體細胞重編程為運動神經元細胞的方法研究進展

張亞男，翁曉濱，王躍嗣,

1 濱州醫(yī)學院藥學院，山東煙臺264003；2 濱州醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心

運動神經元(MNs)是神經元的一種，它能將軸突投射到肌肉，控制機體的隨意動作。運動神經元疾病(MNDs)是一類以脊髓和運動皮質的MNs選擇性缺失為特征的異質性神經系統(tǒng)疾病，包括脊髓性肌萎縮癥(SMA)和肌萎縮側索硬化癥(ALS)[1],目前在世界范圍內尚無有效的治療方法。細胞替代療法是指將干細胞移植到病灶來治療各種疾病。將MNs細胞移植于腦或脊髓的病變部位，修復損傷細胞，重塑神經組織環(huán)境，有望從根本上治愈MNDs，但MNs細胞獲取困難。MNs細胞可由多種體細胞重編程而來。體細胞重編程為運動神經元細胞的方法是近年的研究熱點，目前有兩種，一種是體細胞重編程為誘導多能干細胞(iPSCs)或神經干細胞(NSCs)再分化為MNs細胞，一種是體細胞直接重編程為MNs細胞?，F(xiàn)將相關研究進展情況綜述如下。

1 體細胞重編程為誘導多能干細胞(iPSCs)再分化為MNs細胞

2006年，Takahashi等[2]通過病毒載體將四種多能性轉錄因子Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc轉入小鼠胚胎或成人成纖維細胞制成胚胎干細胞樣細胞，即iPSCs。iPSCs能夠分化成任何類型的細胞，來源于患者，無胚胎干細胞(ESCs)所面臨的破壞胚胎的倫理問題。目前，許多研究者開始探討利用多種體細胞重編程為iPSCs，再分化得到MNs細胞，進行細胞移植藥物研究。

1.1 成纖維細胞重編程為iPSCs再分化為MNs細胞 成纖維細胞取材較方便，增殖能力強，生長迅速，體外培養(yǎng)后細胞特性極為穩(wěn)定，因此，成纖維細胞作為常規(guī)體細胞來進行重編程基礎研究和臨床試驗，已成為國內外研究熱點。Park等[3]通過感染含有4個多功能基因(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)的逆轉錄病毒，重編程小鼠尾尖成纖維細胞為iPSCs，再用小分子維甲酸(RA)和音猬因子(Shh)分化形成MNs細胞，證實野生型和ALS小鼠來源的iPSCs在分化成MNs細胞上沒有明顯差異，ALS相關iPSCs分化的MNs細胞可再現(xiàn)ALS的病理特征；與野生型MNs細胞相比，ALS模型MNs細胞表現(xiàn)為超氧化物歧化酶SOD1聚集，細胞存活率降低，神經元突起長度縮短，這一研究對于闡明ALS病理機制具有重要意義。Liu等[4]利用含有多能性轉錄因子Oct4、Sox2、Klf-4和c-Myc的反轉錄病毒轉染SMA患者來源的成纖維細胞和對照組成纖維細胞產生iPSCs，再將SMA來源的iPSCs分化為MNs細胞，發(fā)現(xiàn)SMA來源的MNs細胞表現(xiàn)出高興奮性、膜輸入電阻增加、閾值超極化、動作電位振幅更大，研究結果顯示，SMA患者來源的MNs細胞減少會導致MNs細胞的高度興奮性，影響神經之間信號傳遞，從而導致SMA早期的嚴重癥狀。Dimos等[5]從患有ALS家族性疾病的82歲女性患者身上采集皮膚成纖維細胞，轉染包含Klf4、Sox2、Oct4、c-Myc的逆轉錄病毒重編程為iPSCs，這些iPSCs具有胚胎干細胞的特性，并且利用小分子RA和Shh可定向分化為MNs細胞。由ALS患者來源的iPSCs攜帶與該患者病理相關的精確信息，分化的MNs細胞顯示的與其它細胞類型之間的關系以及對外界環(huán)境的敏感性，這些信息被認為在ALS的發(fā)病機制中起著重要作用。

