基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討萊菔子對胃腸動(dòng)力的影響機(jī)制

龍超君，白辰，黃羚，賀建禎，劉邵陽，崔麗軍，鮮馥陽，汪伯川，于河，劉鐵鋼，谷曉紅

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討萊菔子對胃腸動(dòng)力的影響機(jī)制

龍超君，白辰，黃羚，賀建禎，劉邵陽，崔麗軍，鮮馥陽，汪伯川，于河，劉鐵鋼，谷曉紅

北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029

應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討萊菔子對胃腸動(dòng)力的影響及作用機(jī)制，指導(dǎo)萊菔子的臨床應(yīng)用。對炒萊菔子水煎液進(jìn)行超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC/Q-TOF-MS）分析，推斷其化學(xué)成分；利用ChemSpider數(shù)據(jù)庫獲取萊菔子化合物屬性，通過SwissTargetPrediction平臺獲取萊菔子潛在靶點(diǎn)；利用GeneCard、HPO數(shù)據(jù)庫及PALM-IST、PolySearch2文獻(xiàn)挖掘服務(wù)器獲取胃腸動(dòng)力相關(guān)基因；利用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建藥物靶基因-胃腸動(dòng)力基因網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape軟件使網(wǎng)絡(luò)可視化并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯ㄟ^Metascape平臺進(jìn)行核心基因的功能和通路富集分析。篩選出與萊菔子相關(guān)的胃腸動(dòng)力基因148個(gè)，與胃腸動(dòng)力直接相關(guān)的萊菔子靶基因95個(gè)（含二者交集基因11個(gè)），基因功能和通路富集分析相關(guān)結(jié)果584條。萊菔子對胃腸動(dòng)力具有多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，其有效成分與5-羥色胺等神經(jīng)活性物質(zhì)具有一定的結(jié)構(gòu)相似性，可能通過激活以cAMP/cGMP為第二信使的G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、Ca2+信號通路及其他陽離子通道，從而影響胃腸道平滑肌的收縮與舒張。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；萊菔子；胃腸動(dòng)力

萊菔子為十字花科植物蘿卜L.的干燥成熟種子，味辛、甘，性平，歸肺、脾、胃經(jīng)，有消食除脹、降氣化痰功效[1]，是臨床常用健胃消食藥。明代蘭茂《滇南本草》稱萊菔子“下氣寬中，消膨脹，消痰涎，消宿食，消面積滯，降痰，定吼喘，攻腸胃積滯”。張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》有“萊菔子炒熟為末，每飯后移時(shí)服錢許，借以消食順氣，轉(zhuǎn)不傷氣，因其能多進(jìn)飲食，氣分自得其養(yǎng)也”，指出萊菔子行氣消食而不傷氣。然而，萊菔子通過何種機(jī)制促進(jìn)胃腸動(dòng)力至今尚不明確。有研究認(rèn)為，萊菔子可能通過其正己烷成分作用于M型受體、促進(jìn)血漿胃動(dòng)素（MTL）的分泌來促進(jìn)胃腸動(dòng)力，脂肪油可能是其發(fā)揮促進(jìn)胃腸動(dòng)力作用的主要成分[2]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)和信息技術(shù)，以構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)-藥物”網(wǎng)絡(luò)為方法，從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡角度認(rèn)識藥物與機(jī)體之間的作用關(guān)系，對生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整體分析，為中醫(yī)藥研究提供了新思路[3]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建萊菔子與胃腸動(dòng)力相關(guān)的“疾病-基因-藥物”網(wǎng)絡(luò)，并對其進(jìn)行基因功能與通路分析，針對萊菔子影響胃腸動(dòng)力的作用機(jī)制提出合理假設(shè)。

1 資料與方法

1.1 萊菔子化合物信息收集與篩選

1.1.1 炒萊菔子水煎液化學(xué)成分分析

炒萊菔子樣品（購自北京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂）10 g，加100 mL純水浸泡15 min，玻璃棒充分?jǐn)嚢?，于液體加熱器第4檔功率自動(dòng)煎煮75 min，靜置至常溫，4 ℃冰箱保存，進(jìn)樣前用0.22 μm濾膜過濾。使用Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 6550 Q-TOF質(zhì)譜儀，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC/Q-TOF-MS）分析萊菔子水煎液。

