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    側(cè)向免疫層析快速檢測(cè)牛乳中四環(huán)素和青霉素

    2020-12-29 03:03:34吳玉晗
    食品科學(xué) 2020年24期
    關(guān)鍵詞:牛乳偶聯(lián)膠體金

    吳玉晗,陳 偉

    (合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

    四環(huán)素是廣譜類抗生素,是一種從放線菌金色鏈叢菌培養(yǎng)液分離出來的抗菌物質(zhì)[1],因具有優(yōu)良的廣譜抗菌性,預(yù)防和抗病能力強(qiáng),被廣泛用于治療和預(yù)防動(dòng)物疾病。但由于在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中的不合理使用和濫用,造成四環(huán)素在牛乳中的殘留問題[2]。許多國(guó)家都規(guī)定了牛奶中四環(huán)素的殘留限量,歐盟及我國(guó)對(duì)四環(huán)素最大殘留限量的規(guī)定均為0.1 mg/kg[3]。青霉素是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有 β-內(nèi)酰胺環(huán)的一類抗生素[4],它由于能夠阻止細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而呈現(xiàn)殺菌活性,常用于預(yù)防和控制各種細(xì)菌引起的動(dòng)物的尿道、胃腸道和呼吸道感染,治療奶牛的乳腺炎[5]。青霉素G由于其廣譜、價(jià)格低廉而被大量甚至是超劑量的使用,導(dǎo)致牛乳中含有較高劑量的殘留物,進(jìn)而通過食物鏈危害人體健康,人體長(zhǎng)期攝入含有該抗生素殘留的食物易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加,過敏反應(yīng)和體內(nèi)菌群失調(diào)[6]等癥狀。

    目前報(bào)道的食物中四環(huán)素和青霉素抗生素殘留的檢測(cè)方法主要有儀器分析法[7-9]、微生物測(cè)定法[10-11]和免疫分析法[12-13]。儀器分析法主要包括高效液相色譜法[14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15],其準(zhǔn)確性高,但存在設(shè)備操作復(fù)雜、耗時(shí)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)操作人員要求高、難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要。微生物法雖然檢測(cè)成本低,但靈敏度不高,容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果?,F(xiàn)常用的免疫分析法包括酶聯(lián)免疫檢測(cè)法[16]和放射免疫分析法[17],具有快速、靈敏等特點(diǎn),但兩者的前處理過程較為復(fù)雜,對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模篩查樣品有很大的局限性。

    側(cè)向免疫層析技術(shù)是近幾年來發(fā)展比較迅速的制備檢測(cè)試紙條基本方法的快速檢測(cè)技術(shù)[18],其以條狀纖維層析材料為固相,借助毛細(xì)管的吸附作用使樣品在層析材料上移動(dòng),樣品中的待測(cè)物與層析材料上一定區(qū)域的配體發(fā)生特異性的免疫結(jié)合反應(yīng),通過可目測(cè)標(biāo)記物(如膠體金)的顯色反應(yīng)短時(shí)間獲得直觀的測(cè)試結(jié)果,廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)和食品檢測(cè)等領(lǐng)域[19-20]。膠體金免疫層析技術(shù)以膠體金為示蹤標(biāo)記物,將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合 起來[21]。其靈敏度高、對(duì)操作人員要求低,并且不需要昂貴的儀器設(shè)備,易于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),主要作為定性或半定量篩選檢測(cè)手段[22]。目前已有使用金標(biāo)免疫層析法檢測(cè)牛乳中的β-內(nèi)酰胺和四環(huán)素類抗生素,其最低檢測(cè)靈敏度僅可達(dá)到4 ng/mL和80 ng/mL[23],其中四環(huán)素檢測(cè)的檢出限遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。近幾年也有很多關(guān)于使用膠體金免疫層析法單獨(dú)檢測(cè)四環(huán)素類抗生素的研究,但其檢測(cè)靈敏度都不是很高,比如檀尊社等[24]研制的膠體金免疫層析試劑,檢測(cè)的水產(chǎn)品中四環(huán)素含量,檢出限為100 ng/mL。本研究以膠體金側(cè)向免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ),加以改進(jìn),采用牛乳樣品與金標(biāo)抗體提前孵育后上樣的方法,與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比靈敏度得到顯著提高,達(dá)到了增敏的效果。且牛乳樣品不需要前處理,操作簡(jiǎn)單,大大提高了檢測(cè)效率,可實(shí)現(xiàn)快速同時(shí)檢測(cè)牛乳樣品中兩種抗生素的目的,適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    牛乳 市購(gòu);氯金酸(分析純) 百靈威科技有限公司;檸檬酸三鈉、碳酸鉀(均為分析純)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,純度>98%) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;青霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9%)、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品(化學(xué)純) 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)中心;青霉素、四環(huán)素抗體和包被 天津生物科技有限公司;羊抗鼠二抗、吸水墊、樣品墊、PVC支撐底板和硝酸纖維素膜 上海捷寧生物有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Heraeus Fresco 17高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛科技公司;AL104分析天平 上海精天電子儀器有限公司;EOS600D單反相機(jī) 佳能光學(xué)設(shè)備有限公司;XYZ-3試紙條噴膜儀、CM-4000試紙條切條機(jī) 美國(guó)Bio-Dot公司;RCT加熱磁力攪拌器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司;移液器 芬蘭雷勃公司;DHG-9101-SA 恒溫干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 膠體金的制備

