H146-like 鵝嵌杯病毒TaqMan-MGB PCR 檢測方法的建立及應(yīng)用

鄭 敏，張世忠，王 劭，謝開春，江丹丹，肖世峰,2，陳少鶯,2*，鄧國華

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013；3.福建省南平市延平區(qū)畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，福建 南平 353000；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

嵌杯病毒科（Caliciviridae）病毒粒子一般呈球形或近球形，核衣殼呈二十面體對稱，直徑27 nm～40 nm。嵌杯病毒為單股、正鏈RNA 病毒，其基因組約為7.4 kb～8.4 kb[1]。禽類嵌杯病毒根據(jù)非結(jié)構(gòu)蛋白與衣殼蛋白氨基酸序列遺傳變異關(guān)系通常可劃分為兩個屬：Bavovirus 與Nacovirus[2-4]，基因組包含2 個開放閱讀框（ORFs），靠近基因組5'端的ORF1 具備編碼病毒非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）的功能，NS 蛋白裂解成N 末端蛋白（Nterm）、核苷三磷酸酶（NTPase）、3A 樣蛋白、VPg、蛋白酶（Pro）和RNA 聚合酶（Pol）。2016 年張大丙等借助宏基因組測序從腸炎患鵝的腸道病料樣品中檢測到一種新基因型水禽嵌杯病毒株H146，暫命名為Sanovirus 屬鵝嵌杯病毒（Goose calicivirus，GCV），與Nacovirus 屬成員NS 蛋白的同源性僅為31%～34%[5]，與Sanovirus 屬鉆水鴨源嵌杯病毒株MW20 的Nterm 蛋白相比，GCV H146 株的Nterm 蛋白存在170 個不連續(xù)的氨基酸缺失。水禽嵌杯病毒NTPase 氨基酸序列較為保守，具有NTP酶活性和解旋酶活性，可以促進(jìn)子代病毒復(fù)制[3-5]。2018 年至今，本實(shí)驗(yàn)室利用隨機(jī)擴(kuò)增的方法從福建各地區(qū)發(fā)生痛風(fēng)的鵝中相繼檢測出一種新的GCV 株，該病毒株與鵝腸炎型GCV H146 株同源性很高，因此被命名為H146-like GCV[6]。國內(nèi)對H146-like GCV 在放牧鵝群中的發(fā)病特點(diǎn)、傳播途徑及流行趨勢等方面的研究工作還處于起步階段。因此，采用合適的檢測方法加強(qiáng)對H146-like GCV 的流行病學(xué)監(jiān)控，對鵝病毒性腸炎與痛風(fēng)的早期防治具有重要意義。

目前水禽嵌杯病毒實(shí)驗(yàn)室檢測主要通過常規(guī)PCR 與測序進(jìn)行[7-8]，這些常規(guī)方法與熒光定量PCR檢測方法相比，操作繁瑣且檢測耗時長。熒光定量PCR 具有靈敏度高、特異性好、可靠性強(qiáng)和實(shí)時準(zhǔn)確等特點(diǎn)，且PCR 結(jié)束后可以直接觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，降低了開蓋點(diǎn)樣造成污染的可能性[9-12]。國內(nèi)外已經(jīng)建立了檢測多種嵌杯病毒的熒光定量PCR 方法[13-15]，在嵌杯病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測方面展示了良好的應(yīng)用前景。分子流行病學(xué)分析表明，Sanovirus 屬H146-like GCV 在自然宿主中的流行近年來呈現(xiàn)上升趨勢[2,6]，因此，本研究針對GCV NS 基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立一種可以特異性檢測H146-like GCV 的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 檢測方法，為監(jiān)測水禽嵌杯病毒的流行狀況以及GCV 的鑒別檢測、定量分析提供可靠的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸及病料樣品鵝星狀病毒（GoAstV）、鵝副粘病毒（GPMV）、鵝細(xì)小病毒（GPV）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）、Ⅰ型鴨肝炎病毒（DHAV-1）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）等病毒基因組核酸樣品以及H146-like GCV 陽性雛鵝腎組織樣品均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物病毒室鑒定并保存。62份疑似感染H146-like GCV 雛鵝病料（包括肝、脾、腎和腸道等組織樣品）為本實(shí)驗(yàn)室2018 年～2019 年采集自福建不同地區(qū)鵝養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑Premix TaqTM、PrimeScriptTMRT re?agent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、Pre?mix Ex TaqTM、pMD18-T 載體、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程（大連）有限公司；QIAamp MinElute Virus Spin Kit 病毒DNA/RNA 共提取試劑盒購自Qiagen 公司；DNA 回收純化試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸悦绹鳲mega 公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)參照GenBank 中GCV H146 株基因序列（KY399947）進(jìn)行比對分析，選擇其NS 基因保守區(qū)域，利用Oligo 6.0 和Express 3.0 設(shè)計(jì)常規(guī)RT-PCR 特異性引物GCV-P1/GCV-P2 以及熒光定量RT-PCR 特異性引物GCV-QP3/GCV-QP4 與TaqMan-MGB 熒光探針（GCV-Probe）（表1），探針5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記MGBNFQ，預(yù)期擴(kuò)增目的片段分別為269 bp和134 bp。引物與探針均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 引物和探針序列Table 1 Primers and TaqMan probe sequence used in this study