色譜條件：Agilent Proshell 120 EC-C18色譜柱（3.0 mm×150 mm，2.7 μm），流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水、B為0.1%甲酸-甲醇，梯度洗脫（0～2 min，15%～45%B；2～8 min，45%～72%B；8～25 min，72%～95%B；25～30 min，95%～100%B），檢測波長為210、255、260、278、282、323、326、330 nm，柱溫35 ℃，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：Dual AJS ESI離子源，正離子和負(fù)離子模式分別檢測，霧化器壓力35 psig，干燥氣溫度200 ℃，干燥氣流速14 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速11 L/min，碎裂電壓380 V，毛細(xì)管電壓3000 V，噴嘴電壓1000 V，掃描范圍50～1500 m/z，采集頻率1.5 spectra/s，Transients 3987，碰撞能量0 V。

有對照品物質(zhì)的峰，通過對比紫外吸收、保留時(shí)間及質(zhì)譜裂解信息進(jìn)行鑒定；無對照品的，通過每個(gè)譜峰的保留時(shí)間和一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中的已知化合物進(jìn)行對比鑒定。

1.1.2 萊菔子化合物成分篩選

依托ChemSpider平臺（http://www.chemspider. com/），根據(jù)Lipinski類藥五原則對化合物進(jìn)行篩選：分子量（MW）＜500，氫鍵給體數(shù)目（Hdon）＜5，氫鍵受體數(shù)目（Hacc）＜10，脂水分配系數(shù)（LogP）＜5，可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量（FRB）≤10。得到的化合物下載其MOL結(jié)構(gòu)以備后續(xù)靶點(diǎn)預(yù)測。

1.2 胃腸動(dòng)力相關(guān)基因獲取

采用數(shù)據(jù)庫檢索和文獻(xiàn)挖掘方式獲取胃腸動(dòng)力相關(guān)靶點(diǎn)。利用HPO數(shù)據(jù)庫[4]、GeneCards數(shù)據(jù)庫[5]、奇恩生物表型診斷工具[6]、Polysearch2文獻(xiàn)挖掘工具[7]及PALM-IST文獻(xiàn)挖掘工具[8]，以“Gastrointestinal mobility”“Abnormal gastrointestinal motility”“Gastrointestinal dysmobility”“Gastrointestinal peristalsis”為檢索詞，在默認(rèn)檢索條件下獲取胃腸動(dòng)力相關(guān)基因，取其并集，剔除重復(fù)結(jié)果后，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫[9]的Retrieve/ID Mapping功能，參數(shù)設(shè)置為從基因名（Genename）到Uniprot數(shù)據(jù)庫（UniprotKB）批量檢索，剔除未經(jīng)注釋（Unreviewed）或不屬于人類的基因。

1.3 萊菔子作用于胃腸動(dòng)力靶點(diǎn)預(yù)測與篩選

依托SwissTargetPrediction平臺[10]，輸入各化合物的MOL結(jié)構(gòu)，通過模擬計(jì)算比較萊菔子化學(xué)成分與已知配體的結(jié)構(gòu)相似性，推斷該化合物的受體（靶蛋白）。取各化合物靶基因中Probabilty＞0.1的靶點(diǎn)作為萊菔子的候選作用靶點(diǎn)。將所有靶點(diǎn)通過Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索，剔除未經(jīng)注釋及不屬于人類的靶點(diǎn)。

利用String數(shù)據(jù)庫[11]，以0.9作為最低交互得分，選擇數(shù)據(jù)庫（Databases）、實(shí)驗(yàn)（Experiments）及文獻(xiàn)挖掘（Textmining）為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的聯(lián)系來源，構(gòu)建胃腸動(dòng)力相關(guān)基因與萊菔子候選作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape3.7.0軟件[12]構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)-藥物（化合物）”可視化網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape的MCODE拓展功能篩選核心網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)。將含有靶基因名稱與基因類別的文本文檔導(dǎo)入Cytoscape3.7.0，為該網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點(diǎn)賦予類別（萊菔子靶基因或胃腸動(dòng)力靶基因）后，剔除疾病靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)、藥物靶點(diǎn)-藥物靶點(diǎn)的聯(lián)系，最終得到萊菔子作用于胃腸動(dòng)力的核心靶點(diǎn)。

