雞Prnp基因原核表達載體的構(gòu)建及其在大腸埃希菌中的表達

李仙春，蘆 艷，毛耀芳，楊海峰，余海山，馬永華，*，萬學瑞，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070； 2.西北師范大學 國有資產(chǎn)管理處，甘肅 蘭州 730070)

朊病毒(prion virus)是一類無免疫性的疏水蛋白質(zhì)，也被稱作蛋白質(zhì)侵染因子，能夠在宿主細胞內(nèi)復制并且感染動物。朊病毒沒有RNA和DNA，不可以自我復制，它的復制方式是：生物體內(nèi)正常的細胞型PrPC蛋白接觸到朊病毒，分子構(gòu)象發(fā)生了改變，從而形成了具有致病性的PrPSC蛋白[1]。在酵母和真菌中，朊病毒是由蛋白質(zhì)組成的非染色體基因，通常是蛋白質(zhì)的改變形式，其催化蛋白質(zhì)的相同變化。因此，酵母朊病毒既可以垂直傳播(作為蛋白質(zhì)組成的基因)，也可以水平傳播(作為感染性蛋白或朊病毒)。淀粉樣蛋白是大多數(shù)酵母和真菌朊病毒的基礎，朊病毒蛋白是淀粉樣蛋白多種構(gòu)象形式的一種[2]。有學者認為，構(gòu)象的轉(zhuǎn)變可能是發(fā)生在局部變性的吞噬小胞內(nèi)，由于較低的pH值誘導蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，促進淀粉樣蛋白的自身組裝[3-5]。一般而言，pH、溫度、離子強度、促溶劑、氧化應激、金屬離子會嚴重影響蛋白的多肽構(gòu)象[6]。朊病毒病首先在羊身上發(fā)現(xiàn)，被稱為“羊瘙癢癥”，后來又相繼發(fā)現(xiàn)了牛海綿狀腦病、傳染性水貂腦軟化病、馬鹿和鹿的慢性消瘦病、貓的海綿狀腦病、克雅病、庫魯病等[7]。朊病毒病傳染動物，如牛的傳染性海綿狀腦病、羊的瘙癢病、麋鹿和鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease，CWD)，它們被認為是通過消化道傳染(bovine spongiform encephalopathy，BSE)或者是通過物種間的水平傳播[8]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，這些疾病的共同特征是人和動物產(chǎn)生意識和運動功能的嚴重衰退直至死亡，其臨床和病理特征表現(xiàn)為腦組織的海綿體化、空泡化、形成星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞[9]。

朊蛋白(prion protein，PrP)是由朊蛋白基因(prion protein gene，Prnp)編碼的，具有高度保守性，不僅在人和動物細胞表面廣泛表達，還在免疫系統(tǒng)中也有很高的表達，包括T、B淋巴細胞，樹突狀細胞，NK細胞等[10]。雞是最早發(fā)現(xiàn)Prnp基因的禽類，最初雞朊蛋白(ChPrPC)是作為乙酰膽堿受體從雞神經(jīng)組織中分離出來的，介導神經(jīng)軸突的信號傳遞[11-12]。PrP通常以PrPC和PrPSC這兩種形式存在，前者以α-螺旋為主，具有可溶性的細胞型正常朊蛋白，對蛋白酶K敏感；后者為異常蛋白，以β-折疊為主，具有致病性并抑制蛋白酶K[13]；甲酸和高溫水浴對PrP的暴露具有很好的修飾作用[14]。PrPC作為細胞表面的糖蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，此外在淋巴細胞、胃上皮細胞、心、腎和肌肉等許多非神經(jīng)組織中也有表達，已有研究表明，朊蛋白不僅存在于哺乳動物體內(nèi)，而且在禽類、兩棲類動物、魚類、酵母中均有表達[15-16]。PrPC也可通過促進細胞增殖和抑制凋亡而在口腔癌中發(fā)揮重要的作用[17]。

