進(jìn)了小鼠的恢復(fù)。

[關(guān)鍵詞]人EPCs來(lái)源外泌體;糖尿病大鼠;皮膚缺損機(jī)制

[中圖分類(lèi)號(hào)]R751

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2096-5249（2021）24-0001-02

創(chuàng)面愈合的過(guò)程并不簡(jiǎn)單，要使創(chuàng)面愈合效果較好需要細(xì)胞增殖移動(dòng)、細(xì)胞外基質(zhì)分泌沉淀、重生新的血管及組織重新組合等密切配合[1]。在最開(kāi)始對(duì)糖尿病創(chuàng)面研究時(shí)，借鑒正常創(chuàng)面的治療方案，后來(lái)發(fā)現(xiàn)糖尿病導(dǎo)致的創(chuàng)面用正常創(chuàng)面治療的方法在治療效果上大相徑庭，因此找到針對(duì)糖尿病造成的創(chuàng)面的治療方法稱為中外醫(yī)學(xué)工作者迫切解決的難題[2]。老年人的比重越來(lái)越大，在中國(guó)乃至全世界糖尿病人都顯著增多，對(duì)患者生活質(zhì)量的享受帶來(lái)了嚴(yán)重的影響，疾病的難治性使患者在治療中有大量的支出，同時(shí)社會(huì)醫(yī)療資源也承受著越來(lái)愈多的壓力。如何提高糖尿病造成的創(chuàng)面治療效果一直是困擾醫(yī)學(xué)工作者的難題，因此越來(lái)越多的人參與到該病的研究中[3]。普通創(chuàng)面由于沒(méi)有高血糖及身體功能代謝紊亂的影響，因此相較糖尿病創(chuàng)傷較為好痊愈。局部循環(huán)失常、創(chuàng)面部位神經(jīng)壞死病變、細(xì)菌感染、細(xì)胞活力消失等都是造成創(chuàng)面難愈合的原因[4]。血液中血清是其組成的重要成分之一，血清中外泌體非常多，因此本文對(duì)血清外泌體促進(jìn)組織再生的機(jī)制進(jìn)行了研究，從而證實(shí)其促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合與修復(fù)的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料用隨機(jī)數(shù)字表法將制備成功的糖尿病SD大鼠創(chuàng)面感染動(dòng)物20只。5周齡，體質(zhì)量在十五到二十克之間，平均質(zhì)量為（17.32）g。

1.2方法（1）血清外泌體的提取及鑒定。1對(duì)小鼠進(jìn)行采血，采血后靜止放置六十分鐘，靜置完成后進(jìn)行離心，離心量為兩千克，0.25小時(shí)后將血清分離。離心兩千克，半小時(shí)后將細(xì)胞碎片去除，將去除后的液體以1毫升為單位分成若干份分別放在其他離心管中。對(duì)離心血清提取外泌體，方法參照賽默飛公司外泌體提取說(shuō)明書(shū)。觀察外泌體的各方面狀態(tài)（利用電子透射顯微鏡）。2Western blot檢測(cè)外泌體的特異性蛋白CD63和HSP70的表達(dá)。用BCA法測(cè)提取的外泌體的濃度，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算蛋白上樣量，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，用TBS/T洗3次，在室溫狀態(tài)下用脫脂奶粉封閉120分鐘，TBS/T洗三次后加入一抗（CD63，1：1000;HSP70，1：1000），將冰箱溫度調(diào)整到四攝氏度，將樣品放置一晚。將一抗回收后，TBS/T洗3次，將相應(yīng)二抗加入，在室溫條件下孵育60分鐘。TBS/T洗三次，顯影、定影。（2）糖尿病SD大鼠動(dòng)物模型的制備。選擇成年、無(wú)任何疾病、SPF級(jí)SD大鼠20只，雄性和雌性各占一半。將鏈脲佐菌素（STZ）通過(guò)大鼠尾巴進(jìn)行靜脈注射，注射量為每千克七十毫克，對(duì)注射小鼠測(cè)量尾靜脈血糖，觀測(cè)頻率為每?jī)商煊^測(cè)一次，一周內(nèi)觀測(cè)兩次。如果血糖濃度超過(guò)22.2mmol/L則糖尿病模型制備成功，將其放入專門(mén)地方進(jìn)行喂養(yǎng)。（3）糖尿病SD大鼠動(dòng)物感染創(chuàng)面模型的建立。實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)將大鼠十五平方厘米的背毛用百分之八的硫化鈉去除。稱取大鼠的體重，根據(jù)體重配置合適劑量的麻醉劑，用百分之零點(diǎn)五的碘伏消毒后注射。將皮膚全層隔開(kāi)割開(kāi)，將兩到三平方厘米的皮膚全層取出，制造創(chuàng)面。將標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌涂抹到創(chuàng)面，間斷縫合，一天后再次用相同藥物處理創(chuàng)面，感染創(chuàng)面大鼠模型制備成功。

