基于UPLC-MS代謝組學(xué)技術(shù)的棗果皮黃酮類化合物分析

王樂飛，古紹彬,2，吳 影,2,

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，食品加工與安全國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 洛陽 471023）

棗（Zizyphus jujubaMill.）是鼠李科棗屬植物，在我國具有6 000余年的種植歷史，并廣泛分布在歐洲、南亞和東亞、澳大利亞等地[1]。迄今為止，中國已發(fā)現(xiàn)700余棗樹品種[2]。中國是唯一的棗果出口國家，它的種植面積已達(dá)150萬 公頃，年產(chǎn)新鮮棗果420萬 t[3]。棗果含有豐富的生物活性物質(zhì)，具有良好的營養(yǎng)和保健價值，可直接食用，也可用作食品添加劑和調(diào)味劑[4]。研究表明，棗果含有多種營養(yǎng)成分，包括三萜酸、黃酮、磷脂、氨基酸、酚酸、礦物成分和多糖[5-10]，具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗炎殺菌、鎮(zhèn)靜等多種作用[11-14]。

棗果是含有黃酮類化合物的“木本糧食”之一，對人類飲食具有重要貢獻(xiàn)[15-16]，黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物的重要組成部分，包括花青素、黃烷類、黃酮、黃烷酮、黃酮醇和查爾酮等[17]。研究表明黃酮類化合物具有許多生物學(xué)功能和保健作用，如抗氧化、抗糖尿病、抗炎和降低高血壓[18-19]。此外，黃酮類化合物與果皮顏色密切關(guān)聯(lián)[20-22]，黃酮類化合物是重要的水溶性色素，是很多水果呈現(xiàn)紅色的原因，包括蘋果、葡萄、草莓和 荔枝[23-25]。盡管人們對黃酮類化合物抗氧化活性研究較為深入和系統(tǒng)，但有關(guān)黃酮類化合物種類、含量及變化規(guī)律與棗果皮顏色間的內(nèi)在關(guān)系卻鮮見報道[26]。

為研究棗果皮顏色變化和黃酮類化合物間的內(nèi)在關(guān)系，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）技術(shù)，結(jié)合代謝組學(xué)分析方法[27]，選取顏色區(qū)分顯明的3 個發(fā)育階段（即“三變紅”棗），分析黃酮類化合物的種類和含量與顏色變化的關(guān)系。利用主成分分析（principle component analysis，PCA）[28]，初步區(qū)分3 個不同的發(fā)育階段，繼而通過正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA），對不同階段黃酮類化合物進(jìn)行判別分析，通過聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）3 個不同發(fā)育階段黃酮類化合物的組成及含量的分布規(guī)律，并對關(guān)鍵黃酮代謝物篩選[29]。本研究可更好地理解棗果發(fā)育過程中形成顏色的黃酮類物及棗果特性，對揭示“三變紅”棗果著色機(jī)理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“三變紅”棗果來源于河南科技大學(xué)實(shí)習(xí)基地，如圖1所示，發(fā)育階段S1為紫紅色、S2為綠白色、S3為深紅色，分別對應(yīng)于開花后的第30、95、120天形態(tài)。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Meker公司。

圖1 “三變紅”棗果實(shí)發(fā)育的顏色變化Fig. 1 Color changes during fruit development of “Sanbianhong” jujube

1.2 儀器與設(shè)備

6500 QTRAP UPLC-MS儀 美國AB Sciex公司；MM 400研磨儀 德國Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集和預(yù)處理

為了使統(tǒng)計數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確，隨機(jī)選取表型性狀穩(wěn)定，具有相似的活力、樹齡和高度的3 棵棗樹，每棵棗樹作為1 個樣品，進(jìn)行了立體采樣，在棗樹的東西南北4 個方向采樣，S1、S2、S3期分別采集棗果40 g左右，去掉果核，用小刀輕輕刮去棗肉，直到無肉眼可見明顯果肉，獲得棗皮后，利用研磨儀磨棗皮（30 Hz，1.5 min）至粉末狀，稱取100 mg的粉末，溶于1.0 mL提取液（70%的甲醇溶液）中，溶解后樣品放置4 ℃冰箱12 h，每隔4 h渦旋1 次，共渦旋3 次，以提高提取率， 10 000×g離心10 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：A為體積分?jǐn)?shù)0.04%乙酸溶液，B為體積分?jǐn)?shù)0.04%乙酸-乙腈溶液；洗脫梯度：0～11 min，95% A，5% B；11～12 min，95%～5% A，5%～95% B；12～15 min，5%～95% A，95%～5% B；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源溫度500 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，氣簾氣25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿中，每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行掃描檢測。