朊蛋白是由第20號染色體短臂上的朊蛋白基因編碼，由253個氨基酸組成。N端除了信號肽負責蛋白外分泌，還有5個八肽重復序列(octarepeat)，可結(jié)合一定數(shù)量的銅離子，與朊蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變密切相關(guān)[18]。Prnp基因突變會造成朊蛋白構(gòu)象的改變，進而影響它的穩(wěn)定性，缺失則會導致相關(guān)基因的調(diào)控系統(tǒng)發(fā)生紊亂。PrPC在發(fā)育上是受調(diào)控的，PrPC在未成熟的大腦組織中高度表達可能與它能夠調(diào)控神經(jīng)形成和細胞增殖有關(guān)。最近的一項研究表明，PrPC在調(diào)節(jié)海馬體中的蛋白質(zhì)激酶 A(PKA)突觸可塑性方面起著至關(guān)重要的作用。

PrP盡管在哺乳動物和禽類中有很多研究，但其功能還不是很明確[19]。雖然，不同物種朊蛋白的一級結(jié)構(gòu)有所不同，但還存在保守結(jié)構(gòu)域。對青蛙、烏龜、雞、哺乳動物的朊蛋白進行核磁共振研究分析發(fā)現(xiàn)，它們都存在類似的球形結(jié)構(gòu)域，C-端球形結(jié)構(gòu)域由3個α-螺旋、一個短的β-螺旋和一個短的反向平行β-折疊組成，N-端是無規(guī)則的可變區(qū)；而已知哺乳動物和禽類的朊病毒同源性很低，這種重要的結(jié)構(gòu)域和肽段是保守的，禽類沒有自發(fā)感染的病例[20-21]。多年來，人們對朊蛋白的結(jié)構(gòu)、生理功能和致病機制進行了大量研究，PrPC最重要的功能是參與細胞信號轉(zhuǎn)導，由于PrPC在細胞膜外定位，PrPC能夠?qū)h(huán)境中的分子信號傳遞到細胞內(nèi)；朊蛋白還參與了多種生理過程，如應激保護、細胞分化、神經(jīng)元興奮性、髓鞘維持、晝夜節(jié)律和金屬離子穩(wěn)態(tài)等[21-22]。朊蛋白在腫瘤的形成中具有一定作用，不僅干擾腫瘤形成的通路，還調(diào)控腫瘤細胞的分化與凋亡。朊蛋白的多態(tài)性影響了朊病毒的敏感性和種間屏障[23]。本實驗擬構(gòu)建雞Prnp基因原核表達體系，并進行初步分析，為制備雞朊蛋白單克隆抗體提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

表達載體pET-28a；E.coliTop10、E.coliBL21(DE3)保藏于甘肅農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室。

1.1.2 酶和試劑

GreenTaqMix DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，10×K Buffer，10×M Buffer，DNA凝膠回收試劑盒(EasyPure GeL DNA Extration Mini kit)均購自南京諾唯贊(Vazyme)生物科技有限公司；酶BamH I和Hind Ⅲ、GeLRed核酸染料、Loading Buffer、0.1%BSA(牛血清白蛋白)均購自TaKaRa；卡那青霉素(Kan)、提質(zhì)粒試劑盒、純化試劑盒均購于全式金生物技術(shù)有限公司；DL2000、DL5000 DNA Marker、彩虹180廣譜蛋白Marker(Solarbio)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均購于BBI公司。

1.1.3 主要儀器、設備

恒溫培養(yǎng)振蕩器ZHWY-200D(ZHICHNG)；電熱恒溫培養(yǎng)箱HG202-3K(南京電氣三廠)；TG16-WS臺式高速離心機(Cence湘儀)；梯度基因擴增儀(Eppendorf，德國)；Centrifuge 545小型高速離心機(eppendorf，德國)；PCR擴增儀(美國伯樂BIO-RAD)；WTL-6K迷你離心機(Cence湘儀)；超凈工作臺(海爾生物醫(yī)療)；紫外、可見分光光度計(GE Healthcare，英國)；恒溫金屬浴MK-20(AllSHENG)；凝膠成像分析儀(BIO-RAD)；超低溫冰箱(-70、-80 ℃)；臺式高速冷凍離心機(Cence)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成