1.3觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)方法（1）創(chuàng)面組織VEGF、bFGF：取上清雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)其中VEGF、bFGF水平。（2）創(chuàng)面MVD：對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行血管化監(jiān)測(cè)。（3）創(chuàng)面愈合評(píng)估：對(duì)創(chuàng)面?zhèn)谟蠙z測(cè)。（4）創(chuàng)面愈合觀察：創(chuàng)面愈合率（%）=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究中數(shù)據(jù)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料（x±s）表示，用t進(jìn)行檢驗(yàn)分析。P<0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組創(chuàng)面組織VEGF、bFGF比較實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面組織VEGF、bFGF水平顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2兩組創(chuàng)面MVD比較實(shí)驗(yàn)組CD34陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3兩組創(chuàng)面愈合評(píng)估分別在3、7、14和21天時(shí)用外泌體治療的傷口的大體視圖

2.4兩組創(chuàng)面愈合率比較實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合率顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3討論

如今危害人類(lèi)健康的慢性疾病種類(lèi)不斷發(fā)展，隨著生活的變化糖尿病對(duì)人們的影響程度僅次于腫瘤和心血管疾病，美國(guó)有約2000萬(wàn)的人口因糖尿病而生活痛苦，在糖尿病患者中有大約四分之一的患者創(chuàng)面很難治愈[5]。患者因體內(nèi)一些功能發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能異常、血液粘稠導(dǎo)致阻塞動(dòng)脈以及骨關(guān)節(jié)發(fā)生病變，創(chuàng)面產(chǎn)生的很大一部分原因是因?yàn)橐陨喜l(fā)癥導(dǎo)致的[6]。

外泌體是直徑在二十到一百四十納米的微小囊泡，它是一種多泡體，形成方式為細(xì)胞內(nèi)膜出芽方式，它能夠?qū)⑿畔⒃诟骷?xì)胞間進(jìn)行傳遞，很多的生理病理過(guò)程都與它有關(guān)。組織修復(fù)中外泌體的作用也極其重要，血小板MVB外模內(nèi)陷形成外泌體，血小板質(zhì)膜融合MVB后，將其由胞吐的方式釋放[7]。隨著對(duì)外泌體的不斷鉆研，培養(yǎng)的細(xì)胞類(lèi)型都是可分泌外泌體，在體液中就有外泌體自然存在，如腦脊液、血液中等。隨著對(duì)外泌體的深入了解，組織修復(fù)中運(yùn)用外泌體發(fā)揮了不可替代的作用。EPCs具有游走特性，可促進(jìn)未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞不斷增殖、分化，表面標(biāo)志物的表達(dá)與造血干細(xì)胞相同，可分泌有利于血管生成的的生長(zhǎng)因子。EPCs因可促進(jìn)血管生成以及可修復(fù)局部缺血組織，因此被越來(lái)越多的應(yīng)用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合中。

通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)組在創(chuàng)面組織VEGF及bFGF水平、創(chuàng)面MVD、創(chuàng)面愈合率等指標(biāo)上均優(yōu)于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

綜上所述，人EPCs來(lái)源外泌體修復(fù)糖尿病大鼠皮膚缺損中的應(yīng)用效果顯著，值得推廣。

參考文獻(xiàn)

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基金項(xiàng)目：江蘇大學(xué)臨床發(fā)展基金（JLY20180126）

通信作者：徐寧，E-mail：xuning83@163.com