1.4 病毒RNA 的提取及cDNA 的合成將經(jīng)隨機(jī)引物PCR 方法鑒定為GCV 感染的鵝痛風(fēng)腎臟組織樣品進(jìn)行研磨，與滅菌PBS 充分混勻，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清。利用病毒DNA/RNA 共提取試劑盒提取病毒總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR 方法的建立

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以H146-like GCV cDNA 為模板，按照Premix TaqTM說明書，以GCV-P1/GCV-P2引物進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增。常規(guī)PCR 反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，30 個循環(huán)，72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物純化回收后克隆于pMD18-T 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-GCV，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。測序正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，用核酸蛋白分析儀測定陽性質(zhì)粒的OD260nm值，并根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)計(jì)算單位體積中質(zhì)粒的拷貝數(shù)為5.07×1010拷貝/μL，-20 ℃保存陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5.2 熒光定量PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按照熒光定量試劑盒說明書配制20 μL 的反應(yīng)體系，通過溫度梯度PCR 以不同退火溫度（52 ℃～65 ℃）進(jìn)行TaqMan-MGB 熒光定量PCR 反應(yīng)確定引物的最適退火溫度，采用矩陣法對引物濃度（5 μmol/L～20 μmol/L）和 探 針 濃 度（1.25 μmol/L～20 μmol/L）進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得最適合的探針與引物的濃度配比以及反應(yīng)條件。將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋至濃度為5.07×109拷貝/μL～5.07×101拷貝/μL，以其為模板，采用優(yōu)化后的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，繪制動力學(xué)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗(yàn)以GoAstV、GPMV、GPV、MDRV、DHAV-1、DTMUV 等病毒的cDNA 或DNA 為模板，采用本實(shí)驗(yàn)建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 擴(kuò)增，以檢測該方法的特異性，同時以滅菌ddH2O 為陰性對照，H146-like GCV cDNA 為陽性對照。

1.7 敏感性試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做10 倍倍比稀釋，以10個不同稀釋度（5.07×109拷貝/μL～5.07×100拷貝/μL）的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別為模板進(jìn)行TaqMan-MGB 熒光定量PCR 擴(kuò)增，以滅菌ddH2O 為陰性對照，分別利用本研究建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 和1.5.1 中常規(guī)PCR 方法進(jìn)行檢測，以評估該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)分別以同一批次和不同批次制備的不同拷貝數(shù)（5.07×108拷貝/μL、5.07×107拷貝/μL、5.07×106拷貝/μL）標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，用優(yōu)化后的條件分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，每個模板分別做3 個重復(fù)，計(jì)算批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)（CV）。

1.9 臨床樣品的檢測對本實(shí)驗(yàn)室采集的62 份疑似H146-like GCV 感染雛鵝的肝臟、脾臟、腎臟、腸道等樣品，以滅菌PBS 研磨，反復(fù)凍融3 次后取上清，提取樣品總RNA 后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，同時利用本研究建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法和1.5.1 中常規(guī)PCR 方法對62 份臨床樣品核酸進(jìn)行檢測，比較二者檢測結(jié)果，并計(jì)算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果優(yōu)化后的熒光定量TaqMan-MGB PCR 最佳反應(yīng)體系（20 μL）如 下：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）混合液10 μL、上、下游引物GCV-QP3/GCV-QP4（10 μmol/L）各0.5 μL、探針（GCV-Probe）（5 μmol/L）1 μL、模板1 μL、無RNase 水補(bǔ)足至終體積20 μL。優(yōu)化的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法最佳反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃20 s，40個循環(huán)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將pMD-GCV 標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋后作為模板經(jīng)建立的熒光定量PCR 檢測，結(jié)果顯示，該標(biāo)準(zhǔn)曲線在5.07×109拷貝/μL～5.07×102拷貝/μL 8 個不同濃度范圍內(nèi)與Ct 值具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.995（圖1）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.5579，截距為33.75，直線方程為：y=-3.5579x+33.75。

圖1 H146-like GCV 熒光定量PCR 擴(kuò)增動力學(xué)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線（單位：拷貝/μL）Fig.1 Amplified kinetic curve and standard curve of H146-like GCV real-time PCR (Unit: copies/μL)

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果采用建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法對GoAstV、GPMV、GPV、MDRV、DHAV-1、DTMUV 等 病 毒 的cDNA 或DNA 進(jìn) 行 檢測，以H146-like GCV cDNA 為陽性對照。結(jié)果顯示，建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 檢測方法僅對H146-like GCV 呈現(xiàn)陽性擴(kuò)增，而滅菌ddH2O 對照和其它病毒擴(kuò)增結(jié)果均為陰性（圖2），表明本研究建立的檢測方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 H146-like GCV 熒光定量PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The specificity for H146-like GCV real-time PCR

