響應(yīng)面法優(yōu)化車前草多糖超聲工藝及抗氧化研究

邱曼榆　丘振文　譚漢添

摘要 [目的]通過響應(yīng)面法優(yōu)化車前草多糖的超聲提取工藝，并評價其抗氧化能力。[方法]以車前草多糖（PLP）含量為評價指標(biāo)，結(jié)合單因素試驗和Box-Behnken響應(yīng)面法對車前草多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲取最優(yōu)技術(shù)參數(shù);此外，對車前草多糖進(jìn)行·OH和O2·-清除能力的考察以對其抗氧化活性進(jìn)行評價。[結(jié)果]車前草多糖最佳超聲提取工藝條件為提取溫度61 ℃、超聲時間68? min、料液比1∶34，在此條件下，PLP含量可達(dá)12.25%±0.18%（n=3），與理論值僅相差0.12%;此外，當(dāng)車前草多糖濃度為1 mg/mL時，其對O2·-和·OH的清除率分別為75.46%±0.54%和70.17%±0.94%。[結(jié)論]基于響應(yīng)面法優(yōu)化的車前草多糖超聲提取工藝準(zhǔn)確可行，可用于車前草多糖的提取;車前草多糖具有一定的抗氧化能力。

關(guān)鍵詞 車前草;多糖;響應(yīng)面法;超聲提取工藝;抗氧化活性

中圖分類號 R 284文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2020）23-0214-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.055

Optimization of Ultrasonic Technology of Polysaccharide of Plantago asiatica by Response Surface Methodology and Its Antioxidant Activity Study

QIU Man-yu， QIU Zhen-wen， TAN Han-tian

（The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou，Guangdong 510405）

Abstract [Objective] To optimize the ultrasonic extraction process of polysaccharide of Plantago asiatica by response surface methodology and evaluate its antioxidant capacity. [Method] Taking the content of polysaccharide of Plantago asiatica as the evaluation index， combining single factor test and Box-Behnken response surface method to optimize the extraction process of Plantago asiatica polysaccharide to obtain the best technical parameters.In addition， the scavenging ability of Plantago asiatica polysaccharides on ·OH and O2·- free radicals was investigated to evaluate their antioxidant activity. [Result] The optimal ultrasonic extraction process conditions for polysaccharide of Plantago asiatica were： extraction temperature 61 ℃， ultrasonic time 68 min， and solid-liquid ratio 1∶34. Under this condition， the PLP content could reach 12.25% ± 0.18% （n = 3）， which was only 0.12% different from the theoretical value. In addition， when the polysaccharide of Plantago asiatica was 1 mg/mL， the removal rate of ·OH and O2·- free radicals were about 75.46%±0.54% and 70.17%±0.94%， respectively. [Conclusion] The ultrasonic extraction process of Plantago asiatica polysaccharide optimized based on response surface method is accurate and feasible， and can be used for the extraction of Plantago asiatica polysaccharide; Plantago asiatica polysaccharide has a certain antioxidant capacity.

Key words Plantago asiatica;Polysaccharide;Response surface method;Ultrasonic extraction process;Antioxidant activity

車前草是車前科植物車前（Plantago asiatica L.）或平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥全草，具有清熱利尿通淋、祛痰、涼血、解毒之功效，用于治療熱淋澀痛、水腫尿少、暑濕泄瀉、痰熱咳嗽、吐血衄血、癰腫瘡毒[1]。車前草全草主要含有黃酮類、多糖類及三萜類等多種化合物[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，車前草多糖（polysaccharide of Plantago asiatica，PLP）對高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠具有治療作用，其抗糖尿病作用可能與調(diào)節(jié)腸道菌群和增加SCFA水平有關(guān)[3]。此外，PLP還具有抗氧化和提高免疫力等藥理作用[4-6]。然而，目前關(guān)于PLP提取工藝的研究較少。

響應(yīng)面法由于具有優(yōu)化時間短、應(yīng)用可信度高等優(yōu)點而越來越多地用于工藝優(yōu)化研究中[7-9]，而基于響應(yīng)面法優(yōu)化PLP的超聲提取工藝鮮見報道。為了更好地利用車前草的多糖資源，該研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方案，研究各個因素之間對PLP提取率的影響，并作出響應(yīng)面圖，對超聲法提取PLP工藝進(jìn)行條件優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

