基質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響及相關(guān)分子機(jī)制▲

張 亞 楊英捷

(貴州省腫瘤醫(yī)院婦瘤外科，貴陽市 550000，電子郵箱：howardfine@163.com)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，浸潤和轉(zhuǎn)移是造成卵巢癌高死亡率的主要原因，其中卵巢癌的轉(zhuǎn)移主要通過直接擴(kuò)散的方式轉(zhuǎn)移至腹腔，不依賴于血管和淋巴管。最新研究表明，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與腫瘤-宿主微環(huán)境的平衡狀態(tài)密切相關(guān)，上皮惡變和間質(zhì)轉(zhuǎn)化的交互作用共同決定了腫瘤的進(jìn)展[1]。腫瘤受到由癌細(xì)胞、基質(zhì)成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)組成的獨(dú)特微環(huán)境的影響[2]，其中基質(zhì)成纖維細(xì)胞是腹腔網(wǎng)膜中的第二大類型細(xì)胞。既往研究顯示，基質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子作用于癌細(xì)胞，其自身在各種類型的腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮重要作用[3]。轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞擴(kuò)散后在遠(yuǎn)處的生長(zhǎng)，稱為“轉(zhuǎn)移定植”，這一過程對(duì)手術(shù)去瘤后殘留的微小腫瘤的存活至關(guān)重要[4]。然而，在網(wǎng)膜組織微環(huán)境中，基質(zhì)成纖維細(xì)胞如何促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移定植的分子機(jī)制尚不清楚。本研究針對(duì)基質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行了初步觀察，以便全面地了解基質(zhì)成纖維細(xì)胞在卵巢癌轉(zhuǎn)移定植中的作用，為進(jìn)一步研究基質(zhì)成纖維細(xì)胞調(diào)控卵巢癌的進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料和細(xì)胞 收集無菌條件下切取的卵巢轉(zhuǎn)移癌組織24例，所有標(biāo)本均新鮮、完整，包含上皮組織及其鄰近結(jié)締組織，均經(jīng)臨床和病理學(xué)證實(shí)。人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3、基質(zhì)成纖維細(xì)胞WI38購自中國科學(xué)院細(xì)胞中心。杜氏改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)、RNA提取試劑TRIzol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品(批號(hào)：C10268951、15596-026)；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、PCR Taq酶、SYBR Premix Ex Taq購于日本TaKaRa公司(批號(hào)：9068-38-6、47001-3D、A3701)，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(transforming growth factor α,TGF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司(批號(hào)：E-EL-H0059C、E-EL-H0102C、E-EL-H1586C)，四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑、二喹啉甲酸蛋白測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、電化學(xué)發(fā)光液購于碧云天生物技術(shù)研究所(批號(hào)：C0009、P0012S、P0013B、P0018S)，小鼠抗人TGF-α抗體、兔抗人表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體、生物素標(biāo)記的羊抗小鼠均購于英國Abcam 公司(批號(hào)：ab32536、ab78901、ab54378、ab87612)。

1.2 條件培養(yǎng)基的收集及細(xì)胞培養(yǎng) 將卵巢癌細(xì)胞SKOV-3和基質(zhì)成纖維細(xì)胞WI38分別加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放在37℃、5%二氧化碳、相對(duì)濕度為90%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；收集卵巢癌細(xì)胞SKOV-3和基質(zhì)成纖維細(xì)胞WI38培養(yǎng)24 h后的條件培養(yǎng)基，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ÷殉舶┘?xì)胞SKOV-3以3×103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁之后分別更換上述條件培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳、相對(duì)濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，將卵巢癌細(xì)胞系條件培養(yǎng)基及經(jīng)其處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，基質(zhì)成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基及經(jīng)其處理的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。