1.4 基因功能和通路富集分析

從“疾病-靶點(diǎn)-藥物”網(wǎng)絡(luò)中選取MCODE得分最高的第一聚類相關(guān)基因，利用Metascape平臺[13]進(jìn)行分析，對分析結(jié)果利用Cytoscape的MCODE功能進(jìn)行篩選，獲取基因功能和通路的核心環(huán)節(jié)。

2 結(jié)果

2.1 萊菔子活性成分及相關(guān)屬性

經(jīng)UPLC/Q-TOF-MS分析，從炒萊菔子水煎液中共推斷出21種化合物。其中，18種化合物通過文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫[14-16]比對得出，3種化合物通過與對照品比對鑒定得出，未發(fā)現(xiàn)新化合物。萊菔子水煎液總離子流圖見圖1。

根據(jù)Lipinski類藥五原則對所得化合物進(jìn)行篩選后，得到萊菔子活性成分12個(gè)，見表1。

注：1. Raphanin Glucosinolate；2. (2,4-Dimethyl-1,3-thiazol-5-yl)methanol；3. 3-Amino-phenylpropionic acid；4. Sulforaphane；5. Methylnicotinate；6. 5-(Hydroxymethyl)-5-nonanaminium；7. [2-(2-Methoxy-2-oxoethyl)phenyl]acetate-β-D-glucose；8. Sinapine thiocyanate；9. 1-O-sinapoyl-β-D-glucose；10. Methyl [3-oxo-1-(4-oxo-3-4-(5-{[7-Methyl-3-oxo-5-phenyl-6-(phenylcarbamoyl)-5H-[1,3]thiazolo[3,2-a]pyrimidin-2(3H)-ylidene]methyl}-2-furyl)benzoic acid；11. Cyclo(D-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl)；12. 4-Acetyl-3-methoxy-5-methylbenzoate-β-D-glucose；13. 1,8,15,22-Tetraazacyclooctacosane-2,9,16,23-tetrone；14. 1-[5-(Ethylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanaminium；15. N-Hexylpropanamide；16. 1-Butyl-3-[2-(1-cyclohexen-1-yl)ethyl]urea；17. heliamine；18. N-Hexyl-1-phenyl-1-nonanamine；19. 2-(Octyloxy)-N-[2-(octyloxy)ethyl]ethanamine；20. Phthalic anhydride；21. 2-[{2-(Dimethylamino)-5-[(methoxyacetyl)amino]benzyl}(2-ethylbutanoyl)amino]-N,N-dimethylethanaminium

表1 萊菔子活性成分及其屬性

編號分子式名稱HaccHdonFRBlogP 1C6H12N3O3S1-[5-(Ethylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanaminium623-0.70 2C6H11NOS(2,4-Dimethyl-1,3-thiazol-5-yl)methanol2110.38 3C9H11NO23 Amino-phenylpropionic acid3330.91 4C6H11NOS2Sulforaphane2050.23 5C7H7NO2Methyl nicotinate4132.50 6C10H23NO5-(Hydroxymethyl)-5-nonanaminium2372.58 7C17H22O101-O-sinapoyl-β-D-glucose10570.44 8C24H44N4O41,8,15,22-Tetrazacyclooctacosane-2,9,16,23-tetrone840-1.30 9C9H19NON-Hexylpropanamide2162.14 10C13H24N2O1-Butyl-3-[2-(1-cyclohexen-1-yl)ethyl]urea3263.50 11C11H15NO2Heliamine3121.14 12C8H4O3Phthalic anhydride3001.60

2.2 萊菔子靶基因-胃腸動(dòng)力相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)

2.2.1 萊菔子作用于胃腸動(dòng)力的潛在靶點(diǎn)