UV-1900型雙光束紫外可見分光光度計（日本島津儀器有限公司）;TG16臺式高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;梅特勒LE204E萬分之一電子天平（梅特勒-托利多國際有限公司）;車前草全草（廣東康美藥業(yè)有限公司，批號20190309）;D-無水葡萄糖對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號B20966）。

1.2 試驗方法

1.2.1 PLP含量的測定。

1.2.1.1

D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的配制。精確稱取10.05 mg葡萄糖對照品于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水配制成0.100 5 mg/mL的對照品母液。

1.2.1.2 PLP溶液的制備。將車前草干燥后粉碎成粗粉，精密稱取5.0 g粉末置于250 mL具塞錐形瓶中，加入蒸餾水適量，在規(guī)定的溫度下超聲設(shè)定的時間，分次于5 000 r/min離心20 min，獲取上清液，上清液緩慢加入無水乙醇，攪拌，至混合液乙醇濃度為80%，4 ℃過夜，分次于5 000 r/min離心20 min，棄上清液。多糖沉淀加入100 mL蒸餾水復(fù)溶，即得PLP溶液。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。分別移取“1.2.1.1”對照品母液0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mL于比色管中，加水至2.0 mL;精密加入苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，在100 ℃水浴條件下靜置20 min后，取出后立即置于冰水浴進(jìn)行冷卻處理，然后于490 nm處測定吸光度?？瞻讓φ諡檎麴s水。繪制以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.4 方法學(xué)考察。方法學(xué)考察參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行操作，分別計算得精密度、重復(fù)性、12 h內(nèi)穩(wěn)定性的RSD。

1.2.1.5 PLP含量的測定。精密移取“1.2.1.2”中PLP溶液2 mL于5 mL容量瓶中，用蒸餾水補(bǔ)至刻度線并搖勻。精密吸取該稀釋液2.0 mL，按照“1.2.1.3”自“加入苯酚溶液1.0 mL”開始同法操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定PLP含量。

1.2.2 PLP的提取工藝單因素考察。

1.2.2.1 提取溫度對PLP含量的影響。在料液比、提取時間、提取功率分別為1∶20（g∶mL）、30 min、300 W的條件下，考察溫度為30、40、50、60、70、80 ℃時對PLP含量的影響。

1.2.2.2 提取時間對PLP含量的影響。在料液比、提取溫度、提取功率分別為1∶20、60 ℃、300 W的條件下，考察提取時間分別為30、40、50、60、70、80 min時對PLP含量的影響。

1.2.2.3 料液比對PLP含量的影響。在提取溫度、提取時間、提取功率分別為60 ℃、60 min、300 W的條件下，考察料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45時對PLP含量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，參考Box-Behnken的試驗設(shè)計原則，選取超聲提取溫度（X1）、提取時間（X2）和料液比（X3）3個影響因素，以PLP含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計并根據(jù)試驗結(jié)果作出響應(yīng)面圖，試驗因素水平詳見表1。并采用Design Expert 7.0數(shù)據(jù)處理軟件對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.4 PLP抗氧化功能研究。取1.0 mL濃度分別為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的PLP樣品溶液按照參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行PLP清除O2·-和·OH自由基能力的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按“1.2.1.3”方法操作，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.063 0X+0.029 0（r=0.999 7），表明葡萄糖濃度在0.634 3～12.680 0 μg/mL與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.2 方法學(xué)考察

按“1.2.1.4”方法操作，計算得精密度RSD為2.45%，重復(fù)性RSD為2.67%，12 h內(nèi)穩(wěn)定性RSD為3.12%，表明該多糖含量測定方法準(zhǔn)確、可靠，可作為后續(xù)測定不同工藝提取PLP含量的方法。

