高濃度氮摻雜多孔石墨烯的可控制備及類酶催化性質(zhì)

楊劍輝 孟祥鈺 唐明宇 周 潔 孫岳明 代云茜

(東南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南京 211189)

0 引 言

石墨烯因具有高比表面積(2 630 m2·g-1)和特殊的二維層狀結(jié)構(gòu)，能夠表現(xiàn)出優(yōu)異的物理、化學(xué)和力學(xué)性能，是一種很有前景的催化材料[1-2]。對(duì)石墨烯進(jìn)行雜元素的摻雜改性和納米孔洞刻蝕可以增大其缺陷度與活性位點(diǎn)，提升其催化活性，進(jìn)一步拓寬石墨烯的應(yīng)用范圍。目前常見(jiàn)摻雜方式主要包括氮摻雜、磷摻雜和硼摻雜等[3]。其中磷的摻雜率很低且摻雜后的石墨烯比表面積較低[4]，而硼摻雜后的石墨烯電負(fù)性遠(yuǎn)小于氮摻雜石墨烯的電負(fù)性[5]。氮摻雜后的石墨烯中氮原子能夠?qū)⒏嗟恼姾赊D(zhuǎn)移到與其相鄰的碳原子上，這不僅有效地提高其催化活性，還能保持其更優(yōu)異的穩(wěn)定性[6-8]。例如，氮摻雜碳納米管可以高效催化還原4-硝基苯酚[9]；氮摻雜石墨烯可作為良好燃料電池電極對(duì)氧還原反應(yīng)(ORR)進(jìn)行催化[10-11]。然而，目前大多數(shù)研究中，氮摻雜石墨烯的N/C原子比都在10%以下，而且需要退火、等離子體處理等復(fù)雜的合成步驟，反應(yīng)能耗高且對(duì)摻雜濃度與構(gòu)型的可控性低[5]。另外，針對(duì)石墨烯片層的納米孔洞刻蝕仍需要在強(qiáng)氧化性的化學(xué)環(huán)境條件下進(jìn)行，或者需要借助高能耗的激光轟擊，不僅不可避免地對(duì)環(huán)境造成污染，而且消耗大量燃料電力。合成涉及強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的液相環(huán)境，還會(huì)由于嚴(yán)重影響石墨烯表面電荷分布而造成石墨烯的急劇團(tuán)聚，使其比表面積下降[12-13]。因此，采用溫和、低能耗的合成方法來(lái)制備保留本征二維優(yōu)勢(shì)、具有可控的氮摻雜量、富含高密度納米孔的石墨烯材料具有深遠(yuǎn)的意義。

辣根過(guò)氧化物酶(HPR)是臨床檢驗(yàn)試劑中的一種常用生物酶，可高效分析血糖、尿液等健康指標(biāo)，近年來(lái)在先進(jìn)健康監(jiān)測(cè)與可穿戴醫(yī)療等方面得到廣泛應(yīng)用[14]。然而，天然酶面臨穩(wěn)定性差、合成成本高以及分離和純化困難等眾多瓶頸。人工合成的具有酶性質(zhì)的類酶催化劑因?yàn)槠湎噍^于生物酶不易失活，同時(shí)無(wú)需復(fù)雜的提純過(guò)程，便于儲(chǔ)藏，是代替天然酶的一種極具潛力的材料。近年來(lái)，研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)了包括貴金屬[15-16]、金屬氧化物[17-18]、金屬配合物[19-20]和非金屬碳材料[21]等在內(nèi)的多種類酶催化劑，它們?cè)谏飩鞲?、疾病診斷和健康監(jiān)測(cè)中顯示出良好的應(yīng)用潛力[22]。然而，由于金屬類酶催化劑高昂的價(jià)格和對(duì)環(huán)境、人體的重金屬污染，限制了其進(jìn)一步的發(fā)展。碳基類酶催化劑不僅來(lái)源廣泛、性質(zhì)穩(wěn)定、成本低廉，并且具有生物相容性高以及對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特征，從而成為代替金屬類酶催化劑的首選材料。其中，石墨烯基材料因?yàn)楹胸S富的含氧基團(tuán)和高比表面積，已經(jīng)被證明具有良好的類過(guò)氧化物酶的性質(zhì)，可以在H2O2參與下發(fā)生催化氧化，用于測(cè)定葡萄糖和農(nóng)藥殘余量等[23-24]。然而，石墨烯基類過(guò)氧化物酶雖具有穩(wěn)定性高、成本低等優(yōu)勢(shì)，但相較于金屬基類酶材料活性較低，可以通過(guò)可控化學(xué)氮摻雜和精細(xì)納米孔洞刻蝕改變石墨烯片層表面電子分布、吸附能以及傳質(zhì)速度，從而顯著提高其類酶活性。