1.3 條件培養(yǎng)基對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3增殖作用的影響 分別于條件培養(yǎng)基處理24 h、48 h、72 h后，收集卵巢癌細(xì)胞SKOV-3，采用MTT法檢測(cè)培養(yǎng)板中SKOV-3細(xì)胞的增殖情況，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。通過Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣本吸光度(A值)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)條件培養(yǎng)基處理后卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中EGFR mRNA表達(dá)水平 使用TRIzol裂解收集條件培養(yǎng)基處理24 h后的卵巢癌SKOV-3細(xì)胞，采用酚-氯仿抽提法提取細(xì)胞總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μg，隨機(jī)引物1 μL，反應(yīng)緩沖液1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，dNTP 1 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：65℃ 5 min，42℃ 1 h，70℃ 5 min。通過CFX96型定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)水平。EGFR基因引物序列：上游5′-AAACCGGACTGAAGGAGCTG-3′，下游5′-CCCATTGGGACAGCTTGGAT-3′；以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，引物序列：上游5′-AAGAGAGGCATCCTCACCCT-3′，下游5′-GGAAGGAAGGCTGGAAG-3′。引物均由上海生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(共20 μL)：2×SYBR Green Mix 10 μL，ROX 0.4 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，雙蒸水7.0 μL，cDNA 1.0 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min 45 s，然后94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后72℃充分延伸5 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 免疫印跡技術(shù)檢測(cè)條件培養(yǎng)基處理后卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中EGFR蛋白表達(dá)水平 收集條件培養(yǎng)基處理24 h后的卵巢癌SKOV-3細(xì)胞，使用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，按照二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒說明書檢測(cè)總蛋白濃度。取80 μg蛋白經(jīng)10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜 15 min(洗滌3次，5 min/次)。加入兔抗EGFR抗體(1 ∶500)，4℃過夜，TBST洗膜(洗滌3次，5 min/次)后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(1 ∶5 000)二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜(洗滌3次，5 min/次)后滴加電化學(xué)發(fā)光液顯色，凝膠成像儀(美國 Bio-Rad 公司)曝光，使用Image J軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 條件培養(yǎng)基中細(xì)胞因子EGF、IL-6及TGF-α水平的檢測(cè) 分別收集卵巢癌細(xì)胞SKOV-3和基質(zhì)成纖維細(xì)胞WI38培養(yǎng)24 h后的條件培養(yǎng)基，4 000 r/min離心5 min除去細(xì)胞碎片，收獲上清用于檢測(cè)。采用ELISA法檢測(cè)EGF、IL-6、TGF-α水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢癌組織TGF-α和EGFR的表達(dá) 每例病例選取3張相鄰腫瘤組織切片，分別進(jìn)行TGF-α、EGFR抗原免疫組織化學(xué)染色和蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。免疫組織化學(xué)染色：經(jīng)脫蠟、水化、微波抗原修復(fù)后，3%過氧化氫緩沖液室溫孵育15 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次(10 min/次)，山羊血清室溫封閉30 min封閉非特異性背景染色；分別滴加小鼠抗人TGF-α抗體(1 ∶100)和兔抗人EGFR抗體(1 ∶100)，4℃孵育過夜；磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次(10 min/次)；分別滴加生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG或生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育30 min；磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次(10 min/次)，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min；磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次(10 min/次)，二氨基聯(lián)苯胺液顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。對(duì)照組一抗以磷酸緩沖鹽溶液替代。根據(jù)著色情況及著色百分率，參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行分析。陽性細(xì)胞為棕褐色，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，著色百分率<5%為陰性，5%～25%為弱陽性，26%～50%為中度陽性，>50%為強(qiáng)陽性。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩樣本獨(dú)立t或t′檢驗(yàn)；相關(guān)性分析使用Spearman秩相關(guān)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 條件培養(yǎng)基對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3增殖作用的影響 在干預(yù)后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組SKOV-3細(xì)胞的活力均高于對(duì)照組(均P<0.05)。見表1及圖1。

圖1 光鏡下觀察各時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞的增殖情況

2.2 條件培養(yǎng)基處理后卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中EGFR mRNA及蛋白表達(dá)水平 條件培養(yǎng)基處理24 h后，實(shí)驗(yàn)組SKOV-3細(xì)胞中EGFR mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，其中實(shí)驗(yàn)組SKOV-3細(xì)胞EGFR mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組的3.55倍。見表2和圖2。

表2 兩組卵巢癌SKOV-3細(xì)胞EGFR mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

圖2 兩組卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中EGFR蛋白的表達(dá)情況

2.3 條件培養(yǎng)基中細(xì)胞因子EGF、IL-6及TGF-α水平的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組條件培養(yǎng)基中TGF-α的水平高于對(duì)照組(P<0.05)，但兩組的EGF、IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 兩組培養(yǎng)基細(xì)胞因子EGF、IL-6及TGF-α水平比較(x±s,ng/mL)

2.4 卵巢轉(zhuǎn)移癌組織中TGF-α和EGFR的表達(dá)情況及其相關(guān)性 TGF-α和EGFR在卵巢轉(zhuǎn)移癌組織中均呈高表達(dá)(見圖3)，兩者的陽性表達(dá)情況呈正相關(guān)性(rs=0.812,P<0.001)。見表4及圖3。

