壞死桿菌白細胞毒素的研究進展

肖佳薇，蔣劍成，賀顯晶，汪鋒鋒，王麗娜，郭東華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院/黑龍江省牛病防制重點實驗室，黑龍江 大慶 163319）

壞死桿菌（Fusobacterium necrophorum）是一種革蘭氏陰性嚴(yán)格厭氧菌，是與壞死性感染有關(guān)的機會性病原體，可引起牛、羊和人等非常嚴(yán)重甚至致命的疾病。壞死桿菌能夠獨立引起感染，也能與其它病原體（尤其是化膿曲霉菌和利氏卟啉單胞菌）協(xié)同感染[1-2]。壞死桿菌會直接或間接引起反芻動物的肝膿腫、腐蹄病、乳腺炎及子宮內(nèi)膜炎，這些疾病在臨床上極大增加了反芻動物的淘汰率，導(dǎo)致經(jīng)濟損失慘重。壞死桿菌在人感染的臨床病例為Lemierre's綜合征[3]，Lemierre's 綜合癥的主要癥狀為頸內(nèi)及面部血栓性靜脈炎，是一種罕見的綜合征[4-5]，在全球發(fā)病率為1/1 000 000[6]。壞死桿菌是人胃部及扁桃體正常菌群的一部分，與扁桃體炎和膿腫有關(guān)[7]。近期研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸腫瘤中含有壞死桿菌，這種細菌可以使腸癌的臨床癥狀明顯加重[8-9]。壞死桿菌很難穿透完整的粘膜表面，有人認為，短暫感染相關(guān)的粘膜和全身免疫抑制可能有助于壞死桿菌的感染[7]。

壞死桿菌能分泌很多種毒力因子，典型的毒力因子有白細胞毒素（Leukotoxin）[10]、脂多糖（LPS）、溶血素、血凝素[11]、真皮壞死毒素[12]、粘附素、血小板聚集因子和幾種胞外酶，如蛋白酶和脫氧核糖核酸酶[13]。白細胞毒素在壞死桿菌致病中發(fā)揮主要作用，壞死桿菌白細胞毒素是外分泌毒力因子和保護性抗原，對反芻動物的中性粒細胞、巨噬細胞、肝細胞甚至是瘤胃上皮細胞均有較強損傷，并且能介導(dǎo)機體產(chǎn)生抵抗壞死桿菌感染的特異性免疫反應(yīng)[14-15]。北美國家關(guān)于大角羊腐蹄病的報道中，建立設(shè)計針對白細胞毒素基因的PCR 方法，用于幾個地區(qū)大角羊壞死桿菌感染診斷[16]；印度喀什米爾草原綿羊腐爛蹄組織進行靶向白細胞毒素基因和16S rRNA 測序用于壞死桿菌診斷[17]。白細胞毒素不僅在牛源壞死桿菌中是一種重要的毒力因子，而且在人源壞死桿菌上普遍存在，近期針對人感染的10 株壞死桿菌分離株中，均發(fā)現(xiàn)有白細胞毒素基因存在，并有3 株白細胞毒素基因發(fā)生突變，由此證明白細胞毒素廣泛存在于人與牛的壞死桿菌中，為壞死桿菌的致病機制研究奠定基礎(chǔ)[18]。

1 壞死桿菌白細胞毒素致病機制

白細胞毒素是一種高分子量外分泌蛋白（336 ku），通過激活多形核白細胞（PMN）和誘導(dǎo)牛免疫效應(yīng)細胞凋亡以及對反芻動物PMNs 的細胞毒性來調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)[13,19]。天然的白細胞毒素具有很強的致病力，其活性可受多種因素影響，在厭氧條件下培養(yǎng)9 h 白細胞毒素分泌量可到達峰值，反復(fù)凍融或添加多粘菌素均會使白細胞毒素活性顯著降低[20]。白細胞毒素損傷作用具有劑量依賴性[21]，低濃度可激活中性粒細胞和巨噬細胞，誘導(dǎo)肥大細胞釋放組胺，抑制有絲分裂原介導(dǎo)的淋巴增殖[22]，導(dǎo)致機體釋放促炎性細胞因子；高濃度時則通過外在和內(nèi)在機制導(dǎo)致牛白細胞凋亡，細胞腫脹并最終壞死[21, 23-24]。

壞死桿菌感染宿主時，其毒力因子外膜蛋白首先黏附于宿主靶細胞[25]，然后白細胞毒素能迅速標(biāo)記白細胞表面相關(guān)抗原，引起機體免疫能力迅速下降，進而影響體內(nèi)細胞免疫和體液免疫，白細胞數(shù)也隨之降低，壞死桿菌在機體內(nèi)能不斷地增殖并產(chǎn)生更多的毒力因子。因機體失去對其他毒力因子和其他病原的抵抗能力，導(dǎo)致繼發(fā)感染。Bicalho 等2012 年發(fā)現(xiàn)牛子宮內(nèi)膜炎與大腸桿菌，化膿隱秘桿菌及壞死桿菌的毒力因子（fimH、fimA、lktA）有關(guān)，這些細菌協(xié)同作用可導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率增加，其中化膿隱秘桿菌能為壞死桿菌提供一種生長因子，而這種生長因子會進一步促進壞死桿菌產(chǎn)生白細胞毒素作用于反芻動物的PMNs[26-30]。

