膠原蛋白/纖維素納米晶體敷料的制備及性能

周姝妤， 許淑琴,2， 梁李園， 陳敬華,2

（江南大學(xué) 1. 藥學(xué)院；2. 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

外科手術(shù)、慢性潰瘍或燒傷后形成的傷口使皮膚的屏障作用遭到嚴(yán)重破壞，伴隨而來的傷口感染和炎癥反應(yīng)將引發(fā)劇烈疼痛，影響傷口愈合，甚至有可能危及患者生命。理想的傷口敷料應(yīng)具有屏障作用：抵抗外源性微生物入侵、保持環(huán)境濕潤(rùn)以及促進(jìn)傷口愈合[1-3]。

膠原蛋白（Col）已被廣泛應(yīng)用于傷口敷料領(lǐng)域。膠原基敷料具有優(yōu)異的生物相容性、良好的生物降解性和弱抗原性，但其較差的力學(xué)強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性和快速生物降解性仍限制著它的應(yīng)用[4-6]。Shinya 等[4]通過冷凍干燥透明質(zhì)酸、表皮生長(zhǎng)因子和膠原混合溶液的方式制備海綿狀敷料，通過紫外光交聯(lián)法提高海綿的力學(xué)強(qiáng)度，該敷料有促進(jìn)血管生成和肉芽組織形成的作用，有利于傷口愈合。Ge 等[5]通過將膠原海綿直接浸入二醛化黃原膠（DXG）-銀納米顆粒（AgNP）水溶液的方式制備了一種抗菌海綿敷料，DXG 有效提高了AgNP 在水中的分散性，并與膠原發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，賦予了敷料形狀記憶的新特性。然而，如何進(jìn)一步提高膠原基敷料的力學(xué)強(qiáng)度并賦予它額外的特性如抗菌性、抗炎性和鎮(zhèn)痛效果仍是目前的研究熱點(diǎn)。

天然纖維素是自然界最豐富的生物質(zhì)之一，用酸水解其無序晶間區(qū)域可以獲得纖維素納米晶須（CNCs）。CNCs 具有高縱橫比、高強(qiáng)度、高生物豐度以及良好的表面可修飾性等特點(diǎn)。自1995 年Favier 等[7-9]發(fā)表以CNCs 作為增強(qiáng)材料制備復(fù)合膜的研究后，CNCs 及其衍生物在該領(lǐng)域引起了極大關(guān)注。Huang 等[10]制備了一種由羧甲基殼聚糖和改性CNCs 制備的自愈合納米水凝膠，CNCs 的大比表面積和縱橫比為水凝膠提供了大量活性交聯(lián)位點(diǎn)，改善了水凝膠的強(qiáng)度，還使其具有快速自愈能力。Shao 等[11]也報(bào)告了一種高彈性且可快速自愈合的納米復(fù)合水凝膠，以馬來酰亞胺化聚乙二醇包裹呋喃基修飾的CNCs，構(gòu)建了一種互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

布洛芬（IBP）作為一種已被廣泛使用的非甾體抗炎藥（NSAID），具有解熱鎮(zhèn)痛和抗炎作用。已有研究證明口服IBP 對(duì)骨關(guān)節(jié)、靜脈性腿部潰瘍和肌肉愈合具有良好的抗炎效果，但該過程會(huì)產(chǎn)生明顯的副作用，如胃腸道損傷和腎功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)[3,12,13]。

本文綜合了CNCs 的表面可修飾性和增強(qiáng)功能、Col 的生物相容性和保濕性以及IBP 的抗炎鎮(zhèn)痛功能，將醛基引入CNCs 表面獲得雙醛化纖維素納米晶須（DACs），利用抽濾制膜的方法，使DACs 表面的醛基和Col 的氨基發(fā)生希夫堿反應(yīng)，最終得到了一種透明且兼具良好力學(xué)性能和生物相容性的Col/DACs-IBP 多層膜，通過緩釋IBP 達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的效果，可應(yīng)用于敷料領(lǐng)域。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

纖維素：湖北化纖集團(tuán)有限公司；Col：無錫貝迪生物工程有限公司；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株（NIH-3T3）：中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM 培養(yǎng)基：Gibco 公司；噻唑藍(lán)（MTT）：Sigma-Aldrich 公司；胎牛血清（FBS）：杭州四季青公司；其他化學(xué)試劑：分析純，國藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司。

1.2 CNCs 與DACs 的制備

CNCs 的制備方法在參考文獻(xiàn)[14]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一定的改進(jìn)，取15 g 纖維素浸沒在200 mL w=30%的硫酸中，在60 ℃下劇烈攪拌8 h。以冷水稀釋反應(yīng)液，離心洗滌沉淀至中性，超聲后再次離心，所得上清液即CNCs 水溶液（w=1.8%）。