1.3.4 黃酮類化合物分析

1.3.4.1 定性分析

利用軟件Analyst 1.6.1進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，基于自建數(shù)據(jù)庫MWDB（含有5 000 種以上小分子化合物的一級和二級圖譜）及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫（ChemBank：http://chembank.med.harvard.edu/compounds；pubchem：https://pubchemblog.ncbi.nlm.nih.gov/；NIST Chemistry Webbook：http://webbook.nist.gov/）。根據(jù)二級譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，分析時去除了同位素信號，含K＋、Na＋、NH4＋的重復(fù)信號，以及本身是其他更大分子質(zhì)量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號。

1.3.4.2 定量分析

黃酮物質(zhì)定量是利用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式分析完成。對于已鑒定的黃酮類化合物，計算一級質(zhì)譜中的提取離子色譜峰的峰面積，對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正[30]，對棗果皮黃酮類化合物的相對含量進(jìn)行比較分析。

1.3.4.3 總黃酮含量的測定

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別吸取0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.528 mg/mL）于5 個25 mL容量瓶中，加入12.5 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液、0.7 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置5 min，加入0.7 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3溶液，靜置6 min后，再加入5 mL 1 mol/L 的NaOH溶液，搖勻后用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液定容，10 min后以試劑空白為參比，在510 nm波長處測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。

2）樣品總黃酮含量的測定

從棗皮黃酮提取物中準(zhǔn)確吸取0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，測定其在510 nm波長處的吸光度，然后按下式計算總黃酮含量（以干質(zhì)量計）：

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 23.0（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan倍數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)評估確定顯著異，P＜0.05，差異顯著。使用OriginPro 2016和Adobe Illustrator CC繪制圖片，HCA、PCA和OPLSDA，使用R（http://www.r-project.org/）進(jìn)行[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 “三變紅”果實(shí)發(fā)育過程中棗皮總黃酮含量定量分析

圖2 “三變紅”3 個不同發(fā)育階段棗皮總黃酮的含量分析Fig. 2 Total flavonoid contents at three different developmental stages of “Sanbianhong” jujube

如圖2所示，3 個不同發(fā)育時期，S1的總黃酮含量略高于S3（P＞0.05），但顯著高于S2（P＜0.05），達(dá)到4.94 mg/g。S3中總黃酮含量為4.45 mg/g。S2的總黃酮含量最低，僅為0.95 mg/g。在“三變紅”棗果S1～S3不同發(fā)育時期，棗果顏色從深到淺再到深，總黃酮含量變化趨勢與之相同，從高到低再到高，表明總黃酮含量與棗果皮顏色變化呈正相關(guān)。

2.2 棗果不同發(fā)育時期的黃酮代謝判別分析

基于棗果實(shí)不同發(fā)育時期總黃酮含量建立了PCA模型（圖3A），由于采用無監(jiān)督的降維分析方法，統(tǒng)計分析結(jié)果表明，總黃酮無法以不同發(fā)育時期為指定變量獲得較好聚類效果。為此，采用OPLS-DA法，通過對不同處理樣本（如觀測樣本、對照樣本）的特性分別進(jìn)行訓(xùn)練，產(chǎn)生訓(xùn)練集，并預(yù)先對所需的觀察變量進(jìn)行分組，然后根據(jù)組別性質(zhì)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，從而精確獲悉影響分組的關(guān)鍵變量。以R對棗果不同發(fā)育時期總黃酮相對含量為基礎(chǔ)進(jìn)行分析，建立了OPLS-DA模型，如圖3B所示，該OPLS-DA模型將棗果3 個不同發(fā)育時期清楚地區(qū)分開，且重復(fù)的樣品緊湊地聚集在一起，從而表明該實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和可靠性。PC1解釋了總變量的53.9%，PC2解釋了總變量的19.3%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到73.2%，2 個PC可很好地解釋總體變量的情況。由于當(dāng)變量數(shù)大于樣品數(shù)時，使用有監(jiān)督判別方法進(jìn)行分析時易產(chǎn)生過擬合現(xiàn)象，因此采用了置換檢驗(yàn)法對OPLS-DA在無差異情況下的建模效果進(jìn)行了考察（n=200，即進(jìn)行200 次排列實(shí)驗(yàn)），結(jié)果如圖3C所示。通過對OPLS-DA進(jìn)行排列驗(yàn)證，Q2為0.963，遠(yuǎn)大于0.5，結(jié)果表明該模型擬合優(yōu)異，且R2Y大于Q2，R2Y和Q2的差值小于0.3，表明該模型的解釋度和預(yù)測度較優(yōu)。

