檢測(cè)食品中汞、鎘、鉛、砷等重金屬離子的固相熒光傳感器

王 洋，熊金恩，李 壹，熊曉暉

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800)

目前重金屬離子的檢測(cè)可以通過(guò)許多儀器分析方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，如石墨爐原子吸收光譜法(AAS)、比色法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)和熒光分光光度法等[1]，但是這些技術(shù)的主要缺點(diǎn)是儀器一定程度上笨重且昂貴，操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，相關(guān)程序繁瑣，不能快速檢測(cè)。熒光分子探針技術(shù)恰好彌補(bǔ)了這一缺點(diǎn)，但仍然需要開(kāi)發(fā)具有改進(jìn)性質(zhì)的重金屬離子熒光分子探針，例如具有實(shí)際樣品檢測(cè)的可行性，對(duì)有毒有害重金屬一步廣譜篩查的能力，多次循環(huán)使用等性能的新型熒光分子探針。

用于實(shí)時(shí)響應(yīng)、高選擇性、高靈敏度檢測(cè)中性和離子物質(zhì)的熒光化學(xué)傳感器相關(guān)技術(shù)是一個(gè)非常重要的研究領(lǐng)域[2]。近十年來(lái)，熒光傳感器技術(shù)日益更新，傳感器也具有了更優(yōu)秀的靈敏度和更廣的適用范圍[3-4]。研究者們對(duì)于將熒光化學(xué)傳感器應(yīng)用于檢測(cè)實(shí)際樣品中重金屬離子產(chǎn)生了極大興趣[5-7]。如今，針對(duì)感知、檢測(cè)重金屬或過(guò)渡金屬離子，傳感器技術(shù)更加偏向于形態(tài)固相載體化[8-12]方向發(fā)展。如Jia等[13]利用卟啉修飾的功能性水凝膠，能對(duì)Cu2+、Zn2+、Pb2+、Co2+、Hg2+和Ni2+等重金屬離子快速顯色反應(yīng)，這種新型傳感器水凝膠具有高強(qiáng)度、非常突出的抗壓性，有很大潛力應(yīng)用于重金屬離子痕量分析和一步可循環(huán)檢測(cè)金屬離子。與其他熒光性質(zhì)的材料相比，卟啉用來(lái)檢測(cè)重金屬具有特殊的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)?個(gè)吡咯環(huán)構(gòu)成的大π鍵使得卟啉具有相對(duì)較大的平面剛性結(jié)構(gòu)，這為識(shí)別重金屬離子提供了一個(gè)大平臺(tái)，其本身就是熒光染料，且具有高熱穩(wěn)定性和力學(xué)穩(wěn)定性[6]，在識(shí)別重金屬時(shí)，中間氮原子會(huì)與金屬絡(luò)合形成配位鍵，熒光猝滅，會(huì)產(chǎn)生鮮明的顏色變化[14]。

5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)對(duì)重金屬汞、鎘、鉛和砷等均有選擇性。聚苯乙烯微球具有巨大的比表面積[15]，可參與某些特殊反應(yīng)、附加特殊功能基團(tuán)，在生物、食品和化工等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[16]。本文中，筆者在聚苯乙烯微球表面修飾上TCPP，制得可重復(fù)使用、環(huán)境友好型、具有初步篩查食品中汞、鎘、鉛及砷含量等性能的卟啉基固相熒光傳感器(圖1)。

圖1 PS-TCPP檢測(cè)金屬離子的機(jī)制Fig.1 Schematic representation of PS-TCPP for detecting metals

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

甲醇、NaOH、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯甲基聚苯乙烯樹(shù)脂(PS-CL)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；TCPP、氯化銫，麥克林試劑(上海)有限公司；硝酸、乙腈，西隴化工股份有限公司；重金屬標(biāo)準(zhǔn)試劑(Ag、Pb、Cd、As、Hg、Cr)，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

ZF-20D型暗箱式紫外分析儀，上海寶山電光儀器廠；Cary 60型UV-Vis紫外分光光度計(jì)，安捷倫科技有限公司；78-1型磁力加熱攪拌器，上海司樂(lè)儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；RF5301PC型熒光分光光度儀,日本島津；移液槍，寶予德(中國(guó))有限公司；Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛公司；Sigma 300型掃描電子顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司。