    采用檸檬酸三鈉還原法制備[25]。將50 mL雙蒸水倒入250 mL錐形瓶中,再滴加850 μL 5 mg/mL氯金酸溶液于雙蒸水中,置于磁力加熱攪拌器上加熱到微沸。當(dāng)錐形瓶中液體微沸后,保持1 500 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速不變,再迅速加入一定體積質(zhì)量濃度為10 g/L的檸檬酸三鈉溶液。溶液顏色在2 min內(nèi)發(fā)生明顯變化,透明-黑-紫-酒紅,至顏色不變后,關(guān)閉熱源,繼續(xù)攪拌5 min即可,冷卻,于4 ℃冰箱保存。

    1.3.2 單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備

    取1 mL制備好的膠體金溶液,用0.1 mol/L碳酸鉀溶液,調(diào)至pH值約為7.2,再加入6 μL四環(huán)素抗體振蕩反應(yīng)1 h后,再加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的BSA溶液,繼續(xù)振蕩反應(yīng)0.5 h,9 600 r/min離心10 min,產(chǎn)生紅色沉淀;10% BSA 100 μL復(fù)溶后即可得到四環(huán)素的金標(biāo)抗體溶液,置4 ℃?zhèn)溆?。按同樣的方法制備青霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。

    1.3.3 膠體金雙重試紙條的組裝

    試紙條由樣品墊、NC膜和吸水墊3 個(gè)部分組成。首先將寬度為22 mm玻璃纖維素膜在樣品墊預(yù)處理液中浸泡2 h后,取出于27 ℃條件下烘干待用。然后將羊抗鼠二抗、四環(huán)素-BSA和青霉素-BSA用10 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)稀釋至1 mg/mL,用噴膜儀依次噴至NC膜上,作為質(zhì)控線和兩條檢測(cè)線,27 ℃烘干2 h后取出,最后將樣品墊、NC膜和吸水墊依次粘貼在塑料底板上,用切條機(jī)切割成3 mm寬的試紙條保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.4 試紙條的檢測(cè)

    1.3.4.1 偶聯(lián)過程中抗體添加量的優(yōu)化

    在膠體金與標(biāo)記抗體偶聯(lián)過程中,加入不同添加量的抗體進(jìn)行偶聯(lián),確定最適宜的偶聯(lián)抗體條件。

    1.3.4.2 偶聯(lián)過程中偶聯(lián)pH值的優(yōu)化在膠體金與標(biāo)記抗體偶聯(lián)過程中,加入不同添加量碳酸鉀溶液進(jìn)行偶聯(lián),確定最適宜的偶聯(lián)pH值條件。

    1.3.5 靈敏度檢測(cè)

    取四環(huán)素和青霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用pH 7.2、0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液稀釋到不同質(zhì)量濃度,不同質(zhì)量濃度的混合溶液與金標(biāo)偶聯(lián)物在孵育器上孵育10 min后,滴加到試紙條上進(jìn)行測(cè)試,在孵育器上測(cè)試10 min后觀察試紙條顯線結(jié)果。

    1.3.6 特異性檢測(cè)

    將牛乳中常檢的其他抗生素、藥物和添加劑:克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、氯霉素用pH 7.2、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋后用試紙條進(jìn)行檢測(cè),判斷試紙條的特異性。

    1.3.7 添加回收實(shí)驗(yàn)

    向空白牛乳樣品中添加四環(huán)素和青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其四環(huán)素和青霉素質(zhì)量濃度分別均為0.05、1、 2 ng/mL,依照1.3.5節(jié)方法進(jìn)行檢測(cè),得到的結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率,再分別對(duì)每種檢測(cè)物的3 個(gè)質(zhì)量濃度滴度平行測(cè)定8 次,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 檢測(cè)原理