從HPO數(shù)據(jù)庫獲得胃腸動(dòng)力相關(guān)基因115個(gè)，從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)基因82個(gè)、從奇恩生物表型診斷工具獲得相關(guān)基因75個(gè)、從Polysearch2文獻(xiàn)挖掘工具獲得相關(guān)基因8個(gè)，從PALM-IST文獻(xiàn)挖掘工具獲得相關(guān)基因506個(gè)。將所有結(jié)果取并集后刪除重復(fù)值，剔除在Uniprot數(shù)據(jù)庫中未經(jīng)注釋或非人類物種的基因，最終獲得胃腸動(dòng)力相關(guān)基因338個(gè)。

將萊菔子活性成分MOL結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTargetPrediction平臺篩選后得到萊菔子靶基因171個(gè)。將338個(gè)胃腸動(dòng)力相關(guān)基因與171個(gè)萊菔子影響胃腸動(dòng)力的候選作用靶點(diǎn)相匹配，剔除非核心靶點(diǎn)，最終獲得萊菔子對胃腸動(dòng)力的作用靶點(diǎn)95個(gè)（見表2），與這95個(gè)萊菔子作用靶點(diǎn)相關(guān)的胃腸動(dòng)力基因148個(gè)（含二者交集基因11個(gè)）。

表2 萊菔子影響胃腸動(dòng)力的95個(gè)潛在作用靶點(diǎn)

