胃癌鼠模型研究

黃秋月， 葉 暉， 史宗明， 張學(xué)智

北京大學(xué)第一醫(yī)院中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合科 北京大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，北京 100034

胃癌作為最常見的消化道惡性腫瘤，是導(dǎo)致全球癌癥死亡的第三大原因[1]。流行病學(xué)顯示，胃癌在中國(guó)、日本、拉丁美洲和東歐的發(fā)病率最高，給我國(guó)人民造成了嚴(yán)重的健康、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。然而胃癌的確切發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。由于疾病早期無明顯癥狀，并且缺乏早期篩查手段，大多數(shù)胃癌患者被確診時(shí)已是疾病晚期，治療手段有限，預(yù)后不良。即使治療成功，胃癌患者也有很高的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和獲得性耐藥發(fā)生率[3]。因此我們迫切需要了解胃癌發(fā)病的分子機(jī)制，以設(shè)計(jì)和開發(fā)提高患者生存率的新靶向療法。

鼠的基因組與人類基因組高度同源，能夠模擬人胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等一系列生物學(xué)特性[4]，且飼養(yǎng)方便、價(jià)格低廉、易進(jìn)行基因修飾，為研究胃癌提供了良好的工具，并為藥物發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證提供了寶貴的平臺(tái)。根據(jù)造模方式主要分為以下三種。

1 長(zhǎng)期誘導(dǎo)造模

1.1 化學(xué)致癌物誘發(fā)胃癌的常用化學(xué)試劑包括甲基亞硝基脲(MNU)和甲基硝基亞硝基胍(MNNG)等，多通過飲用水補(bǔ)充或灌胃法。其中MNU使用最廣泛，Yamachika等[5]研究表明，MNU的致癌率主要取決于試劑的濃度而不是總量：在總攝入量一致的情況下，短期、高濃度是較好的組合。Yamamoto等[6]進(jìn)一步研究，在6種品系的小鼠中使用120 ppm MNU/5周的組合均獲得滿意成瘤率，因此，在大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)方案中均建議使用此濃度。

化學(xué)致癌物造模時(shí)間較長(zhǎng)，但操作簡(jiǎn)便、成瘤率較高，誘導(dǎo)的模型與人胃癌的自然發(fā)生機(jī)制相似，可用于揭示參與胃癌的信號(hào)傳導(dǎo)途徑及驗(yàn)證抗腫瘤藥、中成藥、中藥提取物等對(duì)胃癌的抑制作用。Badr El-Din等[7]通過管飼法給予大鼠200 mg/kg的致癌物MNNG，2次/d，持續(xù)2周，在96周后處死，處死時(shí)80%(8/10)大鼠出現(xiàn)了胃異型增生和腺癌；并且驗(yàn)證了米糠提取物MGN-3/Biobran對(duì)此種胃腺癌具有化學(xué)預(yù)防活性。高華娟等[8]利用MNNG造模，發(fā)現(xiàn)加味香砂六君子湯可通過抑制Wnt通路降低胃癌大鼠中樁蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。Mansingh等[9]利用MNU誘發(fā)Wistar大鼠發(fā)生胃癌，并發(fā)現(xiàn)生姜水提取物可以減輕與胃癌有關(guān)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。Zhuang等[10]利用MNU誘發(fā)糖尿病小鼠發(fā)生胃異型增生，并發(fā)現(xiàn)六味地黃丸不僅可以降低空腹胰島素水平，還可以抑制胃異型增生的發(fā)生。

1.2 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)雖然胃癌的確切病因尚不明確，但H.pylori感染是誘發(fā)胃癌的一個(gè)重要因素，尤其與腸型胃癌密切相關(guān)。世界衛(wèi)生組織將其列為Ⅰ類致癌因子，根除H.pylori可預(yù)防胃癌的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。早在1998年，Honda等[13]就在蒙古沙鼠胃內(nèi)接種H.pylori，成功建立了胃癌模型，用動(dòng)物模型驗(yàn)證了H.pylori與胃癌的相關(guān)性?，F(xiàn)已開發(fā)出許多適應(yīng)小鼠的H.pylori，包括特征明確的悉尼菌株SS1。但單純使用H.pylori誘導(dǎo)胃癌，不僅實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，而且成瘤率低，目前大多聯(lián)合化學(xué)致癌物或在基因工程造模中使用。Han等[14]研究表明，同時(shí)接受致癌物MNU 240 μg/L和H.pylori灌胃的小鼠，第50周時(shí)胃腺癌的發(fā)生率為80%；但單獨(dú)使用H.pylori感染的小鼠，直到80周也僅引起慢性萎縮性胃炎，而無任何癌變跡象，MNU和H.pylori感染的組合導(dǎo)致胃腺瘤和腺癌的發(fā)生率明顯升高。