我們通過(guò)溫和的水熱反應(yīng)，一步完成對(duì)石墨烯片層的高濃度可控氮摻雜(原子分?jǐn)?shù)13%)。同時(shí)，通過(guò)在此過(guò)程中的選擇性刻蝕、引入的納米孔洞密度高達(dá)86.5%(由Image J計(jì)算得到)，獲得具有高效催化氧化活性、寬pH值使用范圍的新型類酶催化劑。此外，我們進(jìn)行系統(tǒng)的平行實(shí)驗(yàn)研究其在類酶催化過(guò)程中的反應(yīng)路徑，證明其在反應(yīng)中遵循高效的氧氣參與的4電子轉(zhuǎn)移過(guò)程。本研究為設(shè)計(jì)具有選擇性反應(yīng)路徑的高效非金屬類酶催化劑提供具有吸引力的策略，同時(shí)為其未來(lái)在醫(yī)療、健康檢測(cè)等方面的應(yīng)用做出探索。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 氧化石墨烯的制備

首先稱取1 g石墨并向其中加入10 g氯化鈉固體，置于瑪瑙研缽中研磨10 min后，用去離子水洗滌干燥；取25.4 mL 98%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))濃硫酸，并將烘干后的石墨加入，攪拌10 h；然后均分成4份，向每一份中緩慢地加入3 g高錳酸鉀，待初步氧化后，使用油浴對(duì)其加熱，使其充分氧化；油浴結(jié)束后，逐次取28 mL蒸餾水和4 mL H2O2，分別加入4份反應(yīng)后的濁液中，除去未反應(yīng)完的高錳酸鉀；隨后用1.2 mol·L-1的鹽酸洗1次，水洗2次，除去未反應(yīng)完全的硫酸；最后，轉(zhuǎn)移水洗后的膠體于透析袋，用18.2 MΩ的超純水透析3 d，將合成過(guò)程中混入的離子去除，得到高純度的氧化石墨烯(GO)膠體。

1.2 氮摻雜石墨烯的制備

通過(guò)調(diào)控GO的濃度來(lái)合成不同氮摻雜度的氮摻雜還原氧化石墨烯(N-RGO)。分別取4、20、60、100、140 mg GO分散在5 mL氨水中，通過(guò)加入去離子水使總體積最終均為20 mL，以獲得0.2、1、3、5、7 mg·mL-1的前驅(qū)液。然后將溶液轉(zhuǎn)移到高壓釜中，180℃下反應(yīng)8 h，待其冷卻至室溫后，將高壓釜內(nèi)的懸浮液離心、水洗直至溶液呈中性，移取出下層固體即為N-RGO。

1.3 表征與測(cè)試

1.3.1透射電子顯微鏡

分別取少量制備好的N-RGO樣品，用超純水稀釋并分散均勻后，滴到普通碳膜支持的銅網(wǎng)上，并于室溫下晾干，用TecnaiG2透射電子顯微鏡(TEM，荷蘭FEI)在200 kV下對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.3.2拉曼光譜

將少許樣品滴于潔凈的硅片上，置于空氣中晾干，采用拉曼光譜儀(Raman，Thermo Fisher Scientific DXR Raman Microscope)測(cè)試樣品的拉曼光譜，激發(fā)波長(zhǎng)λ=532 nm。

1.3.3X射線光電子能譜

將樣品分次滴在硅片表面，自然晾干，采用X射線光電子能譜儀(XPS，Esea Lab 250，Thermo-VG Scientific)測(cè)試樣品的電子能譜信息。