根據(jù)GenBank已報道的雞Prnp基因cDNA及基因組序列和原核表達載體pET-28a質(zhì)粒圖譜設計了如下1對引物，由金唯智(天津)生物科技有限公司合成。

上游引物F：5′-CGGGATCCATGGCTAGGCTCCTCACCACC-3′；

下游引物R：5′-CCCAAGCTTGTGCATGGCAAAAAGGGTGG-3′。

上述合成引物中下劃線部分為引入的BamH I和Hind Ⅲ酶切位點。

1.2.2 雞血液中基因組的提取

采取健康三黃雞新鮮血液于抗凝管中，并根據(jù)全血提取基因組試劑盒的操作步驟進行基因組的提取，總DNA由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 雞Prnp目的DNA片段的PCR擴增

采用50 μL體系：上、下游引物各2.0 μL，TaqDNA聚合酶25 μL，模板2.0 μL，加滅菌蒸餾水至50 μL；離心混勻后至PCR擴增儀中，94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s、51.1 ℃ 30 s和72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)，72 ℃再延伸5 min，最后4 ℃儲存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將符合預期大小的目的條帶切下，按DNA凝膠回收試劑盒的說明回收其目的DNA片段。

1.2.4 目的基因與pET-28a質(zhì)粒的酶切

將回收的目的DNA片段和pET-28a質(zhì)粒DNA分別用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ進行雙酶切。第一次酶切體系(50 μL)：目的DNA片段/質(zhì)粒30 μL，10×K Buffer 5.0 μL，BamH Ⅰ 3.0 μL，加滅菌蒸餾水至50 μL；37 ℃水浴3 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。第二次酶切體系(50 μL)：第一次酶切產(chǎn)物3.0 μL，10×M Buffer 5.0 μL，BSA 5.0 μL，Hind Ⅲ 3.0 μL，加滅菌蒸餾水至50 μL；37 ℃水浴3 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，切下目的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒純化回收酶切目的片段和質(zhì)粒片段。

1.2.5 重組表達載體的構(gòu)建與鑒定

將雙酶酶切的雞Prnp目的DNA片段和pET-28a質(zhì)粒DNA片段進行連接，轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細胞中進行克隆，通過BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定并測序，挑選出陽性的重組表達菌。

表達載體片段和目的DNA片段的連接與轉(zhuǎn)化。(1)感受態(tài)細胞的制備。①分別從37 ℃過夜培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)基上挑取E.coliTop10和E.coliBL21(DE3)單菌落，接種于普通的LB液體培養(yǎng)基(3 mL)中；②將過夜培養(yǎng)的細菌擴增至100 mL的LB液體培養(yǎng)基(1∶100)中，37 ℃ 250 r·min-1，振蕩培養(yǎng)3 h至D600為0.45～0.60；③在超凈臺下，將細菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至2個冰冷的50 mL離心管中，冰浴10 min，然后將離心管放4 ℃ 5 000×g離心10 min；④棄上清，將冰冷的100 mmol·L-1CaCl2溶液在離心管中加入5 mL，混勻后再加入20 mL CaCL2溶液重懸(兩管合一)，4 ℃ 5 000×g離心10 min；⑤棄上清，將冰冷的100 mmol·L-1CaCl2溶液用25 mL吹打混勻管底的菌體，冰浴45 min，放4 ℃ 5 000×g離心10 min；⑥棄上清，用5 mL冰冷的含15%甘油的100 mmol·L-1CaCl2溶液混勻菌體，每100 μL一管分裝在冰冷的1.5 mL無菌離心管中，置于-70 ℃冰箱凍存。(2)目的DNA片段與表達載體片段的連接。將雙酶切后純化回收的Prnp目的DNA片段和載體pET-28a質(zhì)粒 DNA片段于16 ℃連接8 h后，4 ℃冰箱保存，次日進行轉(zhuǎn)化。連接體系如表1所示。(3)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)。將3個不同連接體系的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細胞中，接種于不含有卡那青霉素(Kan)的890 μL LB培養(yǎng)液的無菌EP管中，37 ℃ 220 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h，再將EP管5 000×g離心2 min，棄上清液后用槍頭將剩余的細胞沉淀和培養(yǎng)液輕輕混勻，分別打到LB固體培養(yǎng)基(含Kan)上，用L棒涂抹均勻，37 ℃恒溫箱過夜培養(yǎng)。