此模型便于觀察H.pylori對(duì)胃黏膜損傷直至癌變的階段變化：即首先出現(xiàn)萎縮性胃炎，然后逐漸化生為腸黏膜上皮，繼而出現(xiàn)異型增生，腫瘤細(xì)胞累及上皮全層形成原位癌，甚至突破基底膜向下浸潤(rùn)，最后廣泛轉(zhuǎn)移[15]。利用此模型可以觀察藥物干預(yù)胃癌的作用，Lee等[16]用MNU(200 mg/L)和H.pylori聯(lián)合造模，發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白的消融可抑制胃癌的發(fā)展?？蒲腥藛T還利用此模型觀察到飲食和微生物對(duì)胃癌發(fā)生的影響。Toyoda等[17]在C57BL/6小鼠中證明了感染H.pylori與高鹽飲食的致癌性：對(duì)照組為致癌物造模小鼠，實(shí)驗(yàn)組在致癌物造模的基礎(chǔ)上，對(duì)小鼠進(jìn)行高鹽飲食或H.pylori灌胃或聯(lián)合刺激，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組小鼠會(huì)出現(xiàn)更明顯的胃萎縮和腺癌。共生菌群的組成被認(rèn)為是胃癌的另一個(gè)危險(xiǎn)因素。Lofgren等[18]研究發(fā)現(xiàn)，無菌條件下飼養(yǎng)的H.pylori感染的胰島素-胃泌素(INS-GAS)小鼠(胃癌轉(zhuǎn)基因小鼠，見后續(xù))其擬桿菌數(shù)量減少，厚壁菌增多；而未感染H.pylori的小鼠缺乏共生菌群，從而減輕了胃炎并延緩了上皮內(nèi)瘤變。這表明微生物群具有促腫瘤作用而不是抑制腫瘤功能。劉庭玉等[19]發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染導(dǎo)致小鼠胃組織中丁酸及產(chǎn)丁酸鹽的菌群豐度升高，丁酸鹽可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。

2 快速種植造模

快速種植造模多使用先天性免疫缺陷的裸鼠，因此對(duì)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的影響不可避免，并且無法評(píng)估使用免疫系統(tǒng)修飾的靶向療法。但造模周期短，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率，節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本，適合短期批量實(shí)驗(yàn)。目前正在開發(fā)適合具有免疫力小鼠細(xì)胞系，Yamamoto等利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立了可種植于C57BL/6小鼠的胃癌細(xì)胞系，畢研貞等基于新型3D微載體(microcarrier 6)復(fù)合人胃癌MKN45細(xì)胞也建立了可種植于C57BL/6小鼠的胃癌細(xì)胞系，這種具有免疫能力的小鼠胃癌模型將可用于觀察免疫療法，并且許多轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠是C57BL/6背景，因此有望分析很多基因?qū)ξ赴┑淖饔肹20-21]。

2.1 異位種植異位種植是將胃癌細(xì)胞或瘤塊種植在胃以外的部位，常于腋下，使腫瘤位置表淺從而易于觀察，且操作簡(jiǎn)便。賀玲等[22]通過將SGC7901(人胃低分化腺癌細(xì)胞系)注射到裸鼠腋下建立胃癌模型，并利用此模型評(píng)估3種近紅外熒光分子探針(IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST)在胃癌分子成像中的靶向性和熒光效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)三者均有較好的靶向性和信噪比，可用于胃癌熒光分子成像。研究人員還用該模型觀察免疫效應(yīng)和藥物干預(yù)作用。Sun等[23]通過將SGC7901注射到裸鼠腋下建立腫瘤模型，觀察抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，證實(shí)PI3K抑制劑聯(lián)合NF-κB p65抑制劑可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。Cheng等[24]用同樣的方法造模，觀察Survivin抑制劑YM155的療效，發(fā)現(xiàn)YM155抑制移植瘤的生長(zhǎng)而對(duì)正常組織(心、肝、肺、腎)不產(chǎn)生影響，YM155可能是一種有前途的胃癌治療藥物。劉艷菊等[25]將MFC胃癌細(xì)胞接種于BALB/C小鼠腋下造模，發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)多糖可抑制腫瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。Xie等[26]則利用此模型驗(yàn)證甘草的主要成分甘草甜素的抗胃癌作用。但異位種植不能真實(shí)反映胃癌細(xì)胞所處的周圍環(huán)境，有所限制。

2.2 原位種植原位種植即將腫瘤細(xì)胞或組織接種于胃壁，比起異位種植能更真實(shí)地模擬胃癌細(xì)胞在人體內(nèi)的生物學(xué)行為，可用此模型觀察胃癌細(xì)胞在體內(nèi)侵襲、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為，篩選抗腫瘤藥物，評(píng)價(jià)分子靶向藥物的療效等，是目前最常用的造模方式。

