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      鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤組織中E盒結(jié)合鋅指蛋白2的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系▲

      2020-12-30 08:49:48石書婧翟建華胡小兵喬振花范志濤王建國
      廣西醫(yī)學(xué) 2020年22期
      關(guān)鍵詞:引物病理病例

      石書婧 徐 莉 翟建華 胡小兵 喬振花 劉 曼 范志濤 王建國

      (河北省眼科醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,邢臺市 054000,電子郵箱:shishujing163@163.com)

      鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤(sinonasal inverted papilloma,SNIP)是臨床上常見的良性腫瘤,其發(fā)病率位居鼻腔鼻竇良性腫瘤的首位,具有侵襲性生長、易復(fù)發(fā)等與惡性腫瘤相似的特點[1]。E盒結(jié)合鋅指蛋白(zinc finger E-box-binding homeobox,ZEB)2為ZEB家族中的一員,參與鼻咽癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[2]。但關(guān)于ZEB2在SNIP組織中表達的情況及其與SNIP發(fā)生和發(fā)展關(guān)系的研究較少。本研究檢測了SNIP組織中ZEB2的表達,并分析其與SNIP發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系,旨在為SNIP的診斷、治療和改善患者預(yù)后提供參考。

      1 資料與方法

      1.1 臨床資料 納入2016年1月至2018年1月我院收治的51例SNIP患者(病例組),收集其SNIP組織;另納入20例同期在我院接受鼻中隔偏曲矯正術(shù)的鼻竇炎患者(對照組),收集其增生鼻甲組織。所有病例均經(jīng)病理組織學(xué)確診,所獲標(biāo)本均保存于-80℃環(huán)境;相關(guān)臨床資料記錄完整,包括年齡、性別、臨床分期、復(fù)發(fā)情況、病理分化程度。SNIP組中男性31例、女性20例,年齡23~71歲(中位年齡46歲);對照組中男性11例、女性9例,年齡22~70歲(中位年齡42.5歲)。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

      1.2 主要試劑和儀器 TRIzol試劑(上海Ambion生物科技有限公司,生產(chǎn)批號:50175111)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo 公司,批號:00820439)、PCR反應(yīng)試劑盒為FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(瑞士Roche公司,批號:21966100);7300型熒光定量PCR儀(美國ABI公司),超微量分光光度計(美國Thermo公司)。

      1.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 取50 mg組織標(biāo)本,放入1.5 mL EP管內(nèi)并置于冰上,加入600 μL預(yù)冷(4℃)TRIzol試劑,用眼科剪將組織剪至勻漿狀態(tài)已充分裂解后,嚴(yán)格按照TRIzol試劑說明書抽提組織中的總RNA;獲得組織中的總RNA后,取2 μL,使用超微量分光光度計測定總RNA的質(zhì)量及濃度,以A260/280處于1.8~2.0為宜。取2 μg總RNA,使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA;反應(yīng)體系:2 μg總RNA、1μL Oligo(dT)18引物、4 μL 5×反應(yīng)緩沖液、1μL RiboLock RNase抑制劑(20 U/μL)、2 μL 10 mM dDTP混合液、1 μL RevertAid M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL),加入無核酶水至反應(yīng)體積為20 μL;反應(yīng)程序:42℃ 60 min,70℃ 5 min。

      1.4 檢測ZEB2 mRNA的表達量 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參。采用PCR反應(yīng)試劑盒擴增ZEB2基因。反應(yīng)體系:SYBR GreenⅠ10 μL,cDNA 1 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,雙蒸水7 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃ 變性 15 s,60℃ 退火 30 s,共40個循環(huán)。引物序列由廣州Invitrogen公司合成,GAPDH上游引物為5′-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3′,下游引物為5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′;ZEB2 上游引物為5′-AGTCCTCCCCACACGTGAG-3′,下游引物為5′-TGCGGTCTGGATCGTGGCTTC-3′。反應(yīng)完成后,記錄各樣本的Ct值,采用2-△△ct法計算基因的相對表達量。先計算病例組或?qū)φ战M的△Ct,△Ct =CtZEB2-CtGAPDH;再計算出對照組△Ct的均值△Ct′,分別計算出兩組相對于△Ct′的△△Ct,△△Ct病例組=△Ct病例組-△Ct′,△△Ct對照組=△Ct對照組-△Ct′;最后采用2-△△ct公式計算出兩組ZEB2的相對表達量[3]。

      1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。計量資料以M(P25,P75)表示,組間比較采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié) 果