重組表達質(zhì)粒的鑒定：(1)PCR鑒定。用滅菌接種環(huán)分別從3個平皿中挑選單個菌落，接種到3 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃ 220 r·min-1振蕩過夜，3個試管分別做菌液PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。菌液PCR體系(15 μL)：上、下游引物各0.6 μL，TaqDNA聚合酶7.5 μL，菌液1.8 μL，加滅菌蒸餾水至15 μL。(2)雙酶切鑒定。根據(jù)試劑盒說明從菌液中提取重組質(zhì)粒，經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ進行雙酶切。雙酶切體系(20 μL)：重組質(zhì)粒 15 μL，1×K Buffer 1.0 μL，酶BamH Ⅰ 1.0 μL，酶Hind Ⅲ 1.0 μL，加滅菌蒸餾水至20 μL。

表1 連接體系

重組表達質(zhì)粒的序列測定：將PCR擴增和雙酶切鑒定均為陽性克隆的重組質(zhì)粒，各取15 μL送金唯智(天津)生物科技有限公司進行測序。

1.2.6 重組表達質(zhì)粒的誘導表達

轉(zhuǎn)化：經(jīng)DNAstar軟件比對序列，將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒pET-28a-ChPrnp轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞。

Prnp蛋白的誘導表達：從轉(zhuǎn)化后的重組菌株pET-28a-ChPrnp(BL21)中挑取單菌落接種于4 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r·min-1過夜培養(yǎng)，取1 mL菌液于-20 ℃保存(未誘導的菌液)。加入0.10 mmol·L-1的IPTG誘導劑分別在16、28、37 ℃下誘導12 h，確定最佳誘導溫度為16 ℃；然后分別將IPTG誘導劑的終濃度為0.08、0.09、0.10、0.11、0.12 mmol·L-1的菌液，16 ℃ 220 r·min-1誘導6 h，確定誘導劑的最佳濃度；在已確定最佳誘導濃度時，16 ℃ 220 r·min-1誘導5和7 h，以確定最佳誘導時間。

處理樣品：將未誘導的菌液和誘導的菌液各取50 μL，再加入50 μL的上樣緩沖液混勻煮沸10 min，冷卻至室溫后12 000×g離心5 min，取上清進行電泳。

SDS-PAGE：配置好蛋白膠(制膠配方見表2)，然后分別取處理好的樣品各40 μL加入樣品孔中，先用80 V電壓電泳，觀察樣品電泳到分離膠時，再將電壓調(diào)至120 V，觀察樣品電泳至分離膠邊緣時，關(guān)閉電源。

表2 蛋白膠配方

染色及脫色：電泳完畢，將蛋白膠從玻璃板上小心取下，用R-250考馬斯亮藍染色液在脫色搖床上染色3 h后，棄去染色液加入脫色液進行脫色，期間更換脫色液3～4次，直到出現(xiàn)清晰的條帶，將凝膠放入蒸餾水中終止脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞Prnp基因目的DNA片段的獲得

以健康三黃雞的全血總DNA作為PCR擴增的模板，同Prnp基因的上游引物和下游引物，及其耐高溫的Taq酶進行擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到了約為822 bp的條帶(圖1)，與預期的目的DNA相對分子質(zhì)量大小相符。