1.3.4類酶催化性能測(cè)試

分別配置10 mmol·L-13，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰苯二胺(OPD)、2，2′-疊氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)(ABTS)溶液。取80 μL上述所配溶液至3個(gè)離心管中，分別繼續(xù)滴加0.86 mL pH值為3.5的HAc-NaAc緩沖液，充分混合后，再取60 μL N-RGO水溶液(GO濃度為5 mg·mL-1，機(jī)理和影響因素的研究等未特別注明的實(shí)驗(yàn)過(guò)程也均采用此樣品)滴加至該混合液(總體積為1 mL)。計(jì)時(shí)反應(yīng)3 min后，離心1 min，控制總反應(yīng)時(shí)間為4 min，取上層清液至石英比色皿中，采用Cary 60型號(hào)紫外可見(jiàn)光譜儀(Agilent Technologies)測(cè)定350～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)樣品的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 多孔氮摻雜石墨烯的制備與表征

圖1 (a)N-RGO(5 mg·mL-1)的TEM圖;(b)N-RGO樣品的ID/IG值;(c)N-RGO樣品的O/C和N/C原子比;(d)N-RGO樣品的APyridinic N/AN1s、APyrrolic N/AN1s和AGraphitic N/AN1sFig.1 (a)TEM image of N-RGO(5 mg·mL-1);(b)ID/IGof N-RGO samples;(c)Atomic ratio of O/C and N/C in N-RGO samples;(d)APyridinic N/AN1s,APyrrolic N/AN1sand AGraphitic N/AN1sin N-RGO samples

如圖1a所示，采用溫和的方法進(jìn)行了氮摻雜后，N-RGO出現(xiàn)了大量褶皺和分布均勻的3～5 nm的刻蝕孔洞，孔密度高達(dá)86.5%。引入了與碳原子尺寸不同的氮雜原子后，原本相對(duì)平整的sp2雜化碳六元環(huán)因不對(duì)稱的應(yīng)力而發(fā)生變形，因此石墨片層出現(xiàn)了明顯的皺褶。此外，水熱過(guò)程中水汽對(duì)GO片層產(chǎn)生強(qiáng)烈的刻蝕，蝕刻機(jī)理類似于煤炭氣化，碳原子與水蒸氣反應(yīng)生成CO和H2，留下碳空缺，最終變成大孔隙或者被水熱蒸汽逐漸破壞[25]。盡管制備過(guò)程中使用的GO濃度不同，但所得N-RGO形貌結(jié)構(gòu)基本保持不變[26-27]。這一結(jié)論與其他學(xué)者的研究一致，即使采用粒徑、尺寸、形貌不同的石墨合成的GO前驅(qū)體來(lái)制備N-RGO，N-RGO仍具有相似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征[28]。相比于激光或等離子刻蝕以及強(qiáng)氧化劑的氧化刻蝕[29-30]，我們報(bào)道的通過(guò)溫和氮摻雜在石墨烯片層上刻蝕豐富孔洞的策略具有較強(qiáng)的便捷性。

圖1b為由拉曼光譜得到的N-RGO樣品D帶和G帶的強(qiáng)度比(ID/IG)。拉曼光譜是用來(lái)探測(cè)碳材料結(jié)構(gòu)特征和電子狀態(tài)的重要手段，其中D峰(～1 350 cm-1)代表石墨烯的階梯邊緣和缺陷特性；G峰(～1 580 cm-1)代表一階的散射E2g振動(dòng)模式，對(duì)應(yīng)于sp2雜化碳原子的面內(nèi)振動(dòng)強(qiáng)度。隨著GO濃度的上升，ID/IG從0.96增加到1.23，缺陷明顯增多，這是由于氮元素?fù)诫s引起的褶皺和石墨烯被刻蝕產(chǎn)生的孔洞共同作用的結(jié)果，它們可為催化反應(yīng)提供豐富的活性位點(diǎn)。