1.3 卟啉基固相熒光傳感器的合成

化合物TCPP-Na的合成：將TCPP(0.15 g，0.2 mmol)放入圓底單口燒瓶，加入25 mL甲醇于60 ℃磁力攪拌，加熱至回流，再加入NaOH(0.02 g，0.5 mmol)，繼續(xù)加熱反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，旋蒸，去除溶劑，并于60 ℃將產(chǎn)物烘干，收集得化合物TCPP-Na。

固相熒光傳感器PS-TCPP的合成(圖2)：在圓底燒瓶中依次加入TCPP-Na(0.1 g，0.15 mmol),25 mL無(wú)水DMF,氯化微球PS-CL(0.3 g，0.6 mmol),氯化銫(14 mg，0.08 mmol),磁力攪拌在80 ℃反應(yīng)36 h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾洗去多余溶劑，得粗產(chǎn)物微球。將粗產(chǎn)物索氏抽提36 h，得紫紅色PS-TCPP。

圖2 PS-TCPP的合成路線Fig.2 Synthetic route of probe PS-TCPP

1.4 PS-TCPP的光譜性能測(cè)定

1.4.1 待測(cè)溶液的配制

TCPP儲(chǔ)備液。TCPP溶解于DMF中，配制成1.0 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?，熒光分析?shí)驗(yàn)時(shí)將儲(chǔ)備液用超純水稀釋至所需濃度。

金屬離子儲(chǔ)備溶液[17]。用相應(yīng)的金屬離子鹽試劑配制10 mmol/L的Sn2+、Fe2+、Al3+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+和Ba2+儲(chǔ)備水溶液，100 μmol/L的Ag+、Pb2+、Cd2+、As2+、Hg2+和Cr3+儲(chǔ)備溶液，熒光分析實(shí)驗(yàn)時(shí)用乙腈稀釋至目標(biāo)濃度。

1.4.2 熒光傳感器的光譜性能測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法

1)探針母液熒光分析。在10 mL比色管中加入10 μL探針母液，用超純水定容，搖勻后放置4 min。室溫下，取3 mL試液于1 cm普通石英比色皿中測(cè)量紫外-可見(jiàn)吸收光譜，做離子選擇性實(shí)驗(yàn)，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為590和652 nm，狹縫5 nm，帶寬5 nm。

2)固相熒光傳感器紅外分析。取約1 mg PS-TCPP粉末置于紅外儀的金屬凹槽內(nèi)，電子探頭下，進(jìn)行紅外光譜掃描。

3)固相熒光傳感器熒光分析。取約0.4 mg PS-TCPP加入超微量石英比色皿中，加入200 μL乙腈，再分別加入不同量的金屬離子儲(chǔ)備液，靜置2 min后，室溫下進(jìn)行熒光分析實(shí)驗(yàn)。激發(fā)波長(zhǎng)為590 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為652 nm，狹縫5 nm，帶寬5 nm。

1.4.3 食品樣品的處理[18]

采用干法灰化法，分別稱取0.2 g糯米粉、魷魚(yú)和豬頭肉等食品樣品放入坩堝內(nèi)，預(yù)灰化30 min后在馬弗爐內(nèi)500 ℃加熱4 h，取出灰化后樣品，加入0.5%HNO3200 μL，再用乙腈定容。

2 結(jié)果與討論

2.1 TCPP的選擇性

為了考察探針TCPP對(duì)金屬離子的選擇性識(shí)別性能，進(jìn)行光學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3(a)所示。由圖3(a)可知，探針TCPP中加入100倍濃度的堿金屬離子、堿土金屬離子和10倍濃度的過(guò)渡金屬離子后，除Na+外均產(chǎn)生了熒光猝滅現(xiàn)象。探針中加入Pb2 +、Cu2+、Cd2+、Fe2+、Ag+和Hg2+后，熒光強(qiáng)度明顯下降。由此說(shuō)明，探針卟啉TCPP有檢測(cè)低濃度重金屬離子的能力。

2.2 TCPP的鏡像實(shí)驗(yàn)結(jié)果

探針的DMF溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖和熒光發(fā)射譜如圖3(b)所示。由圖3(b)可知，其吸收峰位于414 nm，在514、548、591和648 nm處是探針卟啉的4個(gè)特征峰。當(dāng)探針在590 nm受激發(fā)，其最大發(fā)射峰出現(xiàn)在644 nm處，探針的熒光譜圖和吸收光譜圖呈鏡像對(duì)稱，與紫外吸收光譜相比，斯托克斯位移了230 nm。

圖3 DMF體系中探針TCPP的紫外可見(jiàn)吸收光譜和 熒光發(fā)射光譜Fig.3 UV-visible absorption spectrum and fluorescence emission spectrum of probe TCPP inDMF system