2.2.1 細(xì)胞懸液接種：目前常用的細(xì)胞株有SGC-7901、MKN45(人胃低分化腺癌細(xì)胞系)、AZ521(人胃癌細(xì)胞系)等。將胃癌細(xì)胞混勻成單細(xì)胞懸液后直接注射的方式，會(huì)使腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及抗原成分遭到破壞，科學(xué)家們開始采用腫瘤細(xì)胞/膠原復(fù)合物的建模方式。Sprague等[27]通過局部注射胃癌細(xì)胞/膠原復(fù)合物，構(gòu)建工程化的胃癌組織，使細(xì)胞呈現(xiàn)出三維立體式的生長(zhǎng)方式，應(yīng)用此種方式，可使相鄰細(xì)胞之間的條件與環(huán)境發(fā)生改變，使該復(fù)合物與人體胃癌組織相似?；铙w成像技術(shù)有助于可視化觀察腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程，近年來得到廣泛運(yùn)用。Busuttil和胡皓等將熒光素酶和綠色熒光蛋白標(biāo)記于腫瘤細(xì)胞后再進(jìn)行接種，以便在生物發(fā)光儀下觀察腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況[28-29]。Dai等[30]則用紅色熒光蛋白標(biāo)記，并觀察傳統(tǒng)中藥人參的有效成分人參皂苷Rg3的療效。劉長(zhǎng)旭等[31]使用量子點(diǎn)納米熒光探針標(biāo)記，性質(zhì)穩(wěn)定，可清晰看到惡性腫瘤邊界及淋巴組織的轉(zhuǎn)移。

2.2.2 組織塊接種：組織塊接種是將胃癌細(xì)胞懸液接種于皮下，待其成瘤達(dá)到一定體積后，將組織塊移植到動(dòng)物的胃中；或直接接種手術(shù)切除的人胃癌組織塊。Li等[32]將SGC-7901細(xì)胞懸液種植到裸鼠皮下，待皮下瘤塊達(dá)到一定體積時(shí)，將瘤塊取出切碎，用生物膠粘貼種植于胃大彎中，在第6周，原發(fā)性腫瘤開始快速生長(zhǎng)，導(dǎo)致胃壁增厚和胃腔狹窄，并檢測(cè)到肝和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。趙廣銀等[33]首先建立共表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶的人胃癌細(xì)胞系，然后將其接種于高度免疫小鼠腋下，成瘤率100%；繼而取出腫瘤組織切碎，種植于小鼠腹部，建立人胃癌腫瘤皮下傳代動(dòng)物模型；最后取出傳代動(dòng)物的腫瘤組織，切碎后種植于小鼠胃部，建立原位種植模型。

3 基因工程造模

基因工程作為新興的造模方法，或?qū)⑼庠椿驅(qū)爰?xì)胞，或?qū)μ囟ɑ蜻M(jìn)行敲除，導(dǎo)致小鼠發(fā)生胃癌，可以用來檢查與胃癌有關(guān)的各種基因表達(dá)、基因治療等。這些轉(zhuǎn)基因鼠在無外界刺激的情況下就可以自發(fā)生成原發(fā)胃癌，與人類胃癌的自然發(fā)生、發(fā)展極為相似，是目前較為理想的胃癌模型。但基因工程小鼠多為單個(gè)基因的改變，而胃癌的發(fā)生是多基因、多因素相互作用的結(jié)果，且基因工程小鼠往往價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)成本過高，因此也存在缺陷。以下是常用的幾種轉(zhuǎn)基因小鼠。

3.1 INS-GAS小鼠胃泌素是由胃黏膜G細(xì)胞產(chǎn)生的重要激素，負(fù)責(zé)泌酸細(xì)胞分化和胃酸分泌，高胃泌素血癥可能促進(jìn)胃癌發(fā)展。INS-GAS小鼠在胰島素啟動(dòng)子控制下過表達(dá)胃泌素，導(dǎo)致持續(xù)的高胃泌素血癥，自發(fā)發(fā)展為胃萎縮、化生、異型增生，最終約在20個(gè)月大時(shí)發(fā)展為胃癌[34]。H.pylori感染可加速胃黏膜的病變，帶有H.pylori感染的INS-GAS小鼠已被廣泛用作腸型胃癌的模型[35]。Takaishi等[36]使用這種小鼠模型研究了在高胃泌素狀態(tài)下H.pylori感染引起的基因表達(dá)變化，并發(fā)現(xiàn)了一組差異表達(dá)基因。Fox等[35]使用此模型觀察性別與胃癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)男性胃癌的發(fā)病率高于女性，這與人類流行病學(xué)研究相符。Sierra等[37]利用此模型觀察到吉非替尼治療可顯著減少INS-GAS小鼠的異型增生和癌變，有望成為胃癌治療藥物。