UniProt ID靶點(diǎn)名稱MCODE得分 UniProt ID靶點(diǎn)名稱MCODE得分 P089085-羥色胺受體1A（HTR1A）*30.00 P28482絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）*4.23 P282225-羥色胺受體1B（HTR1B）30.00 P08514整合素α-Ⅱb（ITGA2B）4.17 P282215-羥色胺受體1D（HTR1D）30.00 Q92769組蛋白去乙?；?（HDAC2）4.03 Q9UBS5γ-氨基丁酸B型受體1（GABBR1）30.00 P00533表皮生長因子受體（EGFR）4.00 O75899γ-氨基丁酸B型受體2（GABBR2）30.00 O96017絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Chk2（CHEK2）4.00 P41143δ型阿片受體（OPRD1）30.00 P42345絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶mTOR（MTOR）4.00 P41145κ型阿片受體（OPRK1）30.00 P25774組織蛋白酶S（CTSS）4.00 P35372μ型阿片受體（OPRM1）30.00 P43405酪氨酸蛋白激酶（SYK）3.78 P21554大麻素受體1（CNR1）*30.00 P45983絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）3.75 P34972大麻素受體2（CNR2）*30.00 O15379組蛋白去乙?；?（HDAC3）3.67 P14416D（2）多巴胺受體（DRD2）30.00 P10275雄激素受體（AR）3.44 P35462D（3）多巴胺受體（DRD3）30.00 P07384鈣激活的中性蛋白酶1（CAPN1）3.43 P21917D（4）多巴胺受體（DRD4）30.00 O14757絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Chk1（CHEK1）3.43 P41146孤啡肽受體（OPRL1）30.00 P50750細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶9（CDK9）3.43 Q99705黑色素濃集激素受體1（MCHR1）30.00 O75376核受體輔助抑制因子Ⅰ（NCOR1）3.26 P30542腺苷受體A1（ADORA1）30.00 Q9Y618核受體輔助抑制因子Ⅱ（NCOR2）3.26 P0DMS8腺苷受體A3（ADORA3）30.00 O00519脂肪酸酰胺水解酶1（FAAH）3.00 Q9H3N8組胺H4受體（HRH4）30.00 P04066α-1-巖藻糖苷酶（FUCA1）3.00 P282235-羥色胺受體2A（HTR2A）26.00 P27487二肽基肽酶Ⅳ（DPP4）3.00 P415955-羥色胺受體2B（HTR2B）*26.00 O43451腸麥芽糖酶-葡糖淀粉酶（MGAM）3.00 P283355-羥色胺受體2C（HTR2C）26.00 P00488凝血因子ⅩⅢa（F13A1）3.00 P42336PI3-激酶亞基α（PIK3CA）26.00 P01375腫瘤壞死因子-α（TNF）*3.00 P35348α-1A腎上腺素能受體（ADRA1A）26.00 P49841糖原合成酶激酶-3β（GSK3B）2.86 P41594代謝型谷氨酸受體5（GRM5）26.00 Q00535細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5（CDK5）2.86 P25103P物質(zhì)受體（TACR1）*26.00 P04150糖皮質(zhì)激素受體（NR3C1）2.76 O436142型食欲肽受體（HCRTR2）26.00 Q08881酪氨酸蛋白激酶（ITK）2.70 O43193胃動(dòng)素受體（MLNR）26.00 Q13547組蛋白去乙?；?（HDAC1）2.50 P21731血栓烷A2受體（TBXA2R）26.00 P06493細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）2.46 P35367組胺H1受體（HRH1）26.00 Q92731雌激素受體β（ESR2）2.40 Q8TDU6G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1（GPBAR1）15.00 P11413葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶（G6PD）2.00 P08588β-1腎上腺素能受體（ADRB1）15.00 P07858組織蛋白酶B（CTSB）2.00 P13945β-3腎上腺素能受體（ADRB3）15.00 P43403酪氨酸蛋白激酶（ZAP70）1.71 Q16602降鈣素基因相關(guān)肽1型受體（CALCRL）15.00 P47712磷脂酶A2組ⅣA（PLA2G4A）1.67 P07550β-2腎上腺素受體（ADRB2）*15.00 P31645鈉依賴性血清素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SLC6A4）1.67 Q05193動(dòng)力蛋白-1（DNM1） 7.00 P14410腸道蔗糖酶-異麥芽糖酶（SI）1.40 Q16572溶質(zhì)載體家族18成員3（SLC18A3） 7.00 P08253基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP2）1.40 P07900熱休克蛋白HSP 90-α（HSP90AA1） 6.61 P49840糖原合成酶激酶-3α（GSK3A）1.40 P17252蛋白激酶Cα型（PRKCA） 6.00 Q96RI1維甲酸X受體相互作用蛋白14（NR1H4）1.07 Q6QHF9多胺氧化酶（PAOX） 5.00 P21397單胺氧化酶A型（MAOA）0.67 P34913雙功能環(huán)氧化物水解酶2（EPHX2） 5.00 Q9HC29炎癥性腸病蛋白質(zhì)1（NOD2）0.67 P19793視黃酸受體RXR-α（RXRA） 5.00 P51449類視黃醇相關(guān)的孤兒受體-γ（RORC）0.67 O14965極光激酶A（AURKA） 5.00 Q96IY4羧肽酶B2（CPB2）0.67 P35228誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2）* 5.00 P16581E-選擇素（SELE）0.67 P05106整合素β-3（ITGB3） 4.91 P07099環(huán)氧化物水解酶1（EPHX1）0.50 Q00987E3泛素蛋白連接酶Mdm2（MDM2）* 4.76 P00797腎素（REN）*0.50 P78396細(xì)胞周期蛋白A1（CCNA1） 4.76 P49768早老素-1（PSEN1）0.33 P20248細(xì)胞周期蛋白A2（CCNA2） 4.36 P09874聚[ADP-核糖]聚合酶1（PARP1）0.29 P24941細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2） 4.36

注：*萊菔子作用靶點(diǎn)與胃腸動(dòng)力相關(guān)基因的交集

2.2.2 “疾病-靶基因-藥物”可視化網(wǎng)絡(luò)

將上述95個(gè)萊菔子作用靶點(diǎn)與148個(gè)胃腸動(dòng)力基因利用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“疾病靶點(diǎn)-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape網(wǎng)絡(luò)可視化工具導(dǎo)入化合物靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果，構(gòu)建“化合物-基因-疾病”三元生物可視網(wǎng)絡(luò)。各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的大小由其連接度（相鄰網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的數(shù)目）決定，節(jié)點(diǎn)尺寸越大則該節(jié)點(diǎn)連接度越高。為更直觀地考察萊菔子影響胃腸動(dòng)力的核心作用靶點(diǎn)，利用Cytoscape的MCODE功能對“化合物-靶基因-疾病”三元生物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，MCODE得分越高，表明該集合的靶點(diǎn)在該網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)核心地位的可能性越高。見圖2。