    圖1 四環(huán)素和青霉素雙重檢測(cè)試紙條原理圖Fig. 1 Schematic diagram of the test strip used for detection of tetracycline and penicillin

    圖1 為四環(huán)素和青霉素雙重檢測(cè)的原理圖。當(dāng)C線、T1線和T2線均顯色,無論顏色深淺均表示牛乳樣品中兩種抗生素質(zhì)量濃度低于檢出限;當(dāng)C線和T2線顯色,T1線無顯色,表示牛乳樣品中四環(huán)素質(zhì)量濃度等于或高于檢出限;當(dāng)C線和T1線顯色,T2線無顯色,表示牛乳樣品中青霉素質(zhì)量濃度等于或高于檢出限。

    2.2 抗體量的優(yōu)化

    圖2 四環(huán)素(a)和青霉素(b)在不同抗體量下的試紙優(yōu)化結(jié)果Fig. 2 Optimization of antibody dose

    與金納米粒子偶聯(lián)的四環(huán)素與青霉素抗體量?jī)?yōu)化結(jié)果如圖2所示,向相同體積的金納米粒子溶液中加入不同體積1 mg/mL的四環(huán)素與青霉素抗體,可以明顯看出,隨著加入抗體體積的增大,陰性T線強(qiáng)度有明顯的提高,C線強(qiáng)度變化不明顯。四環(huán)素抗體量3 μL時(shí)陰性強(qiáng)度明顯強(qiáng)于1 μL時(shí)的抗體量,出于節(jié)約原料方面考慮,四環(huán)素選擇抗體量為3 μL;而青霉素隨著抗體量增加,陰性強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),青霉素抗體量選擇為5 μL。

    2.3 偶聯(lián)pH值的優(yōu)化

    免疫層析試紙條制備過程中偶聯(lián)pH值的選擇對(duì)檢測(cè)靈敏度極為重要。用制備的試紙條對(duì)不同質(zhì)量濃度的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖3所示,比較偶聯(lián)添加不同碳酸鉀量,可以看出,四環(huán)素在碳酸鉀添加量為5 μL時(shí)靈敏度較3 μL時(shí)高,陰性較7 μL時(shí)強(qiáng),所以四環(huán)素的碳酸鉀添加量選擇5 μL;青霉素隨著碳酸鉀添加量的增加,陰性有減弱的趨勢(shì),而靈敏度并沒有因此增加,因此青霉素偶聯(lián)碳酸鉀量選擇2 μL。

    圖3 四環(huán)素(a)和青霉素(b)在不同偶聯(lián)pH值下的試紙優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Optimization of pH for coupling reaction

    2.4 四環(huán)素和青霉素的單重檢測(cè)結(jié)果

    制作好的免疫膠體金試紙條于肉眼下觀察,10 min即可出現(xiàn)結(jié)果。分別對(duì)四環(huán)素和青霉素利用雙重試紙條進(jìn)行靈敏度檢測(cè),由圖4a、b可得,在只有四環(huán)素或者青霉素獨(dú)立存在的情況下,隨著四環(huán)素和青霉素質(zhì)量濃度的增大,檢測(cè)線的顯線強(qiáng)度不斷減弱,且四環(huán)素和青霉素靈敏度分別達(dá)到1 ng/mL和2 ng/mL。再根據(jù)顯色結(jié)果對(duì)T1、T2線作出峰形圖,結(jié)果如圖4c、d所示,在只有四環(huán)素存在的情況下,T1線信號(hào)強(qiáng)度峰值隨著四環(huán)素質(zhì)量濃度增高而不斷降低,T2峰值穩(wěn)定;在只有青霉素存在的情況下,T2線信號(hào)強(qiáng)度峰值隨著青霉素濃度增高而不斷降低,T1峰值穩(wěn)定,表明四環(huán)素和青霉素互相之間不存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象。

    圖4 四環(huán)素(a、c)和青霉素(b、d)的單重檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 Results of separate detection of tetracycline and penicillin