采用XPS分析可以定性和定量研究N-RGO的化學(xué)組成。圖1c和d是根據(jù)XPS分析所得柱狀圖。相比GO，可以發(fā)現(xiàn)N-RGO中的O/C原子比有明顯的下降，說(shuō)明了GO被成功還原。水熱反應(yīng)過(guò)程中，分子內(nèi)或者分子間會(huì)脫去水，從而使羧基、環(huán)氧基、羥基等一些官能團(tuán)移除[5]。N-RGO的XPS出現(xiàn)了氮原子的吸收峰，且氮摻雜的濃度高(原子分?jǐn)?shù)在10%以上)。高濃度氮摻雜可有助于調(diào)節(jié)電子分布、注入負(fù)電子、增強(qiáng)催化活性[31]。摻雜后的氮有3種存在形式：石墨氮、吡啶氮和吡咯氮。有研究表明，石墨氮可以誘導(dǎo)電子從相鄰的碳原子轉(zhuǎn)移到氮原子，從而破壞sp2雜化的石墨烯六元環(huán)的化學(xué)惰性并改變石墨烯的催化活性[32]。石墨氮的原子分?jǐn)?shù)在11%～24.8%之間時(shí)，隨著GO濃度的升高，含量先增大后減小，且在GO濃度為5 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最大值，可以預(yù)測(cè)此濃度下制備的N-RGO具有優(yōu)異的催化性能。在GO濃度從0.2 mg·mL-1變化到7 mg·mL-1的過(guò)程中，N/C原子比始終控制在13%左右，這說(shuō)明原始的氧化石墨烯的摻雜位點(diǎn)已經(jīng)被過(guò)量氮源摻雜到飽和狀態(tài)。同時(shí)，O/C原子比例從最初的56%快速下降到13%左右。這些結(jié)果表明在一步水熱反應(yīng)中氮原子摻雜和含氧官能團(tuán)的去除是同時(shí)進(jìn)行的。

2.2 多孔氮摻雜石墨烯的催化氧化

2.2.1催化氧化性能

以GO濃度為5 mg·mL-1的N-RGO為例，研究其催化性能、機(jī)理及影響因素。由圖2a發(fā)現(xiàn)，N-RGO可以催化TMB產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)生成ox-TMB，催化OPD產(chǎn)生橘色反應(yīng)生成ox-OPD，催化ABTS產(chǎn)生綠色反應(yīng)生成ox-ABTS。從三者反應(yīng)過(guò)程中的紫外吸收譜圖可以觀察到，催化氧化TMB的紫外吸收譜圖在652 nm處有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果吻合[22]；OPD在445 nm處有個(gè)較弱的吸收峰；ABTS在426 nm處有個(gè)肩峰，在737 nm處有個(gè)低寬峰。催化氧化TMB的特征吸收峰相對(duì)其它2個(gè)催化底物易于識(shí)別，故以TMB為探針研究N-RGO催化氧化過(guò)程的機(jī)理，并進(jìn)行定性和定量的分析。

如圖2b所示，當(dāng)N-RGO、TMB分別存在或僅有N-RGO和TMB同時(shí)存在時(shí)，沒(méi)有顯示反應(yīng)。只有當(dāng)TMB、N-RGO和緩沖溶液同時(shí)存在時(shí)才會(huì)發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生紫外吸收。緩沖溶液提供的H+會(huì)參與到催化氧化反應(yīng)中，這在后面對(duì)催化氧化機(jī)理推斷中也有了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2.2.2機(jī)理研究

圖2 (a)催化不同種底物的UV-Vis譜圖:(b)N-RGO、TMB、N-RGO+TMB與TMB+N-RGO+HAc-NaAc緩沖液的UV-Vis譜圖Fig.2 (a)UV-Vis spectra of different substrates;(b)UV-Vis spectra of N-RGO,TMB,and TMB+N-RGO+HAc-NaAc buffer solution

N-RGO發(fā)生該催化氧化反應(yīng)的過(guò)程中，很可能生成H2O2(O2(g)+2H+(aq)+2e- H2O2(aq))，并作為反應(yīng)物參與反應(yīng)。例如，GO可以在H2O2存在的條件下催化TMB產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)物ox-TMB[23]，而氧氣也可作為氧化劑直接氧化TMB，由于H2O2和氧氣都可作為氧化劑參與反應(yīng)，TMB的氧化機(jī)理可能是以下2種(圖3)：

圖3 機(jī)理推斷:(a)氧氣參與的4電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)和(b)H2O2參與的2電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)Fig.3 Proposed mechanisms:(a)4-electron transfer reaction involving oxygen and(b)2-electron transfer reaction involving H2O2

圖4 (a)N-RGO催化氧化TMB反應(yīng)中有無(wú)加入過(guò)氧化氫酶的UV-Vis譜圖;(b)N-RGO催化氧化TMB反應(yīng)中在通入30 min N2與不通N2時(shí)的UV-Vis譜圖Fig.4 (a)UV-Vis spectra of TMB catalyzed and oxidized by N-RGO system with or without catalase;(b)UV-Vis spectra of TMB catalyzed and oxidized by N-RGO system with or without degassing of N2 for 30 min