M，DL2000 DNA marker；1，PCR擴增產(chǎn)物ChPrnp(822)。M， DL2000 DNA marker；1， PCR amplification product of ChPrnp(822).圖1 目的基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification product of target gene

2.2 目的DNA與pET-28a質(zhì)粒的酶切分析

雙酶切得到目的基因片段(822 bp)和質(zhì)粒DNA片段(5 369 bp)，形成可以互補配對的粘性末端，為重組質(zhì)粒的連接提供了條件(圖2)。

M，DL5000 DNA marker；1，目的DNA酶切產(chǎn)物；2，pET-28a質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。M， DL5000 DNA marker; 1， Digested product of target DNA; 2， Digested product of pET-28a plasmid.圖2 目的DNA與pET-28a質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物Fig.2 Digested product of target DNA and pET-28a plasmid

2.3 重組表達質(zhì)粒的菌液PCR鑒定

菌液PCR擴增獲得目的DNA片段(圖3)，證明在不同連接體系下，目的DNA片段與載體片段都可以成功連接。

M，DL2000 DNA marker；1～3，1、2、3號菌液PCR擴增產(chǎn)物。M， DL2000 DNA marker; 1-3， PCR amplification products of bacteria solution 1， 2 and 3.圖3 重組表達質(zhì)粒的菌液PCR鑒定Fig.3 PCR identification of recombinant plasmid

2.4 重組表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定

雙酶切得到大約5 369 bp和822 bp的兩條片段(圖4)，證明重組表達載體中含有預期大小的目的DNA片段，初步證明構(gòu)建了重組表達載體。

M，DL5000 DNA marker；1～3，1、2、3號重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。M， DL5000 DNA marker; 1-3， Double enzyme digestion products of recombinant plasmids 1， 2 and 3.圖4 重組表達載體雙酶切分析Fig.4 Double enzyme digestion analysis of recombinant expression vector

2.5 重組表達載體的序列分析

將PCR擴增和雙酶切鑒定均為陽性克隆的3管不同連接體系的重組質(zhì)粒，分別取15 μL送金唯智(天津)生物科技有限公司測序，DNAstar軟件進行序列比對，1號管的基因序列方向正確，提示1號管提取的重組表達質(zhì)粒符合要求，插入了相對分子質(zhì)量大小約為822 bp的目的DNA片段，證明成功構(gòu)建了重組表達載體，將其命名為pET-28a-ChPrnp(822)。

2.6 重組菌表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

經(jīng)表達，IPTG誘導劑在16 ℃下誘導蛋白表達量最高(圖5)，加入IPTG的終濃度為0.08 mmol·L-1

1～3，16、28、37 ℃的溫度下誘導表達的蛋白產(chǎn)物；M，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準。1-3， Protein products induced at 16， 28 and 37 ℃; M， Protein marker.圖5 重組菌誘導表達IPTG溫度優(yōu)化Fig.5 Temperature optimization of induced expression of IPTG by recombinant bacteria

進行誘導時，蛋白表達量最高(圖6)，在已確定誘導劑最佳濃度時，16 ℃ 220 r·min-1誘導表達7 h，為正式表達優(yōu)化條件(圖7)。SDS-PAGE電泳分析其蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量大約為40 ku的一條外源蛋白表達條帶，表達的蛋白量大小和預測的Prnp蛋白分子量相一致。

1～5，分別加入IPTG的終濃度為0.08、0.09、0.10、0.11、0.12 mmol·L-1；M，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準。1-5， Adding 0.08， 0.09， 0.10， 0.11， 0.12 mmol·L-1 IPTG， respectively; M， Protein marker.圖6 重組菌誘導表達IPTG濃度優(yōu)化Fig.6 Optimization of concentration of IPTG induced by recombinant bacteria

M，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1～2，誘導5、7 h的重組菌表達產(chǎn)物；3，未誘導的重組菌。M， Protein marker; 1-2， Expression products of recombinant bacteria induced for 5 and 7 h; 3， Uninduced recombinant bacteria.圖7 重組菌誘導表達時間優(yōu)化Fig.7 Optimization of expression time of IPTG induced by recombinant bacteria