1.2 外周血細胞重編程為iPSCs再分化為MNs細胞 靜脈來源的血細胞，因其易收集且無需在實驗前進行耗時的培養(yǎng)，而優(yōu)于成纖維細胞。Bossolasco等[6]從攜帶TARDBP p.A382T突變的ALS患者和健康供體的血液中提取外周血單核細胞，轉染包含Klf4、Oct4、Sox2和c-Myc的病毒，在小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上重編程為iPSCs，再加多個小分子進行分化后得到MNs細胞。該實驗首次證明，利用外周血細胞進行重編程和分化，可以成功地獲得人類TARDBP突變的MNs細胞，攜帶TARDBP突變的ALS患者來源的iPSCs具有與對照組類似的MNs細胞分化能力，而血細胞為MNs細胞的獲得提供了一個新的來源。血細胞來源的iPSCs為評估特定細胞類型對疾病發(fā)病機制的研究提供了一個新的模型系統(tǒng)。

1.3 尿液細胞重編程為iPSCs再分化為MNs細胞 尿液細胞是一種取材方便、經濟、無創(chuàng)的細胞，可在體外重編程成尿源性iPSCs。尿源性iPSCs因其安全、無創(chuàng)分離和易于重編程而成為一種有前途的干細胞來源。Yi等[7]利用多個小分子CHIR99021、SB431542、PUR、RA、BDNF、GDNF、IGF首次將尿源性iPSCs分化為成熟的MNs細胞，并比較了尿源性iPSCs和臍血源性iPSCs分化為MNs的能力。MNs特異性標記物陽性標記率的比較表明，兩者的分化潛能無明顯差異，這表明尿液細胞同樣具有重編程為iPSCs以及再分化為MNs細胞的能力。在與肌肉細胞共培養(yǎng)時，MNs可投射出長軸突并形成神經肌肉連接(NMJs)。免疫熒光和PCR實驗證實，尿源性iPSCs分化的MNs細胞可表達MNs細胞特異性標志物。迄今為止，包括皮膚成纖維細胞和血細胞在內的不同來源的多種體細胞iPSCs已被用于重編程為iPSCs以及MNs細胞的再分化過程中[8]。與皮膚成纖維細胞和血細胞相比，尿源性iPSCs以無創(chuàng)分離的方式容易獲得，因此，為MNDs的疾病建模、藥物篩選和細胞治療提供了一個新的平臺。

2 體細胞重編程為NSCs再分化為MNs細胞

NSCs是一群存在于神經系統(tǒng)中，能夠自我更新、增殖，并具有多種分化潛能的細胞，在適當條件下可分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。Lee[9]等研究顯示，NSCs分化來源的MNs，對ALS模型SOD1G93A小鼠進行鞘內移植，延遲了小鼠的發(fā)病時間，延長了壽命。該研究結果表明，鞘內移植NSCs來源的運動神經元，可替代丟失的MNs細胞，無明顯不良反應，此種治療方式對ALS患者是有益的，這些NSCs來源的MNs細胞可作為ALS患者細胞治療的來源。

星形膠質細胞是哺乳動物腦內分布最廣泛的一類細胞，通過血管周足和突起連接毛細血管與神經元，對神經元可以起到運輸營養(yǎng)物質和排除代謝產物的作用。星形膠質細胞可以通過患者大腦皮層的活檢輕易獲得，這使得自體移植成為可能。有研究者[10]在體外培養(yǎng)出生后15～20 d的大鼠脊髓星形膠質細胞，在表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)存在的條件下，誘導出NSCs克隆球，再用胞外誘導信號分子RA和Shh，誘導干細胞向MNs細胞分化，證實成熟星形膠質細胞可以重編程為NSCs，并首次證明它們可以分化為97.7%的MNs祖細胞和至少30%的MNs細胞。星形膠質細胞為脊髓損傷中丟失的MNs細胞替代療法提供了一個有價值的細胞來源。

