宮頸癌患者癌組織中CD49f的表達量及其對免疫指標水平和不良生存結(jié)局的影響

任曉紅 楊文婷 鄭鵬生,3

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院1 醫(yī)學(xué)部，2 生殖醫(yī)學(xué)科，陜西省西安市 710061，電子郵箱：xianrenxiaoh@163.com；3 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室,陜西省西安市 710061)

了解腫瘤異質(zhì)性如何介導(dǎo)人類癌癥的進展，是癌癥生物學(xué)的一個持續(xù)性挑戰(zhàn)[1]，特別是關(guān)于上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)與化學(xué)抗性的關(guān)聯(lián)，以及腫瘤異質(zhì)性的階段特異性作用，均是目前很難理解的現(xiàn)象。對于人宮頸癌細胞中已被鑒定出來的特定亞組包括CD49f (+)細胞，一些研究者已經(jīng)建議將其作為腫瘤起始細胞[2-3]。CD49f可在正常宮頸基底層表達，甚至可存在于宮頸上皮內(nèi)瘤變的宮頸上皮的上層[3]。CD49f已被證明與腫瘤的侵襲性有關(guān)，是一種可能導(dǎo)致集體侵襲的基底細胞的標志物[4-5]。本研究分析宮頸癌患者癌組織CD49f的表達情況，以及其對免疫指標、生存結(jié)局的影響，以期為宮頸癌的臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2013年1～12月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的50例宮頸癌患者作為宮頸癌組。納入標準：(1)宮頸癌診斷符合《宮頸癌診斷與治療指南(第四版)》[6]的診斷標準；(2)年齡40～50周歲；(3)入組前未接受其他治療；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)有其他惡性腫瘤病史；(2)合并其他重大影響生存疾病的患者。50例宮頸癌患者中，按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)標準分期，其中Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期各9(18.0%)、18(36.0%)、17(34.0%)、6(12.0%)；鱗癌、腺癌、腺鱗癌各32(64.00%)、17(34.00%)、1(2.00%)；中、高分化為32例(64.00%)，低分化18例(36.00%)；腫瘤直徑<3 cm共21例(42.00%)，≥3 cm共29例(58.00%)；盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例(32.00%)；HPV分型16/18雙陽性共29例(58.00%)。并選擇50例因各種宮頸良性病變行宮頸活檢術(shù)的患者作為對照組。兩組患者的年齡、身高、體重以及吸煙史、飲酒史比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意。

表1 兩組患者一般資料的比較

1.2 宮頸癌治療方法 參照《宮頸癌診斷與治療指南(第四版)》[6]，根據(jù)宮頸癌患者的分期，采取手術(shù)+放療的方法進行治療。

1.3 免疫組化法檢測組織中CD49f蛋白的表達 收集研究對象手術(shù)切除的宮頸病變組織，經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，烤箱65℃烤片4 h。然后采用二甲苯脫蠟，乙醇脫水，高pH抗原修復(fù)液修復(fù)抗原。自然冷卻后，取出切片，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗3次，3%過氧化氫封閉20 min，PBS沖洗3次。將羊血清與PBS充分混勻后，滴于切片上。將CD49f抗體(Thermo Fisher公司，批號：710209；比例為1 ∶500)滴加在切片上，置于4℃過夜。滴加生物素標記的二抗(北京中山生物技術(shù)有限公司，批號：07051521；比例為1 ∶200)，PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，乙醇脫水，二甲苯透明。免疫組化染色陽性反應(yīng)為黃-棕褐色顆粒，首先在低倍鏡下(100×)觀察選擇有代表性的區(qū)域，然后在高倍鏡下(400×)計數(shù) 500～1 000個腫瘤細胞；采用半定量積分法判斷結(jié)果：陽性細胞數(shù)<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；陽性強度以多數(shù)細胞的陽性著色程度為準，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以上述兩個積分相乘為最終得分，0～5分為陰性(-)，6～12 分為陽性(+)[7]。

1.4 實時熒光定量PCR 檢測組織中CD49f mRNA的表達 取手術(shù)切除宮頸病變組織，采用總RNA抽提試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司，批號：252250AX)提取RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國GeneCopoeia公司，批號：CO2011A)將RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，GAPDH正向引物為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，反向引物為5′-TGCACCACCAACTGTTAGC-3′；CD49f正向引物為5′-ATGCACGCGGATCGAGTTT-3′ ，反向引物為 5′-TTCCTGCTTCGTATTAACATGCT-3′。引物由金斯瑞公司合成，SYBER Green Master Mix試劑購自美國Invitrogen公司(批號：4367659)。配置PCR反應(yīng)體系(上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，SYBER Green Master Mix 10 μL，cDNA 3 μL及無核酸酶水5.8 μL)，混勻后進行PCR擴增，反應(yīng)條件具體如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s ，60℃復(fù)性及延伸30 s ，40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt法[8]計算。