圖3 棗果不同發(fā)育時期PCA得分圖和OPLS-DA得分圖及其驗(yàn)證模型Fig. 3 PCA score plot, OPLS-DA score plot and verification model for total flavonoid contents at different developmental stages of jujube fruit

2.3 黃酮類化合物差異代謝物篩選

基于OPLS-DA結(jié)果，獲得的多變量分析OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in project，VIP）初步篩選出不同樣品的差異代謝物；同時結(jié)合差異倍數(shù)值（fold change，F(xiàn)C）進(jìn)一步精選出差異代謝物。通常認(rèn)為FC≥2或FC≤0.5，同時VIP≥1的代謝物為差異代謝物；其中FC≥2或FC≤0.5表示代謝物在對照組和實(shí)驗(yàn)組中差異為2 倍以上或0.5以下，當(dāng)FC≥2表示差異上調(diào)，F(xiàn)C≤0.5則表示差異下調(diào)；VIP值則表示對應(yīng)代謝物組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強(qiáng)度，VIP≥1的代謝物為差異顯著?；赩IP和FC值，得出差異代謝物的火山圖（圖4）。

通過S1和S2比較，發(fā)現(xiàn)26 種差異代謝物，其中24 種下調(diào)，2 種上調(diào)，說明從幼果S1期紫紅色到白熟S2期綠白色，色澤逐步減退，黃酮類化合物大部分下調(diào)，通過S3和S2比較（圖4B），發(fā)現(xiàn)26 種差異代謝物，其中21 種下調(diào)，5 種上調(diào)，與成熟期S3相比，白熟期S2的酮類化合物大部分下調(diào)，與顏色的變淺保持一致。通過S1和S3比較（圖4C），發(fā)現(xiàn)6 種差異代謝物，3 種含量下調(diào)，3 種含量上調(diào)，S1和S2顏色差異不大，棗黃酮類化合物上調(diào)和下調(diào)的數(shù)量一致。本研究結(jié)果表明，棗黃酮類化合物隨著顏色的變化而變化，當(dāng)顏色變深時，黃酮類化合物大部分上調(diào)，顏色變淺時，呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢。Park等[32]研究證實(shí)色素分子的含量和種類是決定植物顏色的主要因素。Wang Aimin等[33]研究發(fā)現(xiàn)甘薯黃酮類化合物的種類與甘薯呈色呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，其中紫色甘薯中糖基化黃酮和金圣草素含量較為豐富，黃色甘薯和白色甘薯黃酮類物質(zhì)含量明顯低于紫色甘薯。Li Jing等[29]研究結(jié)果表明紅花蕎麥葉片中總黃酮的含量與色澤深度呈正相關(guān)，紅花蕎麥葉片黃酮類物質(zhì)含量最高，達(dá)到223.04 mg/g，而當(dāng)黃酮類物質(zhì)低于 223.04 mg/g時，色澤偏弱。

圖4 黃酮類化合物差異代謝物火山圖Fig. 4 Volcano map of differential flavonoid metabolites

2.4 “三變紅”不同發(fā)育時期關(guān)鍵成分的HCA

圖5 3 個不同發(fā)育時期棗黃酮差異代謝物熱圖Fig. 5 Heat map of differential flavonoid metabolites among three fruit developmental stages