3 體細胞直接重編程為MNs細胞

直接重編程，是指一種成熟細胞經重編程能夠直接變成另一種類型的成熟細胞，而不需要經過iPSCs或NSCs中間階段。直接重編程的細胞可能比經過iPSCs中間階段產生的細胞更加安全，且耗時更短，更加有利于臨床應用。

3.1 成纖維細胞直接重編程為MNs細胞

3.1.1 利用轉錄因子將成纖維細胞直接重編程為MNs細胞 轉錄因子是一群能與基因5′端上游特定序列專一性結合，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質分子，與RNA聚合酶Ⅱ形成轉錄起始復合體，共同參與轉錄起始的過程。利用轉錄因子進行細胞重編程主要是通過控制細胞類型特異性基因的表達，從而確定細胞的類型。Son等[11]利用逆轉錄病毒作載體，包含七個轉錄因子Ascl1、Brn2、Myt1l、Lhx3、Hb9、Isl1和Ngn2，直接將小鼠和人類成纖維細胞重編程為MNs細胞，不經過iPSCs狀態(tài)。上述研究結果表明，過表達篩選的的轉錄因子足以將小鼠和人類成纖維細胞直接誘導成MNs細胞，且成纖維細胞直接重編程形成的MNs表現(xiàn)出的形態(tài)學、基因表達特征、電生理學、突觸功能、體內遷移能力和對退化的敏感性，與胚胎來源的MNs細胞相似。Zhang等[12]將SMA患者來源的成纖維細胞和健康者來源成纖維細胞同時混合感染8種慢病毒載體，均能有效轉化為MNs細胞，SMA組和對照組的轉換效率分別約為5.8%和5.5%,這些神經元在培養(yǎng)過程中活力旺盛，具有神經元遷移、突觸生長和神經元連接形成的能力。

3.1.2 利用小分子將成纖維細胞直接重編程為MNs細胞 小分子誘導細胞重編程的方法，是利用小分子與細胞內源因子相互作用的原理，可避開基因操作，使得體細胞可以獲得轉化為其它類型的細胞能力的特性。相比插入外源基因，小分子的優(yōu)勢在于操作簡單、處理時間易掌握、降低實驗成本，且可以人為調整濃度與組合。Qin等[13]利用五個小分子Kenpaullone、Forskolin、Y-27632、Purmorphamine、Retinoic acid直接將人類和小鼠成纖維細胞重編程為適合細胞替代治療和神經退行性疾病建模的MNs細胞。與重編程為iPSCs再分化為MNs細胞費時、復雜的過程相比，誘導MNs細胞的速度快(3～5天)、簡單、高效(>90%)。AG1-X2樹脂微球用含有小分子Kenpaullone、Forskolin、Y-27632、Purmorphamine、Retinoic acid的培養(yǎng)液浸泡過后，和對照組分別植入小鼠背部皮膚，兩天后對背部皮膚樣本染色分析發(fā)現(xiàn)，小鼠背部皮膚細胞開始表達運動神經元標記物，表明在體內也可以直接進行MNs的直接重編程。

3.1.3 利用miRNA和轉錄因子將成纖維細胞直接重編程為MNs細胞 miRNA最早是1993年在線蟲中被發(fā)現(xiàn)[14]，它是一種非編碼RNA(長度20～25 bp)。miRNA的轉錄后調控作用為基因表達調控提供了一種新的策略，并影響一系列細胞事件。既往研究[15]表明，miRNA參與細胞增殖、分化、發(fā)育及凋亡等復雜的生物進程，對細胞具有重要的調控和生理功能。miRNA表達在細胞質中，不整合進基因組，利用miRNA進行細胞重編程避免了外源基因的插入和多種小分子產生的毒性，具有非常高的安全性。Abernathy等[16]利用攜帶有miRNA-9/9*和miRNA124的慢病毒，轉染22～68歲的成人成纖維細胞，并添加Dox、Valproic acid、Dibutyryl cAMP、Retinoic Acid、Dox進行重編程，直接將成纖維細胞重編程為MNs。研究表明，miRNA可介導成纖維細胞直接重編程為MNs，單獨的ISL1和LHX3不足以重編程為MNs細胞，揭示了miRNA與轉錄因子之間的模塊存在協(xié)同作用，從而實現(xiàn)特定譜系的神經元重編程。這項研究成果為從患者身上產生不同亞型的人類神經元提供了一個選擇。