2.3 合成產(chǎn)物紅外譜(IR)與掃描電子顯微鏡(SEM)分析

圖4 紅外圖譜Fig.4 IR spectrum

與PS-CL相比，SEM圖譜顯示出聚苯乙烯微球宏觀形態(tài)和表面微觀變化(圖5)。由圖5可知，PS-CL全部由C、H、CL組成，TCPP含有N、O等元素，PS-TCPP比PS-CL多出了N和O的能譜峰，表面顆粒變多、紋理變少，表明TCPP已經(jīng)固載上了PS-CL表面。

2.4 PS-TCPP的響應(yīng)時(shí)間

取0.4 mg固相熒光傳感器PS-TCPP加入微量石英比色皿中，加入200 μL乙腈，再加入5 μL 5 μmol/L Hg2+乙腈溶液，室溫下進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)。激發(fā)波長(zhǎng)為590 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為652 nm，觀察5 min內(nèi)探針的熒光響應(yīng)情況，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：未加入Hg2+時(shí)，PS-TCPP的熒光強(qiáng)度基本不受時(shí)間影響；加入Hg2+后，2 min內(nèi)體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低，2 min后體系的熒光強(qiáng)度基本趨于恒定，可知探針PS-TCPP對(duì)重金屬離子的熒光響應(yīng)時(shí)間為2 min。

譜圖1為PS-CL的能譜圖，譜圖2為PS-TCPP的能譜圖圖5 PS-TCPP的掃描電鏡圖與能譜圖Fig.5 Scanning electron microscope and energy spectrum of PS-TCPP

圖6 探針PS-TCPP對(duì)重金屬Hg2+的熒光響應(yīng)-時(shí)間曲線Fig.6 Fluorescence response of probe PS-TCPP to Hg2+ at different time

2.5 溶液基質(zhì)中硝酸對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

采用的重金屬國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品溶劑中含有HNO3，用PS-TCPP傳感器對(duì)稀釋的重金屬國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品(單標(biāo))、與單標(biāo)重金屬稀釋溶液含同濃度硝酸的乙腈溶液進(jìn)行熒光分析，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知：加入重金屬離子鉛溶液后，PS-TCPP由深紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色；扣除HNO3對(duì)PS-TCPP的影響后，重金屬Hg2+、Pb2+等均對(duì)PS-TCPP仍然具有明顯的猝滅效果。

圖7 HNO3基質(zhì)對(duì)傳感器PS-TCPP熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effects of nitric acid matrix on fluorescence intensity of sensor PS-TCPP

2.6 熒光傳感器PS-TCPP的選擇性

為了研究固相熒光傳感器PS-TCPP對(duì)Hg2+、Pb2+等金屬離子的選擇性識(shí)別能力，向傳感器體系中分別加入同濃度的Hg2+、Pb2+、Cd2+、As3+及100倍量的堿金屬離子(Na+、K+)、100倍量的堿土金屬離子(Mg2+、Ca2+、Ba2+)和10倍量的過(guò)渡金屬離子(Cu2+、Cr3+、Ni2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+和Ag+)，使最后所有樣品體系中HNO3濃度相同，激發(fā)波長(zhǎng)均為590 nm，得不同金屬離子最大發(fā)射波長(zhǎng)652 nm處熒光猝滅程度，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，在同樣實(shí)驗(yàn)條件下，以Hg2+猝滅強(qiáng)度為100%，Pb2+、Cd2+和As3+的猝滅強(qiáng)度分別是45%、53%和52%，其他的金屬離子猝滅強(qiáng)度相對(duì)較小，干擾較小。綜上，PS-TCPP對(duì)Hg2+、Pb2+、Cd2+和As3+這4種有毒有害重金屬離子均具有選擇性。

圖8 熒光傳感器PS-TCPP的熒光性能Fig.8 Fluorescence properties of fluorescence sensor PS-TCPP

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

以空白樣品基質(zhì)檢測(cè)PS-TCPP的實(shí)際樣品應(yīng)用性能，配制不同濃度的Hg2+溶液，利用PS-TCPP進(jìn)行熒光測(cè)定。以Hg2+濃度為橫坐標(biāo)，熒光響應(yīng)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，分別得到米粉、魷魚(yú)和豬頭肉3種樣品基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程。