1.5 免疫指標的檢測 開始治療前取兩組患者全血5 mL，各分為兩管，待用于檢測免疫指標，主要包括血清免疫抑制酸性蛋白(immunosuppressive acidic protein，IAP)、T淋巴細胞亞群(包括CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞)、自然殺傷細胞(CD16+CD56+)。其中一管采用無菌肝素抗凝，置于-80℃保存，用貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司CytoFLEX LX型流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群和自然殺傷細胞；另一管在1 h內(nèi)以2 000 r/min離心20 min分離血清并置于-80℃保存，用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清IAP；IAP試劑盒由杭州江萊檢測中心提供(批號：JL12703)，按照說明書進行操作。

1.6 隨訪 隨訪起始時間為患者治療第1天，終止時間為2019年1月1日；終點事件為死亡。通過查閱宮頸癌患者的病歷資料、電話詢問、門診隨訪等方式隨訪，隨訪內(nèi)容主要為患者目前生存狀態(tài)及返院復(fù)查情況等。失訪的患者按照最后一次隨訪時間來計算。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t或t′檢驗；采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析CD49f mRNA表達水平與免疫指標表達水平的相關(guān)性；采用Cox模型分析影響宮頸癌患者生存的相關(guān)因素。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組宮頸組織中CD49f的表達水平的比較 宮頸癌組、對照組的CD49f蛋白陽性率分別為42.0%(21/50)和12.0%(6/50)，CD49f mRNA的相對表達量分別為0.32±0.16、0.24±0.08；宮頸癌組的CD49f蛋白陽性率及CD49f mRNA相對表達量均高于對照組(χ2=11.416，P<0.001；t=3.162，P=0.002)。見圖1。

圖1 CD49f蛋白在對照組和宮頸癌組中的表達(免疫組織化學(xué)染色，400×)

2.2 兩組血清免疫指標水平的比較 與對照組比較，宮頸癌組血清CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞水平以及CD4+/CD8+比值降低，CD8+T淋巴細胞、自然殺傷細胞以及IAP水平上升(均P<0.05)。見表2。

2.3 宮頸癌患者癌組織中CD49f mRNA相對表達量與血清免疫指標水平的相關(guān)性 宮頸癌患者的癌組織CD49f mRNA相對表達量與血清IAP水平、CD8+T淋巴細胞水平、自然殺傷細胞水平呈正相關(guān)(r=0.660，P=0.037；r=0.505，P=0.022；r=0.480，P=0.040)，與CD3+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞水平均呈負相關(guān)(r=-0.451，P=0.044；r=-0.526，P=0.019)。

表2 兩組血清免疫指標水平的比較(x±s)

2.4 宮頸癌患者生存情況的影響因素

2.4.1 隨訪結(jié)果：隨訪12～187個月，中位隨訪時間20個月，隨訪期間死亡1例(腺鱗癌)。

2.4.2 單因素分析：以年齡、身高、體重、吸煙及飲酒情況、家族史、病理參數(shù)及CD49f mRNA表達量作為自變量，引入Cox模型進行單因素分析，變量賦值見表4。結(jié)果顯示，腫瘤直徑、FIGO分期、腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CD49f mRNA相對表達量均是宮頸癌患者生存的影響因素(均P<0.05)。見表4。

表3 變量賦值

表4Cox單因素分析

變量b值SE值Wald χ2值P值RR值(95%CI)年齡0.0240.2840.0070.9331.024(0.587,1.786)身高0.1460.2400.3700.5431.157(0.723,1.852)體重0.2800.1952.0510.1521.323(0.902,1.940)吸煙0.7190.4892.1610.1422.052(0.787,5.350)飲酒0.2050.2920.4950.4821.228(0.693,2.176)有家族史0.6600.4072.6270.1051.934(0.871,4.294)腫瘤分化程度-1.044 0.12866.741<0.001 0.352(0.274,0.452)病理類型0.3290.2012.6620.1031.389(0.936,2.061)腫瘤直徑0.2290.03542.014<0.001 1.257(1.173,1.347)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 0.8320.2709.5040.0022.298(1.354,3.900)FIGO分期1.1030.23621.813<0.001 3.014(1.897,4.789)CD49f mRNA相對表達量0.5660.07655.480<0.001 1.762(1.518,2.045)