作為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，萊菔子化合物在網(wǎng)絡(luò)中的連接度明顯低于萊菔子靶基因及胃腸動(dòng)力相關(guān)基因，因而在計(jì)算篩選核心靶點(diǎn)的過程中被剔除于核心靶點(diǎn)之外，故在核心靶點(diǎn)集合中未顯示。

圖2 萊菔子作用于胃腸動(dòng)力“藥物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)聚類分析

2.3 基因功能與通路分析

從“藥物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)中選擇MCODE得分最高的集群中的57個(gè)相關(guān)基因，在Metascape平臺進(jìn)行基因功能與通路富集分析，得到584條結(jié)果，包括基因本體生物過程（GO-BP）結(jié)果548條（經(jīng)MCODE篩選后得到核心條目31條）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）結(jié)果18條、Reactome結(jié)果17條、經(jīng)典信號通路1條。以logQ值（多次檢驗(yàn)矯正后的值）的絕對值為橫坐標(biāo)，相關(guān)生物過程與信號通路為縱坐標(biāo)，得到基因功能與通路分析結(jié)果，見圖3～圖5。

圖3 萊菔子作用于胃腸動(dòng)力核心靶點(diǎn)GO-BP富集結(jié)果

圖4 萊菔子作用于胃腸動(dòng)力核心靶點(diǎn)KEGG富集結(jié)果

圖5 萊菔子作用于胃腸動(dòng)力核心靶點(diǎn)Reactome富集結(jié)果

3 討論

萊菔子為藥食同源?！独侠虾阊浴肥珍浫R菔子粥（萊菔子、粳米），主治腹脹、咳嗽痰多。黃元御《玉楸藥解》稱萊菔子“味辛、氣平，入手太陰肺經(jīng)，辛烈疏利，善化痰飲，最止喘嗽，破郁止痛，利氣消谷”。朱丹溪以萊菔子配山楂、神曲、半夏等，命名保和丸，專治食積納呆。萊菔子對胃腸動(dòng)力具有促進(jìn)作用已成為基本共識。然而，萊菔子究竟如何作用于胃腸動(dòng)力、二者之間有著怎樣的生物關(guān)系網(wǎng)絡(luò)仍未明晰。

胃腸運(yùn)動(dòng)受神經(jīng)和體液多種因素的調(diào)節(jié)。胃腸道神經(jīng)-Cajal間質(zhì)細(xì)胞-平滑肌網(wǎng)絡(luò)是調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)的主力。胃腸運(yùn)動(dòng)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)與Cajal間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合，并通過Cajal間質(zhì)細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞之間的縫隙連接傳導(dǎo)興奮性或抑制性連接電位導(dǎo)致相鄰的平滑肌細(xì)胞激活[17]，從而實(shí)現(xiàn)胃腸運(yùn)動(dòng)的傳導(dǎo)。目前發(fā)現(xiàn)Cajal間質(zhì)細(xì)胞膜表面表達(dá)多種調(diào)節(jié)平滑肌收縮的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），如嘌呤能受體、膽堿能受體、神經(jīng)激肽受體（P物質(zhì)等）、5-羥色胺（5-HT）能受體等，GPCR及cAMP/cGMP第二信使相關(guān)信號傳導(dǎo)可以實(shí)現(xiàn)對胃腸平滑肌的調(diào)控[18]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法獲得了萊菔子影響胃腸動(dòng)力的作用靶點(diǎn)及相關(guān)基因功能與信號通路。我們選用萊菔子水煎液進(jìn)行液相分析獲取其有效成分，經(jīng)文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)對比證實(shí)鑒定結(jié)果可靠，更符合臨床實(shí)際，又能避免直接檢索數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)造成的冗余。此外，不同于常見的利用藥物與疾病靶基因交集作為研究對象，本研究利用String數(shù)據(jù)庫獲取與胃腸動(dòng)力基因直接相關(guān)的萊菔子靶基因，縮小了潛在有效的藥物靶基因被剔除的可能性。最后，我們將“藥物-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)中相對核心的藥物靶基因與疾病基因共同作為富集分析對象，將疾病基因納入分析范圍，有助于推測藥物作用于疾病靶點(diǎn)后的級聯(lián)反應(yīng)，從而反映萊菔子在促進(jìn)胃腸動(dòng)力同時(shí)的附加治療作用。