參考文獻(xiàn)[15, 16]在避光條件下取2.6 g 高碘酸鈉溶解于200 mL CNCs 水溶液（w=1.0%）中，調(diào)節(jié)體系pH 至3.0，反應(yīng)一定時(shí)間后用乙二醇終止反應(yīng)，將所得產(chǎn)物在去離子水中透析3 d。通過控制反應(yīng)條件（見表1），得到4 種氧化度不同的DACs。

1.3 C/D 膜的制備

取Col 溶解于 0.01 mol/L 的乙酸溶液中，得到Col 溶液（w=0.1%）。取適量IBP 溶解于0.1 mol/L 的NaOH溶液中，制備IBP 溶液（w=0.4%）。將IBP 溶液與CNCs 溶液（w=0.4%）混合，得到CNCs-IBP 混合溶液。通過交替抽濾Col 溶液和CNCs-IBP 混合溶液，制備Col/CNCs-IBP 多層膜。將復(fù)合膜剝離濾膜，在室溫下晾干，命名為C/C-m 膜，m 表示膜層數(shù)。將CNCs 溶液替換為DACs溶液，重復(fù)以上步驟，制備Col/DACs-IBP 多層膜，命名為C/Dn-m 膜，Dn 即D1～D4，m 表示膜層數(shù)。

1.4 測(cè)試與表征

1.4.1 CNCs 與DACs 的結(jié)構(gòu) 原子力顯微鏡（AFM，德國布魯克公司Dimension ICON 型）：將5 μL 樣品（w=0.01%）滴至云母片表面，晾干后觀察；X 射線衍射儀（XRD，德國布魯克公司D8 型）：將樣品凍干后進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試范圍為5°～50°；Zeta 電位及納米粒度分析儀（英國馬爾文公司，Zetasizer nano ZS 型）：將樣品稀釋至w=0.2%，用0.01 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH 為6.0 后進(jìn)行測(cè)定[17]；傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，德國布魯克公司TENSOR II 型）：將樣品凍干，通過衰減全反射法（ATR）進(jìn)行紅外分析，掃描范圍為500～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為32 次，分辨率為4 cm-1。

DACs 氧化度（DO）的測(cè)定基于醛基與鹽酸羥胺的希夫堿反應(yīng)。取0.1 g DACs 于50 mL 鹽酸羥胺的乙酸緩沖液（0.2 mol/L，pH=4.5）中反應(yīng)24 h，使用0.1 mol/L 標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液滴定，以CNCs 作為對(duì)照[18]。DO按照式（1）計(jì)算：

表 1 DACs 的氧化反應(yīng)條件以及對(duì)應(yīng)的氧化度Table 1 Experimental conditions of DACs oxidation reaction and the corresponding degree of oxidation

其中：c0是標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液的濃度（mol/L），V 是標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液的體積（L），m 是樣品的質(zhì)量（g），M 是纖維素的重復(fù)單元葡萄糖環(huán)的相對(duì)分子量質(zhì)量。

1.4.2 C/D 膜的持水性 取樣品濕膜，準(zhǔn)確稱重（ms），放入60 ℃烘箱中干燥至恒重，再準(zhǔn)確稱重（md）。各樣品的持水率（Wc）按照式（2）計(jì)算[19]：

1.4.3 C/D 膜的透光度 采用紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司UV-2550 型）測(cè)量樣品在300～800 nm 處的透光率[20]。

1.4.4 C/D 膜的拉伸強(qiáng)度 采用中國美特斯工業(yè)系統(tǒng)公司CMT8202 型萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)測(cè)試。將樣品裁剪為6.0 cm ×1.0 cm 的長(zhǎng)條，在室溫下測(cè)試樣品的拉伸強(qiáng)度，拉伸速率為0.5 mm/min。

1.4.5 C/D 膜的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu) 將樣品于液氮中浸泡并脆斷，經(jīng)凍干、固定和噴金處理后，在加速電壓5 kV 下采用掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司Hitachi Su 1510 型）觀察其內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。

1.4.6 IBP 的體外釋放 參照文獻(xiàn)[12, 13]，將樣品浸泡于10 mL PBS 溶液（pH=7.4）中，于37 ℃，110 r/min 環(huán)境中振蕩，在一定的時(shí)間間隔取樣，并立即補(bǔ)充等體積的PBS 溶液。使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定釋放液于264 nm處的吸光度，并按照式（3）計(jì)算其在不同時(shí)刻的藥物累計(jì)釋放率（R）。