作為一種天然毒素蛋白，壞死桿菌白細胞毒素能夠清晰的標(biāo)記體內(nèi)白細胞的表面功能相關(guān)抗原（LFA-1），白細胞毒素可以先與暴露在外活躍的LFA-1 相互作用。白細胞毒素可以快速激活人體外周血單核細胞（THP-1）中的半胱天冬酶，與此同時，也能克服半胱天冬酶的抑制作用，使細胞中毒[31]。白細胞毒素可以快速中斷溶酶體向外釋放內(nèi)容物，這種毒力因子作為最先進入機體的毒素，能夠快速使溶酶體的功能損傷。溶酶體有強大的吞噬異源物質(zhì)的功能，又稱異噬性溶酶體。吞噬作用也是細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)的一種重要方式，機體通過該種具有吞噬作用的溶酶體的內(nèi)吞作用，將營養(yǎng)物質(zhì)吞入內(nèi)吞體進行融合，之后在溶酶體及相關(guān)酶系的綜合作用下，將吞入的營養(yǎng)物質(zhì)分解成機體可吸收的小分子物質(zhì)；降解并清除受損的細胞碎片、無生物活性細胞器及不被機體利用的生物分子[32-33]。當(dāng)壞死桿菌白細胞毒素進入機體后，引起機體發(fā)生固有免疫功能減退，隨著細菌生長其他毒素釋放，機體無法產(chǎn)生足夠的抗體對抗病原菌，細胞因營養(yǎng)物質(zhì)缺失，最終細胞壞死。壞死細胞聚集引起強烈炎性反應(yīng)，機體會分泌更多的炎癥因子消除抗原，推測其為引起肝膿腫主要原因之一。

2 白細胞毒素的遺傳特征

壞死桿菌白細胞毒素作為一種天然的毒素既有異于其他細菌的致病機制，又有獨特的遺傳特性。Guedin 在對白細胞毒素的核苷酸序列的研究過程中，確定白細胞毒素操縱子有3 個基因為lktB、lktA、lktC[34]。Narayanan 等用多克隆抗血清篩選純化的白細胞毒素基因組DNA，并利用反向PCR 技術(shù)克隆完整的白細胞毒素基因時發(fā)現(xiàn)第2 個操縱子lktA由9 726 bp 組成，編碼3 241 個氨基酸，總分子量為335 956 Da[35]。壞死桿菌白細胞毒素是一個罕見的缺乏半胱氨酸的蛋白，梭菌屬的肉毒桿菌神經(jīng)毒素、艱難梭菌細胞毒素B、敗血梭菌α 毒素和破傷風(fēng)桿菌毒素中均含有半胱氨酸殘基，因此壞死桿菌白細胞毒素與任何其他細菌白細胞毒素均無序列相似性。第一個操縱子基因lktB 中的蛋白分子量為62 981 Da，有551 個密碼子，該蛋白可能是親水的壞死桿菌外膜蛋白；第3個操縱子基因為17 150 Da，有145個密碼子。編碼lktC的起始密碼子ATG與負責(zé)lktC編碼的終止密碼子TGA 之間存在重疊。進一步研究發(fā)現(xiàn)，lktC 可能是該操縱子的終止基因。因為在lktC 的下游無與其緊密相鄰的ORF（圖1）。

壞死桿菌白細胞毒素蛋白分子量相比金黃色葡萄球菌、溶血性巴斯德菌及放線菌的細菌外毒素蛋白分子量更大。壞死桿菌白細胞毒素的核苷酸序列表明，與其他細菌的白細胞毒素及外毒素均無相關(guān)性。

圖1 白細胞毒素基因開放閱讀框架(ORF)

3 白細胞毒素在疫苗方面的應(yīng)用

白細胞毒素作為壞死桿菌的一種關(guān)鍵的毒力因子，在疫苗的研制過程中扮演著重要角色。壞死桿菌白細胞毒素獨特的遺傳特性對其疫苗研究尤為重要。1957 年～2015 年我國批準(zhǔn)的130 種菌用疫苗中[36]，針對大型家畜疫苗的使用公布相對較少，對家畜細菌感染的治療仍然使用抗生素居多，鑒于壞死桿菌對于牛、羊、豬及人的危害和壞死桿菌病抗生素的使用情況，壞死桿菌疫苗的研究刻不容緩。