根據(jù)萊菔子靶點(diǎn)預(yù)測及富集分析結(jié)果推斷，萊菔子的活性成分與5-HT等神經(jīng)活性物質(zhì)具有一定的結(jié)構(gòu)相似性，可以與胃腸道神經(jīng)的5-HT類受體、γ-氨基丁酸受體、大麻素受體、多巴胺受體、P物質(zhì)受體、腎上腺素能受體等G蛋白偶聯(lián)受體（以視紫紅質(zhì)樣受體為主）結(jié)合。除多巴胺受體與腎上腺素受體外，上述受體對胃腸運(yùn)動(dòng)均有相應(yīng)的促進(jìn)作用[18-24]。萊菔子可能通過與G蛋白偶聯(lián)受體（以視紫紅質(zhì)樣受體為主）偶聯(lián)，激活cAMP/cGMP及其相關(guān)的蛋白激酶后，激活相關(guān)Ca2+及其他陽離子通道，并通過間隙連接傳導(dǎo)神經(jīng)電刺激，影響胃腸道平滑肌細(xì)胞的電節(jié)律，從而影響胃腸道平滑肌的收縮與舒張。這一過程往往伴隨對人體其他生命活動(dòng)的影響（見圖6）。

圖6 萊菔子作用于胃腸動(dòng)力cAMP及其相關(guān)信號通路示意圖

萊菔子的基因富集分析結(jié)果提示，萊菔子在影響胃腸動(dòng)力的同時(shí)往往伴隨著對血壓的負(fù)性調(diào)節(jié)，這可能是萊菔子作用于血管平滑肌上的G蛋白偶聯(lián)受體后激活cAMP/cGMP信號通路及鈣信號通路導(dǎo)致血管舒張?jiān)斐傻?。萊菔子對腎素（REN）、血栓素A2受體（TBXA2R）、凝血因子13（F13A1）的作用可能在這一過程中扮演重要角色?，F(xiàn)代藥理研究及臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，萊菔子具有降血壓及血管內(nèi)皮保護(hù)作用[25-26]佐證了這一分析結(jié)果。這與中醫(yī)“血為氣之母，氣為血之帥”的內(nèi)涵相契合，人體氣機(jī)得以疏利，血液運(yùn)行與血管狀態(tài)也隨之受影響。

結(jié)合圖6可知，以cAMP/cGMP為第二信使的G蛋白偶聯(lián)受體的信號傳導(dǎo)涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等重要生理過程。因此，從某種層面上，萊菔子或許可與多種病理生理狀態(tài)相聯(lián)系。例如cAMP通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解以預(yù)防阿爾茨海默病、帕金森病等慢性神經(jīng)退行性疾病[27]，本研究對萊菔子的靶點(diǎn)基因富集結(jié)果提示萊菔子對認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶可能具有一定影響。實(shí)驗(yàn)研究表明，萊菔子所含萊菔硫烷有很強(qiáng)的生物活性，對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用[28]，國內(nèi)已有學(xué)者申請了萊菔子有效成分用于制備治療腦萎縮的藥品專利[29]。此外，cAMP信號傳導(dǎo)在腫瘤及心血管疾病中也扮演著重要角色[30]，相應(yīng)地，對萊菔子的抗腫瘤作用早已進(jìn)行挖掘研究[31]，其降壓和血管內(nèi)皮保護(hù)作用已被充分利用[25-28]。