為更清晰探究“三變紅”棗果在發(fā)育過程中的顏色變化與黃酮類化合物的關(guān)聯(lián)特征，進(jìn)一步采用HCA對關(guān)鍵黃酮類化合物進(jìn)行分析。如圖5所示，這些關(guān)鍵差異性成分在S1、S2、S3中的含量分布上呈現(xiàn)一定的規(guī)律特征（圖中化合物相對含量從綠色到紅色為逐漸升高）。S1中的黃酮類代謝產(chǎn)物與S2和S3形成鮮明對比，含量具有較大差異，槲皮素3-O-蕓香糖苷、甲基槲皮素O-己糖苷、木犀草素O-芥子酰己糖苷、羥甲基黃酮5-O-己糖苷、柚皮素O-丙二酰己糖苷、3,4,5-三羥黃酮O-蕓香糖苷、6-C-己糖基-木犀草素O-己糖苷、異牧荊素，在含量分布上的變化趨勢最為明顯，其含量在S1中遠(yuǎn)高于S2和S3，被鑒定為S1階段的特征性物質(zhì)，這些物質(zhì)多為黃酮醇和黃酮碳糖苷，它們對S1發(fā)育期棗果的紫紅色形成可能發(fā)揮著重要作用。Beninger等[34]研究發(fā)現(xiàn)黃酮醇苷對菜豆種皮呈現(xiàn)紫色和紅色具有密切的相關(guān)性。Eiro等[35]研究進(jìn)一步證實(shí)黃酮醇多以糖苷態(tài)的形式存在，能與花色苷類物質(zhì)發(fā)生輔色作用，對顏色穩(wěn)定具有重要的作用。 S2的黃酮類化合物顯著低于S1和S3，這與S2期果實(shí)的所呈現(xiàn)出綠白的顏色較為吻合，含量較高僅有2 種，分別是C-己糖基木犀草素O-己糖苷、6-C-己糖苷-芹菜素O-己糖苷。S3中含量較高的物質(zhì)為矢車菊素O-己糖基、芹菜素O-己糖基-戊糖苷、槲皮素5-O-己糖苷-O-丙二酰己糖苷、金圣草黃素O-葡萄糖醛酸（水楊醇）醚O-二葡萄糖醛酸、金圣草黃素，這些物質(zhì)多為糖基化的黃酮，屬于黃酮糖苷類化合物中的花色苷類物質(zhì)，它們對S3時期棗皮呈現(xiàn)出深紅色具有重要影響。何丹等[36]在研究紫色西番蓮果皮花色苷時指出，花色苷是天然色素的主要成分之一，其可賦予水果、蔬菜和花卉等植物靚麗的藍(lán)色、紅色和紫色。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的上述差異性物質(zhì)可作為區(qū)分棗果皮顏色的潛在標(biāo)志物，為棗黃酮類化合物與棗果皮顏色的關(guān)聯(lián)研究提供理論基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以“三變紅”棗果不同發(fā)育時期為切入點(diǎn)，研究棗果皮顏色變化和黃酮類化合物的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S1的總黃酮含量略高于S3，但顯著高于S2 （P＜0.05），達(dá)到4.94 mg/g；而棗果從S1至S3期，顏色經(jīng)歷了從由紫紅到綠白再到深紅過程，總黃酮含量變化與棗果顏色變化呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，由此表明棗總黃酮的含量與棗果皮顏色變化表現(xiàn)為明顯正相關(guān)。利用PCA和OPLS-DA，將S1幼果期、S2白熟期和S3成熟期的黃酮類化合物清晰的HCA，并通過黃酮類化合物差異代謝物篩選出59 個差異代謝物。采用聚類熱圖分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素3-O-蕓香糖苷、甲基槲皮素O-己糖苷、木犀草素O-芥子酰己糖苷、羥甲基黃酮5-O-己糖苷、柚皮素O-丙二酰己糖苷、3,4,5-三羥黃酮O-蕓香糖苷、6-C-己糖基-木犀草素O-己糖苷、異牧荊素含量在S1中遠(yuǎn)高于S2和S2，被鑒定為S1階段的特征性棗黃酮類化合物，這些物質(zhì)多為黃酮醇和黃酮碳糖苷，顏色多為紫色或者紅色，為棗皮的紫紅色起到較大的貢獻(xiàn)作用。S2的黃酮類化合物顯著低于S1和S3，這和果實(shí)呈現(xiàn)的顏色高度吻合，含量較高僅為C-己糖基木犀草素O-己糖苷、6-C-己糖苷-芹菜素O-己糖苷。S3中含量較高的物質(zhì)有5 種，分別為矢車菊素O-己糖基、芹菜素O-己糖基-戊糖苷、槲皮素5-O-己糖苷-O-丙二酰己糖苷、金圣草黃素O-葡萄糖醛酸（水楊醇）醚O-二葡萄糖醛酸、金圣草黃素。本研究可更好地理解棗果發(fā)育過程中形成顏色的黃酮類化合物累積規(guī)律，為棗黃酮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。