其中：Ve為取出的釋放液體積（mL）；V0為加入釋放液的總體積（mL）；m 為樣品中IBP 的質(zhì)量（mg）；ci、cn分別為i 時(shí)間點(diǎn)及第n 個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取釋放液中的IBP 質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.4.7 C/D-IBP 膜的生物相容性 通過與NIH-3T3 細(xì)胞的共培養(yǎng)評(píng)價(jià)C/D-IBP 膜的生物相容性。細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)（體積分?jǐn)?shù)為10 %的胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素），培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2。將預(yù)先滅菌的復(fù)合膜放入48 孔板，經(jīng)PBS 溶液清洗和DMEM 培養(yǎng)基浸潤(rùn)后接種細(xì)胞，于第1 天和第3 天分別以MTT 法評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖情況，利用酶標(biāo)儀（美國伯樂公司680 型）測(cè)定570 nm 處的氧化度。

2 結(jié)果與討論

2.1 CNCs 與DACs 的特性以及結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 外觀形貌 在水解反應(yīng)中硫酸的作用下，CNCs 和DACs 表面均呈現(xiàn)了大量羥基和磺酸酯基，這些負(fù)電荷基團(tuán)之間產(chǎn)生強(qiáng)烈靜電排斥作用，使其能穩(wěn)定均勻地分布在水中[8,17]，如圖1 所示。圖2 顯示了CNCs 與不同氧化度DACs 溶液Zeta 電位的變化。CNCs 與D1～D4 溶液的Zeta 電位均為負(fù)值，隨著DACs 氧化度的提高，DACs 溶液的Zeta 電位從-17 mV 逐漸提高至-10 mV，即仍有大量負(fù)電荷被保留在DACs 表面，因此DACs 溶液可通過靜電相互作用保持良好的穩(wěn)定性。CNCs 和D3 的AFM 圖（圖3）顯示，CNCs 和DACs 均呈棒狀。CNCs 長(zhǎng)為（224 ± 64）nm，高為（9 ± 3）nm（統(tǒng)計(jì)數(shù)N=80），均勻分散。D3 長(zhǎng)為（208 ± 30）nm，寬為（9 ± 3）nm（N=80），略小于前者，輕微聚集。圖4 顯示了CNCs 與不同氧化度DACs 的XRD 結(jié)果，CNCs 與DACs 均在14.9°、16.5°和22.7°處出峰，與文獻(xiàn)中的結(jié)果一致[6,21]，但峰形隨著氧化度的提高而明顯減小。這說明氧化反應(yīng)可使DACs 尺寸變小，分布穩(wěn)定性降低，并會(huì)對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的破壞，但通過控制反應(yīng)條件，D1～D4 依然維持了基本的結(jié)晶形態(tài)和良好的分散穩(wěn)定性。

圖 1 CNCs 和D1～D4 水溶液的照片F(xiàn)ig. 1 Photos of CNCs and D1—D4 dispersions

圖 2 CNCs 和D1～D4 水溶液的Zeta 電位Fig. 2 Zeta potential of CNCs and D1—D4 dispersions

圖 3 CNCs 和D3 的AFM 圖Fig. 3 AFM micrographs of CNCs and D3

2.1.2 氧化度 如圖5（a）所示，F(xiàn)T-IR 譜圖中CNCs 在3 400 cm-1處的寬峰歸屬于O―H 伸縮振動(dòng)，2 900 cm-1處的吸收峰歸屬于C―H 伸縮振動(dòng)，1 050 cm-1和1 160 cm-1處的吸收峰與C―O 的伸縮振動(dòng)有關(guān)。在DACs（D1～D4）的譜圖中，1 730 cm-1和889 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，這分別歸因于醛基和半縮醛的形成，表明CNCs 發(fā)生了氧化[9,18,22]。

2.2 C/D 膜的特性以及結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu) 圖5（b）顯示了Col、D4 與C/D4-6

圖 4 CNCs 和D1～D4 的XRD 譜圖Fig. 4 XRD spectra of CNCs and D1—D4

膜的FT-IR 譜圖。C/D4-6 膜在1 730 cm-1處的醛基峰明顯減弱，而1 549 cm-1處出現(xiàn)了―C＝N―的特征峰，這表明DACs 表面的醛基與Col 表面的氨基發(fā)生了希夫堿反應(yīng)，醛基被消耗，而希夫堿鍵形成[6]。此外，圖6 顯示了C/C-6 膜和C/D3-6 膜的多層結(jié)構(gòu)以及層間界面結(jié)構(gòu)。圖6（b，d）的上側(cè)為Col 層，其結(jié)構(gòu)緊密連續(xù)且可見層次結(jié)構(gòu)；圖6（b，d）的下側(cè)分別為CNCs 層和DACs 層，其結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，存在較小孔隙且未見分層。此外，C/C-6 膜的Col 層和CNCs 層界面處存在孔隙，而C/D3-6 膜層間結(jié)合緊密，互相滲透。這表明Col 層和DACs 層發(fā)生的希夫堿反應(yīng)加強(qiáng)了兩者的結(jié)合。