2.4.3 多因素分析：將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的變量引入Cox模型進行多因素分析；結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、腫瘤直徑、FIGO分期、CD49f mRNA相對表達量均是宮頸癌患者生存的獨立影響因素(均P<0.05)。見表5。

表5Cox多因素分析

變量b值SE值Wald χ2值P值RR值(95% CI)腫瘤分化程度-0.448 0.1558.397 0.0040.639(0.472,0.865)腫瘤直徑0.2740.05029.870<0.0011.315(1.192,1.451)CD49f mRNA相對表達量0.4660.1776.948 0.0081.594(1.127,2.254)FIGO分期0.6030.14816.720<0.0011.828(1.369,2.441)

3 討 論

整合素α6亞單位又稱為CD49f，是已知在干細胞群體和體細胞如角質(zhì)形成細胞、血小板、上皮細胞和角膜基底細胞中被鑒定出來的蛋白質(zhì)[9-10]。自該整合素家族的亞基在1998年首次被鑒定出來后，已在超過30種干細胞群中發(fā)現(xiàn)存在CD49f的表達，其中包括多功能干細胞以及腫瘤干細胞[11]。

大多數(shù)腫瘤內(nèi)的不同細胞群具有自我更新和分化成新腫瘤細胞的潛力，因此被稱為腫瘤起始細胞或腫瘤干細胞。在膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤干細胞中，CD49f被認為是自我更新、增殖和腫瘤形成能力的重要調(diào)節(jié)因子[12]。在宮頸癌細胞中，CD49f主要來自4個不同的腫瘤干細胞群：HeLa、SiHa、Ca Ski、C-4-I。與單層培養(yǎng)的親代細胞系相比，從球狀體獲得的CD49f顯示出了自我更新的特性，這一特性增強了其致癌能力以及對電離輻射的抗性[13-14]。當患者免疫力低下時，CD49f則更加容易表達[15]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組癌組織的CD49f蛋白陽性率及mRNA相對表達量均高于對照組(均P<0.05)，這提示在宮頸癌患者中CD49f呈高表達。此外，我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，宮頸癌組血清CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞水平以及CD4+/CD8+比值降低，CD8+T淋巴細胞、自然殺傷細胞以及IAP水平上升(P<0.05)；同時，宮頸癌患者CD49f mRNA表達水平與血清IAP水平、CD8+T淋巴細胞水平、自然殺傷細胞水平呈正相關(guān)，而與CD3+和CD4+T淋巴細胞水平均呈負相關(guān)(P<0.05)。這提示在宮頸癌患者中，CD49f的高表達可觸發(fā)特異性CD8+毒性T細胞的活化，而抑制CD3+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞活化。

既往的研究已經(jīng)證實，很多生物學(xué)物質(zhì)的高表達與宮頸癌的不良預(yù)后有關(guān)。例如，羅舒等[16]的研究表明，宮頸癌組織中DNA(胞嘧啶-5)-甲基轉(zhuǎn)移酶1[DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 1,DNMT1] 陽性細胞率顯著高于正常組織及癌旁組織；且隨著癌組織中 DNMT1 陽性細胞百分率的提高，宮頸癌的結(jié)局變得更差。侯立春等[17]的研究也表明，醌氧化還原酶1 蛋白高表達可能是評估宮頸癌預(yù)后不良的生物學(xué)指標。但是，目前尚無有關(guān)CD49f與宮頸癌的不良預(yù)后的研究。本研究Cox回歸分析結(jié)果顯示，在排除其他的混雜因素后，CD49f mRNA的表達水平與患者的生存情況有關(guān)，其表達水平越高，患者死亡風險越高(P<0.05)。

然而，本研究存在一定的局限性：首先，對于CD49f與免疫指標的關(guān)系，我們只選取了一部分指標進行分析，其他免疫指標是否有這樣的相關(guān)性，需要進一步研究才能確認。其次，宮頸癌組的樣本量較少，在生存率方面的統(tǒng)計會存在較大的誤差，需要大樣本來佐證宮頸癌患者CD49f高表達與患者不良生存結(jié)局的相關(guān)性。

總之，宮頸癌患者癌組織中CD49f呈高表達，其或可導(dǎo)致患者的免疫指標水平出現(xiàn)異常，且是影響患者生存結(jié)局的因素之一。