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋后作為模板，分別采用TaqMan-MGB熒光定量PCR和常規(guī)PCR 方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，TaqMan-MGB熒光定量PCR 方法能檢測的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度為5.07×102拷貝/μL，而常規(guī)PCR 方法最低檢測濃度為5.07×104拷貝/μL（圖3），滅菌ddH2O陰性對照無擴(kuò)增，TaqMan-MGB 熒光定量檢測方法比常規(guī)PCR 方法敏感100 倍，表明本研究建立的方法具有更高的敏感性。

圖3 GCV 熒光定量PCR(A)和常規(guī)PCR 方法(B)的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity test of the GCV real-time PCR (A) and the conventional PCR (B)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果用3 種濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（5.07×106拷貝/μL～5.07×108拷貝/μL）分別進(jìn)行批次內(nèi)和批次間的重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于1.6%（表2），表明建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

2.6 臨床樣品檢測利用建立的GCV TaqMan-MGB熒光定量PCR 方法對62 份臨床樣品進(jìn)行檢測，熒光定量PCR 測結(jié)果顯示陽性樣品58 份，檢出率為93.5%，常規(guī)PCR 檢測結(jié)果顯示陽性樣品45 份，檢出率僅為72.6%；常規(guī)PCR 檢測為陽性的45 份樣品經(jīng)TaqMan-MBG 熒光定量PCR 方法檢測均為陽性，二者的符合率為77.59%（表3），表明建立的Taq?Man-MGB 熒光定量PCR 方法可用于臨床樣品中GCV的檢測，且比常規(guī)PCR 方法敏感。

3 討 論

近年來，中國、美國、加拿大、巴西等多個國家均報(bào)道稱通過宏基因組等技術(shù)發(fā)現(xiàn)健康候鳥與涉禽個體可以攜帶Nacovirus 屬和Sanovirus 屬的水禽嵌杯病毒[2-3,6-8]。國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病防控研究室于2014 年報(bào)道了我國健康鵝群中存在Nacovirus 屬GCV，2014 年至今國內(nèi)外研究人員對水禽嵌杯病毒分子流行病學(xué)調(diào)查以及病毒株基因序列分析表明，Sanovirus 屬GCV 是引起我國鵝病毒性腸炎與傳染性生長阻滯綜合征的重要病原之一[3,6,16-17]。目前H146-like GCV 與其它腸道病毒的共感特性及其染機(jī)制尚不清楚，為了解GCV 在我國鵝群中的感染情況，建立一種便捷、準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測方法具有重要意義。

表2 H146-like GCV 熒光定量PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Reproducibility assay of H146-like GCV real-time PCR

表3 TaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法與常規(guī)PCR 檢測結(jié)果及符合率Table 3 Detection results and coincidence rate of TaqMan-MGB real-time PCR and conventional PCR

TaqMan-MGB 探針特異性好，敏感性更高，張秀娥等用MGB 探針和普通探針熒光定量PCR 方法檢測兔病毒性出血癥病毒，發(fā)現(xiàn)MGB 探針定量范圍更寬[18]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的探針為MGB 探針，MGB 可以顯著增強(qiáng)探針與模板的結(jié)合能力，提高探針的Tm值，使探針的長度縮短，結(jié)合效率提高，尤其對于GCV NS 基因中AT 含量較高的序列，MGB 探針的設(shè)計(jì)更具有優(yōu)勢。MGB 探針的3'端的淬滅基團(tuán)標(biāo)記不發(fā)光的NFQ 熒光基團(tuán)，可極大消除傳統(tǒng)淬滅基團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光，提高信噪比，使反應(yīng)的背景值更低，增加了反應(yīng)的特異性，提高了擴(kuò)增效率[19-20]。

本研究根據(jù)H146-like GCV 基因組的保守基因NS 設(shè)計(jì)特異性的引物和MGB 探針，建立了檢測GCV 的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 檢測方法，該方法對于GCV 的檢測結(jié)果為陽性，對GoAstV、GP?MV、GPV、MDRV、DHAV-1、DTMUV 核酸樣品的檢測結(jié)果均為陰性。經(jīng)測序分析表明，TaqMan-MGB 熒光定量檢測方法擴(kuò)增的GCV NS 基因PCR 目標(biāo)序列與參考序列同源性為93.3%～100%；批間、批內(nèi)各組變異系數(shù)均低于1.6%，顯示了該方法良好的特異性、穩(wěn)定性與可靠性。采用本研究建立的Taq?Man-MGB 熒光定量PCR 方法對臨床疑似GCV 感染的病料樣品進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果與常規(guī)PCR 符合率為77.59%，表明針對NS 基因建立的TaqMan-MGB熒光定量PCR 方法可為H146-like GCV 的快速檢測及其流行病學(xué)調(diào)查提供有力的技術(shù)支持。