為了研究氧化的機(jī)理，首先進(jìn)行了加入過(guò)氧化氫酶的對(duì)照試驗(yàn)，從圖4a可以看出，在加入過(guò)氧化氫酶后，紫外吸收曲線與未加酶的N-RGO趨于一致，N-RGO催化氧化過(guò)程不會(huì)受到過(guò)氧化氫酶的影響。這也說(shuō)明反應(yīng)過(guò)程并沒(méi)有H2O2參與，N-RGO催化過(guò)程并不會(huì)促進(jìn)H2O2生成，反應(yīng)過(guò)程為氧氣被還原發(fā)生4電子轉(zhuǎn)移：O2+4H++4e+ 2H2O。因而氧氣是催化氧化TMB過(guò)程中的必要反應(yīng)物，其可能來(lái)源于水中的溶解氧或N-RGO表面的吸附氧。為了進(jìn)一步研究氧的來(lái)源，通30 min氮?dú)庖耘懦彌_液(pH值為3.5)中的氧氣，再加入N-RGO進(jìn)行前面的步驟，可排除水中的溶解氧的干擾。如圖4b所示，2個(gè)反應(yīng)溶液的紫外吸收曲線基本一致，說(shuō)明水中的溶解氧對(duì)催化反應(yīng)沒(méi)有影響。因此，發(fā)生催化氧化的氧分子來(lái)源于N-RGO的吸附氧。N-RGO具有高的催化活性，是氮摻雜和刻蝕孔洞產(chǎn)生的缺陷共同作用的結(jié)果。與氮原子相鄰的碳原子傾向于產(chǎn)生高正電荷和自旋，有利于氧分子的吸附[33-34]。同時(shí)，蝕刻的孔洞將平面結(jié)構(gòu)破壞為非平面結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致多孔網(wǎng)狀物皺褶明顯，在邊緣的孔洞誘導(dǎo)了結(jié)構(gòu)缺陷，具有低配位數(shù)碳的缺陷孔洞可能充當(dāng)了吸附和反應(yīng)的位點(diǎn)，促進(jìn)了催化反應(yīng)中的傳質(zhì)過(guò)程[35]。

以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本明確了N-RGO催化氧化TMB的機(jī)理(圖5)：該反應(yīng)發(fā)生在具有豐富納米孔洞的N-RGO褶皺片層上，多孔結(jié)構(gòu)和有效的氮摻雜為催化氧化反應(yīng)提供了豐富的活性位點(diǎn)，使TMB在NRGO的作用下發(fā)生氧氣參與的4電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。

圖5 N-RGO催化TMB氧化的機(jī)理模型圖Fig.5 Mechanism model of TMB oxidation catalyzed by N-RGO

2.2.3催化氧化的影響因素

常見(jiàn)生物酶的活性一般都會(huì)受到溫度、pH值、離子強(qiáng)度和光照條件的影響，為了進(jìn)一步研究NRGO的類酶性質(zhì)，我們進(jìn)行了系列實(shí)驗(yàn)。以5 mg·mL-1GO合成的N-RGO為催化劑，TMB為底物，分別改變其中1個(gè)因素，測(cè)定其催化活性，并作出相對(duì)活性曲線。其中溫度的變化范圍為25～85℃；pH值依靠HAc-NaAc緩沖溶液來(lái)調(diào)控，變化范圍為2.5～7；離子強(qiáng)度依靠加入NaCl來(lái)調(diào)控，NaCl濃度變化范圍為0～100 mmol·L-1；分別在黑暗、可見(jiàn)光和紫外照射下實(shí)驗(yàn)。

由圖6可知，N-RGO與HPR相似，對(duì)溫度、pH值和NaCl濃度均有依賴。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，催化活性隨著pH值的增大先增大后降低，可知最佳的pH值大約為3.5，N-RGO在酸性、弱酸性條件下均有催化活性。最佳溫度為55℃，同樣在溫度變化比較劇烈的時(shí)候，雖然催化活性會(huì)降低，但是并沒(méi)有失活。在NaCl濃度為40 mmol·L-1時(shí)氧化性能最好，如果增加NaCl濃度，會(huì)抑制N-RGO的類酶活性，但是在試驗(yàn)所測(cè)范圍內(nèi)其相對(duì)活性還是在80%以上。N-RGO在3～4.5的pH值范圍內(nèi)，溫度為25～85℃時(shí)都有較高的活性，相比HPR(pH值：4.5～5.5，溫度：10～40℃)有更寬的活性范圍[36]。