3.1.4 利用轉錄因子和小分子將成纖維細胞直接重編程為MNs細胞 Liu等[17]利用攜帶有NEUROG2-IRES-GFP-T2A-SOX11和ISL1-T2A-LHX3(NSIL)的慢病毒，轉染健康的成年人和ALS患者來源的皮膚成纖維細胞，并用小分子Forskolin、Dorsomorphin和FGF2進行重編程，結果表明，成人成纖維細胞可以被有效地直接重編程為高純度的MNs，且這些神經元表現(xiàn)出成熟的電生理學特性，形成神經肌肉連接，并控制肌肉活動，而從ALS患者來源的成纖維細胞重編程的MNs細胞表現(xiàn)出相應的生理缺陷，可以通過加入一種小分子化合物Ken來糾正。Tang等[18]使用包含NGN2-IRES-GFP-T2A-mSOX11和ISL1-T2A-LHX3的兩種慢病毒做載體，并用小分子Forskolin、Dorsomorphin、bFGF進行誘導，可以直接將成纖維細胞重編程為MNs。由于衰老是神經退行性病變發(fā)生的主要危險因素，在發(fā)病年齡使用MNs細胞來概括年齡相關特征是很重要的。Tang等[18]比較了iPSCs的重編程和原代成纖維細胞的直接重編程兩種方法獲得的MNs細胞，雖然iPSCs的產生必須經過表觀遺傳過程，進入多能態(tài)，但直接轉化的MNs具有保留成纖維細胞供體衰老相關特征的優(yōu)勢。iPSCs可以重置來自于其供體的衰老狀態(tài)，如端粒磨損和細胞衰老。直接重新編程的MNs細胞，保留供體成纖維細胞的老化特征,包括廣泛的DNA損傷、異染色質和核組織的損失，并增加SA-β-Gal活動，這表明成纖維細胞來源的MNs細胞可能更適合研究遲發(fā)型MNDs的發(fā)病機制。

3.2 星形膠質細胞直接重編程為MNs細胞 秦華[19]從ALS模型小鼠脊髓中提取出星形膠質細胞，用小分子的組合Kenpaullone、Y-27632、Forskolin、Purmorphamine、Retinoic acid(簡寫為KFYPR)進行誘導，可在1～2天內快速誘導將扁平的星形膠質細胞變成單極、雙極或多極的神經元形態(tài)，細胞體積變小，突起增多，胞體折光性增強。通過免疫熒光染色顯示沒有神經干細胞標志物表達，證實沒有經歷干細胞中間狀態(tài)。誘導的MNs可作為MNDs模型，用于揭示MNDs的病因、發(fā)展機制，也可用于開發(fā)、篩選和評估治療的藥物。星形膠質細胞存在于脊髓組織中，如果在脊髓中輸入小分子，直接將星形膠質細胞重編程為MNs，則有望實現(xiàn)MNs的體內再生。

綜上所述，我們介紹了不同體細胞重編程為MNs細胞的兩種方法：通過重編程獲得iPSCs或NSCs再分化為MNs細胞的過程繁瑣，耗時長、效率低，有面臨基因突變的風險；而直接重編程，方法簡便、且耗時更短，更有利于臨床。但目前，仍存在一些問題需要探討，一是體細胞重編程大多采用病毒轉染的方法，而病毒載體的使用，存在病毒基因整合到初始細胞的基因組并導致細胞基因發(fā)生變異的可能性，因此，尋找合適的轉染方法對于重編程的MNs能否應用于臨床起著關鍵作用。二是利用小分子化合物替代重編程因子中的部分轉錄因子來提高重編程效率，也能減少對使用病毒載體的依賴，但是小分子在重編程過程中的作用機制尚不清楚。隨著重編程技術的不斷優(yōu)化和發(fā)展，相信在不久的將來,人們將在重編程的機制研究和臨床應用領域取得更為重要的突破。