圖 5 CNCs 和D1～D4 的FT-IR 譜圖 （a） 以及Col 和C/D 膜的FT-IR 譜圖（b）Fig. 5 FT-IR spectra of CNCs and D1—D4 （a）, Col and the C/D films （b）

圖 6 C/C-6 膜和C/D3-6 膜的SEM 圖Fig. 6 SEM images of C/C-6 film and C/D3-6 film

2.2.2 持水性 傷口表面過度干燥將引起皮膚的皺縮，因此，具有良好保濕性的敷料更有利于傷口的修復(fù)。本文通過固定Col 和DACs 的質(zhì)量，改變復(fù)合膜的層數(shù)和每層質(zhì)量，探究?jī)烧叻植季鶆蛐砸约癉ACs 氧化度對(duì)其持水性的影響。復(fù)合膜層數(shù)越多，DACs 與Col 接觸面積越大，兩者分布越均勻。如圖7（a）所示，隨著DACs 氧化度的提高，C/Dn-6 膜的持水率逐漸下降，C/D3-6 膜持水率為78.4%，比C/C-6 膜降低了13.3%。這表明隨著氧化度的提高，DACs 的粒徑稍有下降，DACs 層內(nèi)孔隙率下降。此外，DACs 表面更高的醛基密度提高了層間結(jié)合的緊密度，對(duì)Col 層起到壓縮和固定作用，限制了Col 的持水能力，進(jìn)一步降低了復(fù)合膜的持水性。但圖7（b）顯示了DACs 層對(duì)Col 層的這種壓縮和固定作用是相對(duì)有限的，由于Col 在復(fù)合膜中起主要的持水作用，當(dāng)改變D3 與Col 的分布均勻性時(shí)，層數(shù)對(duì)C/D3 膜持水性的影響并不明顯。

圖 7 DACs 氧化度（a）和層數(shù)（b）對(duì)C/D 膜持水性的影響Fig. 7 Effect of degree of oxidation of DACs （a） and the number of layers （b） on the water content of C/D films

2.2.3 透光性 提高敷料的透光性便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)傷口情況。本文探究了DACs 的氧化度以及DACs 和Col 的分布均勻性對(duì)復(fù)合膜透光率的影響。表2 顯示隨著DACs 氧化度和層數(shù)的增加，復(fù)合膜透光性逐漸提高，C/D4-6 的透光率高達(dá)95.7%，相比C/D3-2 提高了13.5%。提高DACs 氧化度以及DACs 和Col 的分布均勻性增強(qiáng)了兩種基質(zhì)的結(jié)合程度，促進(jìn)了復(fù)合膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)均一化，從而提高了透明度。

2.2.4 拉伸強(qiáng)度 圖8 為DACs 氧化度和層數(shù)對(duì)C/D 膜拉伸強(qiáng)度的影響。由圖8 可知，C/D3-4 膜拉伸強(qiáng)度可達(dá)54.2 MPa，分別是C/D1-4 膜和C/D3-2 膜的2.2 倍和2.5 倍，表明提高DACs 和Col 的分布均勻性以及DACs 氧化度均可提高C/D 膜的拉伸強(qiáng)度。當(dāng)層數(shù)從2 增加至4 時(shí)，C/D3 膜的強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，斷裂伸長(zhǎng)率也有稍有增加。

表 2 DACs 氧化度和層數(shù)對(duì)C/D 膜透光率的影響Table 2 Effects of degree of oxidation of DACs and the number of layers on the light transmittance of C/D films

圖 8 DACs 氧化度（a）和層數(shù)（b）對(duì)C/D 膜拉伸強(qiáng)度的影響Fig. 8 Effect of degree of oxidation of DACs （a） and the number of layers （b） on the tensile strength of C/D films