表4 卵巢轉(zhuǎn)移癌組織中TGF-α和EGFR表達(dá)情況[n(%)]

圖3 卵巢轉(zhuǎn)移癌組織免疫組織學(xué)及HE染色結(jié)果

3 討 論

間質(zhì)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境在腫瘤形成發(fā)展過程中扮演重要的角色[6]。腫瘤細(xì)胞的間質(zhì)微環(huán)境顯著特征包括：基質(zhì)成分改變，炎性細(xì)胞增多，微血管密度增加，出現(xiàn)活化的成纖維細(xì)胞[7]。間質(zhì)中活化的成纖維細(xì)胞通過分泌多種可溶性因子，上調(diào)金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的表達(dá)，并降解和重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[8]。事實(shí)上，已有體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，基質(zhì)成纖維細(xì)胞可以顯著刺激前列腺癌上皮細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。Lebret等[10]發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基的一個(gè)突出作用就是通過旁分泌機(jī)制刺激乳腺癌細(xì)胞的增殖。然而有關(guān)基質(zhì)成纖維細(xì)胞在卵巢癌轉(zhuǎn)移定植中的作用仍然不甚清楚。因此，本研究探討了基質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響，并初步分析旁分泌TGF-α/EGFR信號(hào)軸在這一過程中的作用。

EGFR是一種重要的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，對(duì)穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境具有重要作用，其介導(dǎo)的信號(hào)可調(diào)控細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，誘發(fā)腫瘤血管生成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力[11]。在胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中均存在EGFR表達(dá)異常的現(xiàn)象[12]。Zhang等[13]的研究表明，在婦科腫瘤如宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌及乳腺癌中均可見EGFR的高表達(dá)，而卵巢癌中EGFR的陽性率高達(dá)78.7%[14]。高表達(dá)或異常表達(dá)的EGFR引起下游信號(hào)通路的激活，將增殖分裂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，從而改變細(xì)胞生長(zhǎng)特性并促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化；同時(shí)，EGFR還與卵巢癌分期密切相關(guān)，惡性程度越高則EGFR表達(dá)水平越高[15]，進(jìn)一步證實(shí)EGFR可以作為判斷卵巢腫瘤惡性程度的一個(gè)參考指標(biāo)。另外，有臨床研究表明，EGFR靶向藥物吉非替尼可以顯著抑制異種移植模型中卵巢癌的腹腔內(nèi)播散或腹膜轉(zhuǎn)移，表明EGFR對(duì)卵巢癌細(xì)胞的腹膜轉(zhuǎn)移定植至關(guān)重要[16]。本研究中，經(jīng)基質(zhì)成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理的卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的活力升高(P<0.05)，說明基質(zhì)成纖維細(xì)胞可能通過旁分泌方式促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖；且經(jīng)基質(zhì)成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理的卵巢癌SKOV-3細(xì)胞EGFR mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平增高(P<0.05)，說明基質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用可能與EGFR的激活密切相關(guān)。

EGFR的活化依賴于配體的結(jié)合，TGF-α是EGFR的配體之一。通過自分泌TGF-α并激活EGFR下游信號(hào)是卵巢癌調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲的主要機(jī)制之一[17]。然而，既往研究顯示，卵巢癌細(xì)胞中TGF-α呈低水平表達(dá)[18]，說明癌細(xì)胞自分泌TGF-α不是促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移定植的關(guān)鍵因素。既然基質(zhì)成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖并活化EGFR，那么卵巢癌細(xì)胞極有可能接受基質(zhì)成纖維細(xì)胞來源的TGF-α的調(diào)控，促進(jìn)自身存活和轉(zhuǎn)移定植。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組條件培養(yǎng)基中TGF-α的水平升高(P<0.05)，提示基質(zhì)成纖維細(xì)胞可能通過分泌TGF-α促進(jìn)EGFR活化；我們進(jìn)一步在卵巢轉(zhuǎn)移癌組織中檢測(cè)到TGF-α和EGFR的陽性表達(dá)情況呈正相關(guān)性(P<0.05)，這進(jìn)一步說明旁分泌TGF-α/EGFR信號(hào)軸在基質(zhì)成纖維細(xì)胞促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移定植中的關(guān)鍵作用。

綜上所述，基質(zhì)成纖維細(xì)胞通過旁分泌方式促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，從而參與卵巢癌的轉(zhuǎn)移定植，而旁分泌TGF-α/EGFR信號(hào)軸在其中發(fā)揮重要作用，這一結(jié)果或可為以后深入研究卵巢癌轉(zhuǎn)移定植機(jī)制提供參考。