    2.5 四環(huán)素和青霉素的雙重檢測(cè)結(jié)果

    同時(shí)對(duì)四環(huán)素和青霉素進(jìn)行靈敏度檢測(cè),即將二者的標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋不同質(zhì)量濃度后混合上樣,10 min后觀察結(jié)果如圖5a所示,隨著四環(huán)素和青霉素質(zhì)量濃度的增大,兩條T線顏色均逐漸減弱,且檢出限皆可達(dá)到 2 ng/mL。再根據(jù)顯色結(jié)果對(duì)C、T線作出峰形圖以及根據(jù)峰形圖得出的線性圖,結(jié)果如圖5b所示,T1和T2的峰高均隨著兩種抗生素質(zhì)量濃度的增大而逐漸減弱。結(jié)果表明,在0~2 ng/mL的四環(huán)素和青霉素質(zhì)量濃度范圍內(nèi),根據(jù)試紙檢測(cè)結(jié)果T線強(qiáng)度峰面積和四環(huán)素與青霉素同時(shí)檢測(cè)質(zhì)量濃度關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所建立的免疫膠體金檢測(cè)方法對(duì)四環(huán)素和青霉素的同時(shí)檢測(cè)具有良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程分別為Y1=435-1 612X(=0.995 6)和Y2=252-1 086X(=0.989 3)。

    圖5 四環(huán)素和青霉素的雙重檢測(cè)結(jié)果Fig. 5 Results of simultaneous detection of tetracycline and penicillin

    2.6 特異性驗(yàn)證結(jié)果

    圖6 四環(huán)素和青霉素的特異性檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Specificity evaluation of the test strip for detection of tetracycline and penicillin

    如圖6所示,選取另外幾種牛乳中常檢的抗生素和添加劑:克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、氯霉素、鏈霉素。6 種小分子及四環(huán)素和青霉素的檢測(cè)質(zhì)量濃度均為1 μg/mL。如圖6a所示,四環(huán)素和青霉素結(jié)果的T線完全消失,四環(huán)素的T1線消失,青霉素的T2線消失,其余6 種小分子的檢測(cè)結(jié)果相同,即3 條線同時(shí)存在,說明質(zhì)量濃度為1 μg/mL的6 種小分子均不能使試紙檢測(cè)達(dá)到消線水平,同時(shí)對(duì)顯線結(jié)果做出了峰形 (圖6b),都說明此方法的特異性很強(qiáng)。

    2.7 添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    將四環(huán)素和青霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入空白牛乳樣品中,使其四環(huán)素和青霉素質(zhì)量濃度分別均為0.05、1、2 ng/mL,每個(gè)滴度設(shè)8 個(gè)重復(fù),樣品準(zhǔn)備好后,用免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè),并用Image J掃描其結(jié)果得到T線灰度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算四環(huán)素和青霉素含量及其回收率。如表1所示,四環(huán)素回收率在98.6%~100.2%之間,青霉素回收率在97.1%~101.3%之間。

    表1 牛乳樣品中四環(huán)素和青霉素的添加回收實(shí)驗(yàn)Table 1 Recoveries of tetracycline and penicillin spiked in milk samples

    3 結(jié) 論

    膠體金側(cè)向免疫層析技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)[26],由于其高效、簡(jiǎn)便、快速的性能,在現(xiàn)場(chǎng)篩查中得以廣泛應(yīng)用。多元檢測(cè)是膠體金免疫層析法發(fā)展的趨勢(shì),它能同時(shí)高效檢測(cè)目標(biāo)物,降低檢測(cè)成本[27]。本實(shí)驗(yàn)基于膠體金側(cè)向免疫層析方法,建立能同時(shí)檢測(cè)牛乳中殘留的四環(huán)素和青霉素的方法,結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)研制的試紙條能達(dá)到聯(lián)檢的目的,特異性較高。此外該方法舍棄了使用金標(biāo)墊的傳統(tǒng)型試紙條檢測(cè)方法,利用預(yù)孵育的高效性,與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比,既保留了檢測(cè)樣品無需預(yù)處理、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn),又顯著提高了檢測(cè)靈敏度[28]。在最優(yōu)化條件下增敏型試紙條對(duì)四環(huán)素和青霉素的檢出限為2 ng/mL,檢測(cè)時(shí)間10 min,檢測(cè)特異性好,同時(shí)也適用牛乳樣品中四環(huán)素和青霉素殘留檢測(cè)。

    本研究成功建立了四環(huán)素和青霉素的雙重免疫層析試紙條檢測(cè)方法,研制的試紙條對(duì)四環(huán)素和青霉素具有很高的特異性和敏感性。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明,該試紙條使用方便、快捷且操作簡(jiǎn)單,在對(duì)大量食品樣本現(xiàn)場(chǎng)篩檢方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值,為我國(guó)現(xiàn)有食品檢測(cè)技術(shù)提供了重要參考[29-30]。

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