3 討論

一般來說，異源表達更容易獲得特定的蛋白，它通過分子生物學技術(shù)將外源基因克隆到人工載體上，構(gòu)建出異源表達體系，分析其結(jié)構(gòu)和特性。大腸埃希菌遺傳背景清楚、易培養(yǎng)、生長廉價、繁殖速度快、蛋白高表達，因此它是很多異源蛋白表達的首選。本實驗的表達宿主菌是不能修飾表達產(chǎn)物的BL21，因此重組表達產(chǎn)物沒有糖基化[24]。

傳染性海綿狀腦病(TSEs)也稱朊病毒病，在腦內(nèi)淀粉樣沉積，引起中樞神經(jīng)病變，導致人和許多動物出現(xiàn)致死性神經(jīng)退行性疾病，Prnp是調(diào)控TSEs的主要基因，基因結(jié)構(gòu)簡單，大多含有3個或5個外顯子，無內(nèi)含子[24-25]。Prnp基因在神經(jīng)元中的表達量很高，并且具有高度保守性，為朊病毒跨物種傳播提供了分子依據(jù)[26]。

目前，朊病毒在牦牛、駝峰、水牛、奶牛、山羊、綿羊、梅花鹿等哺乳動物中已有多方面研究[24，26-27]。在已研究的哺乳動物中，Prnp基因ORF中的DNA序列和PrP氨基酸序列的相似性分別達到90%和95%以上[27]。雞PrP氨基酸序列的相似性同哺乳動物相比只有30%[24]。水牛朊蛋白基因氨基酸序列同牛科動物相比同源性在97.1%以上，不同品種鹿之間朊蛋白基因氨基酸序列之間的同源性較高[28]。牛與綿羊間Prnp基因與其氨基酸序列的同源性分別為97.3%和96.5%；牛與人間Prnp基因與其氨基酸序列的同源性分別為86.7%和90.3%；人與綿羊間Prnp基因與其氨基酸序列的同源性分別為87.1%和90.7%[29]。Prnp基因很大程度上影響了山羊?qū)︷W病的易感性[30]。Prnp基因同源性的高低在一定程度上也影響朊病毒種間屏障的形成，但還需要其他輔助因子共同作用[12]。

國內(nèi)外研究朊蛋白主要從它的基因構(gòu)型、蛋白結(jié)構(gòu)、生理功能、致病機制方面展開，為朊病毒病的預防和治療提供基礎。本研究用pET-28a質(zhì)粒作為表達Prnp基因的原核表達載體，其相對分子質(zhì)量較小，N端帶有一個His/凝血酶/T7標簽蛋白，而在C端帶有His標簽蛋白，在蛋白誘導表達時，蛋白相對分子質(zhì)量可能會比實際大10 ku左右，因此最終外源蛋白表達量為40 ku。

利用IPTG誘導重組蛋白表達時，為使蛋白表達量較高，對誘導條件進行了多方面的探索。37 ℃是菌體生長的適宜溫度，菌體蛋白本身也需要生長，在此溫度下它本身的蛋白急需表達，沒有多余的能力去表達外源蛋白，因此誘導表達需要降低其溫度，實驗表明16 ℃下蛋白表達量較高。而誘導表達時的誘導劑濃度和誘導時間也是影響蛋白表達量的重要因素，經(jīng)過比對分析，發(fā)現(xiàn)在IPTG誘導劑濃度為0.08 mmol·L-1時誘導7 h蛋白表達量較高。用SDS-PAGE電泳驗證可以得到與預期大小相符的蛋白條帶，初步表達了重組的蛋白。

4 小結(jié)

本研究利用pET-28a質(zhì)粒成功構(gòu)建了雞Prnp基因的原核表達載體，并在大腸埃希菌BL21(DE3)中初步表達重組的蛋白，為Prnp朊蛋白的結(jié)構(gòu)、生理功能和致病機制研究提供方法。