2.2.5 藥物釋放行為 圖9 顯示了IBP 溶液與CNCs 溶液或DACs 溶液混合前后的粒徑分布情況，純CNCs溶液有兩個(gè)峰（58、330 nm），D4 溶液也有兩個(gè)相似的峰（38、267 nm）。而IBP 與CNCs 或D4 的混合溶液的兩個(gè)峰均向大尺寸方向偏移，其中，D4-IBP 水溶液的兩個(gè)峰分別位于56 nm 和390 nm 處，表明IBP 與D4 可能通過非共價(jià)鍵力（氫鍵）作用發(fā)生聚集，導(dǎo)致粒徑變大。而無微米級(jí)顆粒則表明混合溶液具有良好的穩(wěn)定性。溶液中的粒子略有聚集，但CNCs 和DACs 仍維持了良好的分散性，可以認(rèn)為IBP 的加入對(duì)DACs 的穩(wěn)定性無較大影響。

圖 9 樣品的粒徑分布情況Fig. 9 Particle size distribution of samples

在體外藥物釋放測(cè)試中，C/D 膜中的IBP 都在24 h 內(nèi)達(dá)到釋放穩(wěn)定，但24 h 藥物累計(jì)釋放率存在明顯差異（43.8%～91.6%），如圖10 所示。大部分IBP 分布在DACs 層內(nèi)，被上下兩層Col 包裹，形成“三明治結(jié)構(gòu)”。由于Col 層結(jié)構(gòu)緊密，IBP 只能通過擴(kuò)散的方式，緩慢地穿過Col 層到達(dá)傷口表面。因內(nèi)層DACs 中的IBP 需要更長(zhǎng)時(shí)間的滲透才能釋放，DACs 與Col 多層分布的設(shè)計(jì)延長(zhǎng)了IBP 的釋放時(shí)間，可達(dá)到緩釋效果。當(dāng)DACs 氧化度較低時(shí)，隨著氧化度的提高，復(fù)合膜的結(jié)合程度提高，內(nèi)部孔徑縮小，24 h 藥物累積釋放率逐漸降低。但當(dāng)DACs 氧化度高于30%時(shí)（D3，D4），24 h 藥物累積釋放率明顯提高，這是由于復(fù)合膜結(jié)合程度過高，孔隙率大大減小，載藥量大幅下降，導(dǎo)致釋放率明顯提高?？梢姡m當(dāng)降低DACs 氧化度更有利于IBP 的負(fù)載和釋放。

2.2.6 生物相容性 如圖11 所示，當(dāng)細(xì)胞與C/D 膜共培養(yǎng)24 h 時(shí)，其增殖情況均優(yōu)于對(duì)照組，可見該復(fù)合膜有利于細(xì)胞的吸附、生長(zhǎng)和增殖，但該效應(yīng)隨著DACs 氧化度的提高而減弱。當(dāng)共培養(yǎng)至72 h 時(shí)，只有DACs 氧化度低于36.7%的復(fù)合膜（D1，D2）能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，這是由于復(fù)合膜外層的Col 被逐漸降解，大量DACs 被暴露出來，與細(xì)胞表面接觸，對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用?？梢?，C/D 膜表現(xiàn)出良好的生物相容性，在短期傷口覆蓋過程中有利于傷口修復(fù)。

圖 10 DACs 氧化度對(duì)C/D 膜中IBP 釋放行為的影響Fig. 10 Eeffect of degree of oxidation of DACs on the IBP release from C/D films

圖 11 DACs 氧化度對(duì)C/D 膜生物相容性的影響Fig. 11 Eeffect of degree of oxidation of DACs on the biocompatibility of C/D

3 結(jié) 論

（1）采用酸水解法和高碘酸鈉氧化法制得氧化度為8.6%～51.3%的DACs，產(chǎn)物呈棒狀，長(zhǎng)為（208 ± 30 ）nm，寬為（9 ± 3） nm，可在水中穩(wěn)定分散。

（2）通過交替抽濾DACs-IBP 混合溶液和Col 溶液制備C/D 多層膜。相鄰DACs 層的醛基和Col 層的氨基在界面處發(fā)生希夫堿反應(yīng)，形成化學(xué)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

（3）增加C/D 膜的層數(shù)有利于DACs 和Col 的分布趨于均勻化，而提高DACs 的氧化度增強(qiáng)了兩者間的化學(xué)交聯(lián)，使膜的微觀結(jié)構(gòu)更加均一緊密。與CNCs 相比，D3 使復(fù)合膜透光率從86.9%提高到94.3%，持水率從90.4%降至78.4%。最優(yōu)C/D 膜的拉伸強(qiáng)度高達(dá)54.2 MPa。

（4）C/D 膜具有良好的生物相容性，用于短期傷口覆蓋可有效促進(jìn)細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)，有利于傷口修復(fù)。

（5）C/D 膜負(fù)載的IBP 藥物在24 h 內(nèi)緩慢釋放，累計(jì)釋放率可達(dá)89.0%，賦予了該膜抗炎鎮(zhèn)痛的功效。