米粉樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為I=-470c+293，R2=0.992 6。在0.1～0.45 μmol/L濃度范圍內(nèi)，Hg2+濃度與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.99，檢出限為0.16 μmol/L (LOD=3σ/N[19]；σ為空白試樣最大發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差；N為線性范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)，滿足定量分析需要。

魷魚(yú)樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為I=-255c+293，R2=0.989 9。在0.125～0.6 μmol/L濃度范圍內(nèi)，Hg2+濃度與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.98，檢出限為0.30 μmol/L。

豬頭肉樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為I=-399c+424,R2=0.992 8。在0.1～0.65 μmol/L濃度范圍內(nèi)，Hg2+濃度與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.99，檢出限為0.19 μmol/L。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

除了以空白樣品基質(zhì)檢測(cè)PS-TCPP的實(shí)際樣品應(yīng)用性能之外，為評(píng)估實(shí)際食品樣品應(yīng)用能力，還需要加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。以未添加重金屬Hg2+的實(shí)際樣品作為空白對(duì)照，準(zhǔn)確稱取0.2 g豬頭肉、糯米粉和魷魚(yú)樣品，分別添加3個(gè)水平(0.2、0.5和1.0 μmol/L)的Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，攪拌混勻，再按照建立的方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)?？瞻讟悠?、金屬離子添加濃度及回收率見(jiàn)表1。

表1 食品樣品中Hg2+的添加回收率實(shí)驗(yàn)Table 1 Recovery experiment of Hg2+ in food samples

由表1可知：米粉基質(zhì)中，添加回收率為70%～121%，相對(duì)誤差為10%～30%；魷魚(yú)基質(zhì)中，添加回收率為94%～125%，相對(duì)誤差為2%～25%；豬頭肉基質(zhì)中，添加回收率為86%～110%，相對(duì)誤差為3%～14%?；緷M足痕量分析要求，表明PS-TCPP具有復(fù)雜食品樣品基質(zhì)重金屬離子檢測(cè)的可行性和實(shí)用性。國(guó)標(biāo)方法采用的原子熒光光譜法是精密的儀器檢測(cè)方法，而本研究制備的固相熒光傳感器是一種快速檢測(cè)方法，暫未達(dá)到精密儀器方法的檢測(cè)精度水平。

2.9 固相熒光傳感器PS-TCPP的重復(fù)性

由于熒光傳感器響應(yīng)的可逆性決定傳感器是否能夠再次回收利用，利用EDTA溶液考察PS-TCPP的可逆響應(yīng)情況，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知：向(PS-TCPP-Pb2+-乙腈溶液)體系中，數(shù)次逐滴加入EDTA水溶液(0.25 mmol/L)，并記錄熒光譜圖，可發(fā)現(xiàn)PS-TCPP-Pb2+-乙腈溶液體系加入EDTA絡(luò)合劑后，呈現(xiàn)出熒光增強(qiáng)的趨勢(shì)，熒光強(qiáng)度幾乎恢復(fù)到空白PS-TCPP的強(qiáng)度；用乙腈溶液洗滌上述使用過(guò)的PS-TCPP數(shù)次，重復(fù)Pb2+熒光滴定和EDTA溶液滴定步驟，傳感器PS-TCPP的熒光強(qiáng)度隨之產(chǎn)生猝滅、恢復(fù)熒光強(qiáng)度的效果。因此，PS-TCPP具有可重復(fù)使用的潛力。

圖9 純乙腈體系中PS-TCPP的重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)Fig.9 Repetitive experiment of PS-TCPP in CH3CN

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)合成了一種卟啉基固相熒光傳感器PS-TCPP，通過(guò)紅外譜圖、SEM圖及能譜圖等結(jié)構(gòu)確證。實(shí)驗(yàn)表明，PS-TCPP結(jié)合一定濃度汞等重金屬離子后，微球由深紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，以Hg2+的猝滅強(qiáng)度為100%，Pb2+、Cd2+和As3+的猝滅強(qiáng)度分別是45%、53%和52%，其他的金屬離子干擾較小，PS-TCPP對(duì)Hg2+、Pb2+、Cd2+和As3+等有毒有害重金屬離子均具有選擇性，可同時(shí)檢測(cè)Hg2+、Pb2+、Cd2+和As3+等有毒有害重金屬離子。應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，Hg2+、Pb2+、Cd2+和As3+等濃度與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.9，滿足定量分析需要，有重復(fù)檢測(cè)食品中汞、鎘、鉛和砷等重金屬離子的潛力，有望作為食品快速檢測(cè)試劑。