      2.1 兩組ZEB2基因的表達水平比較 病例組ZEB2基因的相對表達水平為1.199(0.726,2.993),對照組ZEB2基因的相對表達水平為1.000(0.607,1.315)。病例組ZEB2基因的相對表達水平高于對照組(z=-1.969,P=0.049)。

      2.2 病例組患者ZEB2基因表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同性別、年齡、臨床分期以及有無復(fù)發(fā)患者之間ZEB2 mRNA相對表達水平比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。伴惡變患者的ZEB2 mRNA相對表達水平均高于無不典型增生及伴不典型增生患者(P<0.05),而伴不典型增生患者與無不典型增生患者ZEB2 mRNA相對表達水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

      表1 不同臨床病理特征病例組患者ZEB2 mRNA相對表達水平比較[M(P25,P75)]

      3 討 論

      SNIP是一種源于鼻腔、鼻竇施耐德氏上皮細(xì)胞的良性腫瘤,占所有鼻腔腫瘤的0.5%~4%;盡管SNIP是一種組織學(xué)良性病變,但其具有侵襲性生長、局部破壞性較強、易復(fù)發(fā)和惡性轉(zhuǎn)化等特點[4]。通常認(rèn)為人類乳頭瘤病毒感染參與了SNIP的進展,其他可能的病因還包括長期炎癥刺激、上皮化生、變態(tài)反應(yīng)以及種族因素等[5]。然而,SNIP的惡性轉(zhuǎn)化過程涉及的組織形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)過程和生物標(biāo)志物等仍不清楚。因此,探索SNIP惡性轉(zhuǎn)化的分子機制十分重要。

      腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多基因、多層次、多步驟的復(fù)雜調(diào)控過程。研究表明,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在腫瘤侵襲、組織穩(wěn)態(tài)和纖維化等方面發(fā)揮著重要作用。EMT促進腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移的機制為:EMT可降低腫瘤細(xì)胞間黏附力,增強其運動遷移能力,使腫瘤細(xì)胞更易脫離原發(fā)灶進入循環(huán)系統(tǒng)而引起遠處轉(zhuǎn)移[6]。EMT與ZEB2的關(guān)系密切,ZEB2的高表達與EMT、多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。研究表明,ZEB2可通過抑制E-鈣粘連蛋白并誘導(dǎo)EMT來促進腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。Zhao等[8]的研究表明,Src通過蛋白激酶信號通路上調(diào)ZEB1和ZEB2水平,促進胃癌細(xì)胞的EMT和遷移,這提示ZEB1和ZEB2的上調(diào)與胃癌的EMT和遷移有關(guān)。易翔等[9]的研究表明,在鼻咽癌組織中ZEB2的表達升高而E-鈣粘連蛋白的表達下降,兩者的表達呈明顯負(fù)相關(guān),且共同參與了鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過程,其可能機制與ZEB2下調(diào)E-鈣粘連蛋白的表達促進細(xì)胞EMT有關(guān)。Pan等[10]發(fā)現(xiàn),雙微體2癌基因結(jié)合蛋白可通過上調(diào)ZEB2表達以誘導(dǎo)EMT過程,從而促進非小細(xì)胞肺癌的侵襲。本研究結(jié)果顯示,SNIP組織ZEB2基因表達水平高于對照組組織,且伴惡變的SNIP組織ZEB2基因表達水平高于有或無不典型增生的SNIP組織(P<0.05),即SNIP的病理分期越高,ZEB2基因表達水平也越高,這說明ZEB2基因的高表達不僅可能參與了SNIP的發(fā)生,還可能與其病理分期密切相關(guān),或許能夠影響疾病的預(yù)后。結(jié)合以上研究,我們認(rèn)為ZEB2在SNIP的發(fā)展、惡變演變過程中起到一定作用,可反映SNIP侵襲惡變的生物學(xué)行為。

      綜上所述,SNIP組織中ZEB2的表達升高,其表達水平可能與病理分化程度有關(guān)。ZEB2可能與SNIP的發(fā)生及惡變以及增殖、侵襲相關(guān),或可作為SNIP的生物標(biāo)志物。檢測SNIP組織中ZEB2的表達,或有利于指導(dǎo)臨床的診斷、治療和改善預(yù)后。SNIP的復(fù)發(fā)率較高,但本研究未顯示ZEB2的表達與SNIP的復(fù)發(fā)相關(guān),考慮與本研究的樣本量較少有關(guān),今后需進一步擴大樣本量進行研究。

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