為了研究N-RGO類氧化物酶對(duì)光的敏感性，改變光照條件，分別在黑暗中、可見(jiàn)光和紫外光照射條件下，其催化活性沒(méi)有顯著變化(圖6d)，可以確定光照對(duì)其活性影響微乎其微，說(shuō)明N-RGO催化氧化不依賴外加的光照條件。紫外線照射下會(huì)引起HPR的嚴(yán)重變性，并伴有化學(xué)鍵破壞或殘基之間的交聯(lián)，降低催化活性[37]?？梢?jiàn)，和天然酶相比較，NRGO由于不會(huì)隨光照發(fā)生活性改變，有明顯的優(yōu)勢(shì)，無(wú)需特殊光源的刺激進(jìn)行反應(yīng)及檢測(cè)。

由于溫度和pH值對(duì)物質(zhì)溶解度有較大影響，為研究測(cè)試條件是否會(huì)影響生成物的吸光度，控制反應(yīng)在25℃、pH值為3.5的條件下發(fā)生，僅改變測(cè)量時(shí)的pH值和溫度，可發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)測(cè)量結(jié)果無(wú)影響，而將pH值從3.5增加至6時(shí)吸光度會(huì)降低15%(圖7)。當(dāng)pH值為6時(shí)，可能是生成的二胺類物質(zhì)溶解性變差，導(dǎo)致吸光度降低[38-39]。這也說(shuō)明了圖6b中相對(duì)活性減弱的現(xiàn)象可能是由于pH值過(guò)大導(dǎo)致生成物溶解度降低而引起的，在高pH值下的NRGO依舊具有較高的活性。

基于以上的結(jié)果可知，雖然N-RGO可能在非最佳條件下催化活性降低，但是它不會(huì)像生物酶一樣完全失活。在35℃時(shí)，N-RGO的類酶活性在90%以上，與生物酶非常相似，可適用于生物體中的檢測(cè)。

圖6 (a)溫度、(b)pH值、(c)NaCl濃度和(d)光照對(duì)N-RGO活性的影響Fig.6 Effect of(a)temperature,(b)pH value,(c)concentration of NaCl and(d)light on catalytic activity of N-RGO

圖7 測(cè)量時(shí)pH值和溫度改變對(duì)吸光度的影響Fig.7 Effect of pH value and temperature change on absorbance during measurement

2.2.4穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)

為了研究N-RGO催化氧化的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)，控制實(shí)驗(yàn)條件為N-RGO催化氧化的最佳條件(溫度為55℃、pH值為3.5、NaCl濃度為40 mmol·L-1)，將制得的5種不同的N-RGO樣品，分別在400、600、800、1 000和1 200 μmol·L-1的TMB濃度下測(cè)量UV-Vis譜圖。