3.2 三葉因子1(TFF-1)基因敲除小鼠TFF-1是一種腫瘤抑制基因，通常表達(dá)于人或動(dòng)物的胃黏膜上皮細(xì)胞，當(dāng)患有各種胃腸道疾病或腫瘤時(shí)，就會(huì)有TFF-1的異常表達(dá)：TFF-1表達(dá)在胃癌中經(jīng)常丟失[38]。Kim等[39]運(yùn)用新技術(shù)CRISPR/Cas9破壞TFF-1基因進(jìn)行造模，無插入外源抗生素抗性基因，可以更精確地研究胃癌的遺傳和環(huán)境因素。Soutto等[40]研究表明，TFF-1的缺失通過誘導(dǎo)PP2A(AKT-GSK3β信號(hào)傳導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)劑)導(dǎo)致β-catenin信號(hào)的活化和胃腫瘤的發(fā)生。Omar等[41]在TFF-1基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)組織抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶-1(TIMP-1)的過表達(dá)，并且用TFF-1基因敲除小鼠的胃建立胃類器官，發(fā)現(xiàn)TIMP-1仍過表達(dá)，使用重組蛋白重建TFF-1則導(dǎo)致TIMP1的表達(dá)顯著降低，表明TFF-1可以在胃癌中抑制TIMP-1介導(dǎo)的增殖潛能。

3.3 K-ras轉(zhuǎn)基因小鼠K-ras是RAS基因家族成員之一，編碼K-ras蛋白，與腫瘤的生成、增殖、遷移、擴(kuò)散及血管生成均有關(guān)系。已分別在彌漫型或腸型胃癌中發(fā)現(xiàn)6%～18%的K-ras基因突變[42]?？赏ㄟ^在LSL-K-ras G12D小鼠中插入CK19CreERT基因的方式造模[43]。Matkar等[44]研究發(fā)現(xiàn)，K-ras的全身活化可導(dǎo)致胃細(xì)胞穩(wěn)態(tài)快速變化，增殖變強(qiáng)；胃腺體增生，腺上皮被腸型柱狀上皮所代替，并伴有炎癥因子上調(diào)(COX-2)，MAPK途徑激活等。因此，全身性K-ras激活的小鼠可作為研究胃癌發(fā)生早期分子事件的工具。

3.4 白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)轉(zhuǎn)基因小鼠IL-1β是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的多效性炎性細(xì)胞因子。Tu等[45]使用H/K-ATPase啟動(dòng)子將人IL-1β靶向胃，建立了IL-1β轉(zhuǎn)基因小鼠，小鼠到18個(gè)月大時(shí)，30%自發(fā)發(fā)展為炎癥、萎縮、化生和胃腺癌。研究顯示，IL-1β可誘導(dǎo)胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤向胞外基質(zhì)和淋巴管侵襲[46]。且IL-1β的過度表達(dá)可以激活NF-κB，動(dòng)員和招募骨髓來源的抑制性細(xì)胞(MDSCs)，單個(gè)促炎細(xì)胞因子IL-1β的升高足以誘導(dǎo)胃異型增生/癌，從而確立IL-1β在胃癌發(fā)生中的關(guān)鍵病因[45]。

構(gòu)建理想的胃癌動(dòng)物模型是進(jìn)行胃癌基礎(chǔ)研究的重要前提。近幾十年來，胃癌的鼠模型不斷發(fā)展，從化學(xué)誘導(dǎo)隨機(jī)突變，H.pylori誘導(dǎo)異型增生到快速種植造模，再到利用轉(zhuǎn)基因/基因敲除技術(shù)構(gòu)建工程小鼠，人們也對(duì)致癌物、飲食、細(xì)菌、基因如何影響胃癌形成加深理解?？晒┻x擇的造模方法多種多樣，不同的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的造模方式。胃癌的形成是多步驟、多階段的過程，化學(xué)致癌物和H.pylori造模周期長(zhǎng)，但可較好模擬胃癌的“炎-癌”轉(zhuǎn)化過程，因此可用于構(gòu)建胃癌前病變模型和炎癌轉(zhuǎn)化模型，篩選胃癌早期指標(biāo)，尋求干預(yù)時(shí)機(jī)等。在實(shí)際操作中，諸如遺傳背景、性別、飲食、住房條件、腸道菌群等因素均會(huì)影響模型，需要小心控制。目前的造模方式多為單一因素，而胃癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素相互作用的結(jié)果，如何更好地模擬胃癌自然發(fā)生是具有挑戰(zhàn)性的問題，聯(lián)合多因素造模將是較好的模式和方向，如H.pylori聯(lián)合化學(xué)致癌物或基因工程進(jìn)行造模。隨著基因工程技術(shù)的成熟，實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)，胃癌動(dòng)物模型會(huì)更加成熟，更加貼合人類胃癌實(shí)際情況。