2002 年，王克堅等人針對鹿源壞死桿菌制備了裂解細菌上清疫苗，并且將其免疫實驗動物鹿，產(chǎn)生的抗體可以維持7 個月，該疫苗在免疫鹿一個月后，進行同源壞死桿菌攻菌實驗，免疫組鹿沒有表現(xiàn)任何臨床癥狀，充分證明這種壞死桿菌上清疫苗針對同源的壞死桿菌感染起到良好的免疫作用[37-38]。2001 年，Narayanan 等人針對壞死桿菌白細胞毒素lktA 截短的5 個片段（BSBSE、SX、GAS、SH和FI-NAL）研制白細胞毒素基因工程亞單位疫苗，小鼠動物實驗結(jié)果表明，實驗組相比滅活菌體苗組和滅活菌體培養(yǎng)基苗組，截短的5 種多肽鏈重組的白細胞毒素疫苗免疫保護效果明顯高于兩對照組，含有BSBSE 和SH 肽鏈片段的疫苗對小鼠的免疫保護效果最好[35,39]。

2007 年，郭東華等人針對牛源壞死桿菌H05 菌株白細胞毒素基因lktA 克隆其全長，預(yù)測了5 個抗原表位（pl-1、pl-2、pl-3、pl-4、pl-5），并成功表達5 段基因，為了證明這5 段蛋白作為重組亞單位疫苗的可行性，對重組蛋白和天然壞死桿菌白細胞毒素對小鼠的保護情況進行檢測，結(jié)果證明重組的白細胞毒素和天然白細胞毒素對壞死桿菌感染小鼠均有保護作用，pl-2、pl-3、pl-4 保護作用最好[40]。該結(jié)果精確了壞死桿菌白細胞毒素的免疫保護區(qū)，為重組亞單位疫苗的生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù)。在對羊中性粒細胞凋亡的作用的分析中，發(fā)現(xiàn)隨著蛋白濃度的降低，凋亡作用也逐漸減弱[41]。2008年，陳立志等人分別表達了牛源壞死桿菌白細胞毒素BSBSE 基因和SH 基因，并將兩段基因進行融合表達。融合后的免疫原性鑒定其結(jié)果證明融合的DNA 疫苗的保護效果明顯優(yōu)于單價的DNA 疫苗[42]，早在2006 年的梅毒螺旋體基因融合疫苗免疫兔也能得到高水平的抗體。壞死桿菌白細胞毒素融合基因工程亞單位疫苗的成功研制為壞死桿菌防治拓寬了視野，更為壞死桿菌的快速檢測技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)。

與子宮內(nèi)膜炎相關(guān)的病原菌是大腸桿菌、壞死桿菌、化膿性假單胞菌等。因此Machado 等人在2014 年通過皮下免疫大腸桿菌、壞死桿菌及化膿隱秘桿菌的3 種重組蛋白（FimH、LKT、PLO），同皮下免疫3 種細菌的滅活菌苗進行免疫效果評價對比，結(jié)果顯示3 種重組蛋白在初產(chǎn)母牛的子宮內(nèi)膜炎預(yù)防效果比滅活細菌組更好，通過接種壞死桿菌白細胞毒素重組蛋白能夠同其他兩種細菌的重組蛋白一起作用并有效預(yù)防子宮內(nèi)膜炎[43]。由此可知，重組白細胞毒素在針對由于壞死桿菌誘發(fā)的其他疾病中有著同樣的免疫保護作用。

壞死桿菌是動物肝膿腫的主要病原菌。2018年，孟祥玉等人，成功制備了壞死桿菌白細胞毒素亞單位疫苗及壞死桿菌全菌滅活疫苗，并建立了家兔肝膿腫的動物模型用于對比兩種疫苗的保護率。該實驗證明桿菌白細胞毒素亞單位疫苗具有70%的保護率，與壞死桿菌全菌滅活疫苗的保護率相同[44]。在針對壞死桿菌引起的肝膿腫的防治中，使用壞死桿菌白細胞毒素制備的亞單位疫苗不含脂多糖、細菌細胞壁及培養(yǎng)基等非抗原物質(zhì)，即保證了疫苗的安全性又具有保護效果。重組的白細胞毒素免疫保護效果高于全菌體和上清證實重組白細胞毒素在疫苗臨床應(yīng)用方面的優(yōu)異性及實用性。

4 小結(jié)與展望

在壞死桿菌白細胞毒素亞單位疫苗的研究中，利用壞死桿菌白細胞毒素這種關(guān)鍵的毒力因子制備的亞單位疫苗有很好的發(fā)展前景，它能很好地克服全菌滅活疫苗的外源物質(zhì)，如細菌細胞壁、培養(yǎng)基及其他非抗原物質(zhì)對動物體自身可能產(chǎn)生的副作用或毒性作用這一缺陷，很大地提高了疫苗的安全性。同時，該疫苗制備方法簡單，有良好的穩(wěn)定性，易于大規(guī)模生產(chǎn)。隨著近年來新型佐劑陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，二氧化硅[45]、維生素A、維生素E、以及兒茶素中的黃酮類物質(zhì)[46]等均可作為亞單位疫苗佐劑，這為壞死桿菌白細胞毒素亞單位疫苗作用機體創(chuàng)造了更好的條件。

近年來，隨著壞死桿菌發(fā)病機制的研究不斷深入，壞死桿菌病的防控有了新的突破口，目前本實驗室預(yù)采用白細胞毒素、外膜蛋白及其他毒力因子聯(lián)合應(yīng)用制備壞死桿菌亞單位疫苗，但免疫保護效果還有待進一步確認。