通過(guò)朗伯-比爾定律(A=εbc，其中A為吸光度；ε為摩爾吸光度，L·mol-1·cm-1；b為吸收層厚度，cm；c為吸光物質(zhì)的濃度，mol·L-1)將吸光度與生成物的濃度建立聯(lián)系，生成物的濃度除以反應(yīng)時(shí)間即可得到對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速率。已知：ox-TMB的ε=39 000 L·mol-1·cm-1[22]，b=1 cm，t=240 s。由此可知，反應(yīng)速率v=c/t=A/(εbt)。以圖8a中400 μmol·L-1底物(652 nm處的吸光度為0.079 3)為例，其對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速率v=8.47×10-3μmol·L-1。由圖8可知，與生物酶催化過(guò)程相似，初始TMB的濃度越高，對(duì)應(yīng)的N-RGO催化活性越高。隨著底物濃度的升高，反應(yīng)速率的升高速率逐漸減慢。當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐虼髸r(shí)，有最大的反應(yīng)速率，這是由N-RGO的缺陷度和石墨氮的含量所決定的。因此可將N-RGO催化氧化TMB的反應(yīng)看作酶促反應(yīng)，將這些數(shù)據(jù)擬合到Michaelis-Menten模型中其中cs代表TMB的濃度，mol·L-1；v代表反應(yīng)速率，mol·L-1·s-1；vmax代表酶被底物飽和時(shí)的最大反應(yīng)速度，mol·L-1·s-1；Km代表米氏常數(shù)，mol·L-1)，作雙倒數(shù)圖，縱坐標(biāo)的截距為1/vmax，橫坐標(biāo)的截距為-1/Km，即可得出Km和vmax值。隨著GO濃度增大，vmax首先增加，而Km值逐漸減小，這可能是因?yàn)槠鹗糋O濃度高，獲得的N-RGO有相對(duì)較少的含氮量。當(dāng)含氮量增加時(shí)，對(duì)催化性能有兩方面的影響：一方面N-RGO的缺陷度增大，催化活性位點(diǎn)增加，對(duì)氧氣的吸附增強(qiáng)，會(huì)增大催化氧化速率；另一方面N-RGO的電子傳輸能力會(huì)下降，導(dǎo)致催化氧化速率減慢。當(dāng)GO濃度為5 mg·mL-1時(shí)，N-RGO催化的vmax最大，這可能是因?yàn)槭勘绕渌麡悠犯?。石墨氮有利于大分子的吸附[25]，而且N-RGO中sp2雜化的碳原子可通過(guò)摻雜的石墨氮進(jìn)一步活化[32]。

以TMB為底物的N-RGO的Km值比HPR、CeO2納米顆粒和Pt納米團(tuán)簇低約2～3倍[22,40-41]，Km代表酶對(duì)底物的親和力，故N-RGO對(duì)TMB表現(xiàn)出更強(qiáng)的親和力。相比于文獻(xiàn)中GO和Fe3O4磁性納米顆粒來(lái)說(shuō)，雖然得到的Km值相對(duì)較大，但vmax值約是其2倍大[23,42]。從以上結(jié)果中可知N-RGO有較高的催化活性，說(shuō)明N-RGO具有一定的潛能，可發(fā)展為簡(jiǎn)易、廉價(jià)、具有高靈敏度和選擇性的生物檢測(cè)劑。

表1 不同催化劑對(duì)底物TMB的Km和vmaxTable 1 Kmand vmaxof different catalysts to substrate TMB

圖8 不同N-RGO樣品分別在不同的TMB濃度下發(fā)生氧化反應(yīng)的UV-Vis譜圖(a、c、e、g、i)和相應(yīng)的米氏方程(b、d、f、h、j)Fig.8 UV-Vis spectra(a,c,e,g,i)of oxidation reaction of different N-RGO samples at different TMB concentrations and corresponding Michaelis-Menten equations(b,d,f,h,j)

3 結(jié) 論

通過(guò)一步溫和水熱法制備了具有豐富納米孔的氮摻雜石墨烯，其N/C的原子比高達(dá)10%以上且含量穩(wěn)定。N-RGO具有顯著的類過(guò)氧化物酶性質(zhì)，對(duì)OPD、ABTS和TMB等有機(jī)物均有顯著的催化顯色活性，這得益于其獨(dú)特的缺陷孔洞和氮原子摻雜形成豐富的活性位點(diǎn)。N-RGO在溫度為35～55℃范圍內(nèi)表現(xiàn)良好，即在人的正常體溫范圍內(nèi)有較高的催化活性，這使其在人體檢測(cè)方面有很大的應(yīng)用前景。這其中5 mg·mL-1的N-RGO樣品催化活性較高，反應(yīng)速率與HPR接近，是已報(bào)道的人工類酶催化劑Fe3O4納米顆粒的2倍多，而且其對(duì)底物的親和力已超過(guò)了HPR。相比傳統(tǒng)的貴金屬類酶催化劑，它在環(huán)保與經(jīng)濟(jì)效應(yīng)方面表現(xiàn)得極為出色?；贜-RGO優(yōu)異的催化氧化性能和較寬的作用區(qū)間，它有望被廣泛應(yīng)用于可穿戴醫(yī)療設(shè)備進(jìn)行血糖檢測(cè)，以及便攜式環(huán)境監(jiān)測(cè)儀進(jìn)行污水的檢測(cè)。