另外，萊菔子還具有抗感染、止咳化痰作用[32-33]。本研究結(jié)果顯示，萊菔子對胃腸動(dòng)力的作用靶點(diǎn)5-HT受體、組胺受體、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、蛋白激酶Cα型（PRKCA）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）在炎癥相關(guān)信號傳導(dǎo)方面扮演著重要角色[34-35]。這與中醫(yī)“肺胃同治”思想內(nèi)核一致。由紫蘇子、萊菔子、芥子組成的三子養(yǎng)親湯，以肺胃同治為法，降氣消食，溫化痰飲，消脹定喘?，F(xiàn)今許多止咳化痰平喘經(jīng)驗(yàn)方亦多效仿此法，以萊菔子為君藥奏止咳定喘之功[36-37]。本課題組長期致力于研究肺胃積熱證經(jīng)驗(yàn)方銀萊湯，以金銀花、萊菔子為君，配伍連翹、黃芩、前胡、魚腥草、瓜蔞，兩清肺胃、消積化滯，臨床療效令人滿意[38-39]。上述研究結(jié)果與中醫(yī)整體觀及現(xiàn)代生物學(xué)的系統(tǒng)論相吻合。

總而言之，本研究基于虛擬篩選和數(shù)據(jù)挖掘提出萊菔子調(diào)節(jié)胃腸功能的可能機(jī)制，并基于相關(guān)信號通路和生物過程歸納萊菔子增強(qiáng)胃腸動(dòng)力及其附加功效，提示萊菔子對胃腸動(dòng)力具有多靶點(diǎn)、多通道的作用特點(diǎn)，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究及臨床實(shí)踐提供參考。當(dāng)然，靶點(diǎn)預(yù)測由于復(fù)雜的計(jì)算過程存在假陽性可能，現(xiàn)有基因功能、信號通路數(shù)據(jù)庫也可能存在對熱點(diǎn)研究問題的偏倚，故本研究提出的觀點(diǎn)仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。萊菔子與在胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用的Cajal間質(zhì)細(xì)胞的具體關(guān)系仍有待探索，這或許可以成為后續(xù)研究的出發(fā)點(diǎn)。如何利用胃腸動(dòng)力與感染的關(guān)系闡釋中醫(yī)“肺胃同治”的前瞻性，亦可作為后續(xù)研究的重點(diǎn)。

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Effect Mechanism of Raphani Semen on Gastrointestinal Mobility Based on Network Pharmacology Approach

LONG Chaojun, BAI Chen, HUANG Ling, HE Jianzhen, LIU Shaoyang, CUI Lijun, XIAN Fuyang,WANG Bochuan, YU He, LIU Tiegang, GU Xiaohong

To explore the effects and mechanism of Raphani Semen on gastrointestinal motility through application of network pharmacology approach; To guide the clinical application of Raphani Semen.Fried Raphani Semen decoction was analyzed by UPLC/Q-TOF-MS to infer its chemical constituents. ChemSpider database was used to obtain the properties of compounds of Raphani Semen, and the potential targets of Raphani Semen were obtained through the SwissTargetPrediction platform. The genes related to gastrointestinal mobility were obtained by GeneCard, HPO database and PALM-IST, PolySearch2 literature mining server. String database was used to construct the drug target gene- gastrointestinal motility gene network, and Cytoscape software was used to visualize the network and perform network topology analysis. The core gene function and pathway enrichment analysis were conducted through the Metascape platform.Totally 148 gastrointestinal mobility-related-genes were found in Raphani Semen, and 95 target genes of Raphani Semen were directly related to gastrointestinal motility, among which 11 intersection genes were screened out. 584 related results of gene function and pathway enrichment analysis were obtained.Raphani Semen has multi-target and multi-pathway effects on gastrointestinal motility, and its active ingredients have certain structural similarities with neuroactive substances such as 5-HT, which may affect the contraction and relaxation of smooth muscle of the gastrointestinal tract by activating G protein coupled receptor signaling pathway with cAMP/cGMP as the second messenger, Ca2+signaling pathway and other cation channels.

network pharmacology; Raphani Semen; gastrointestinal motility

R285.5

A

1005-5304(2020)12-0083-08

10.19879/j.cnki.1005-5304.201909360

國家自然科學(xué)基金（81973724）；北京市科技專項(xiàng)（Z181100006218083）

劉鐵鋼，E-mail：liutiegang2009@163.com

（2019-09-25）

（2019-11-12；編輯：陳靜）