2.3 PLP的提取工藝單因素考察

2.3.1 提取溫度對PLP含量的影響。由圖1a可知，PLP含量在60 ℃時達(dá)到最大。因此，提取溫度宜選在60 ℃左右。

2.2.2 提取時間對PLP含量的影響。由圖1b可知，PLP含量的峰值出現(xiàn)在提取時間為60 min，因此，最終確定提取時間在60 min左右。

2.2.3 料液比對PLP含量的影響。由圖1c可知，PLP在料液比為1∶35時提取含量最高，因此，料液比宜選取在1∶35左右。

2.4 響應(yīng)面試驗

按“1.2.3”方法操作，試驗結(jié)果見表2。分析獲得PLP含量（Y）回歸方程為Y=-188.1+1.579 235X1+2.945 028 6X2+1.372 4X3-0.010 002X1X2 -0.005 00X1X3+0.003 01X2X3-0.007 01X12-0.017 99X22-0.011 89X32。經(jīng)方差分析可知，該回歸模型P值小于0.01，表明模型具有顯著性，試驗方法準(zhǔn)確可靠;另外，方程失擬項遠(yuǎn)大于0.05，回歸系數(shù)遠(yuǎn)大于0.9，充分表明模型具有較好的擬合度，與實測值相關(guān)度好。

為了確定影響PLP含量的最大因素，該研究基于回歸方程再次使用Design-Expert 7.0軟件繪制響應(yīng)面圖（圖2）。由圖2可知，各因素之間的響應(yīng)面均較陡峭，說明各因素之間的交互作用均較強(qiáng)。根據(jù)所得到的模型，預(yù)測最優(yōu)工藝條件為提取溫度61.4 ℃、提取時間68.3 min、料液比為1∶34.3，在此條件下PLP含量理論上可達(dá)12.48%。根據(jù)實際情況，最終確定最佳工藝為提取溫度61 ℃、提取時間68 min、料液比為1∶34，在此條件下，PLP含量可達(dá)12.25%±0.18%（n=3），與理論值僅相差0.12%，結(jié)果表明根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化的PLP提取工藝準(zhǔn)確可行。

2.5 PLP抗氧化功能研究

從圖3可以看出，當(dāng)濃度為1 mg/mL時，PLP對于O2·-和·OH的清除率分別為（75.46±

3 討論

該單因素試驗考察時，發(fā)現(xiàn)隨著提取溫度和料液比的增加，PLP含量均出現(xiàn)先增加后下降的趨勢，表示在多糖提取過程中，溫度過高（超過70 ℃）可能導(dǎo)致多糖的降解，這可能對于其他植物多糖的提取具有一定的指導(dǎo)意義。

多糖的研究和開發(fā)是目前的研究熱點之一。目前文獻(xiàn)對于車前草多糖的提取包括熱水浸提法和微波提取法。熱水浸提法提取效率較低，僅為7.4%[12]，而微波提取法為9.41%[13]，低于該試驗條件下的12.25%，說明該研究基于響應(yīng)面法的車前草多糖的超聲提取工藝優(yōu)化較為成功。然而，該試驗條件下所提取的多糖為粗多糖，后續(xù)可通過對粗多糖進(jìn)行脫色、除蛋白等各種純化工藝獲取精多糖，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，為后續(xù)開發(fā)利用車前草多糖資源奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

該研究基于響應(yīng)面法優(yōu)化車前草多糖的最佳超聲提取工藝條件為提取溫度68 ℃、提取時間61 min、料液比為1∶34，在此條件下，PLP含量可達(dá)12.25%。該提取方法工藝穩(wěn)定、操作簡單、方法可行、結(jié)果可靠。另外，當(dāng)車前草多糖濃度為1 mg/mL時，其對O2·-和·OH自由基的清除率分別為75.46%±0.54%和70.17%±0.94%，具有一定的抗氧化能力。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：69.

[2] 王琪，陶河清.車前草藥理作用的研究進(jìn)展[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2017，17（A2）：72，75.

[3] NIE Q X，HU J L，GAO H，et al.Polysaccharide from Plantago asiatica L.attenuates hyperglycemia，hyperlipidemia and affects colon microbiota in type 2 diabetic rats [J].Food hydrocolloids，2019，86：34-42.

[4] 董升，梁晗業(yè)，王禹捷，等.車前草粗多糖對環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫增強(qiáng)作用[J].食品工業(yè)科技，2018，39（18）：289-293.

[5] 陳家磊.車前草多糖對小鼠巨噬細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制的研究[D].重慶：西南大學(xué)，2017.

[6] 肖懷秋，李玉珍.車前草粗多糖提取及生物學(xué)活性研究[J].食品與發(fā)酵科技，2009，45（3）：37-40.

[7] 張意笠，程汝濱，黃真，等.響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)香花總黃酮提取工藝及其抗氧化活性[J/OL].食品工業(yè)科技，2020-04-08[2020-04-10].http：∥kns.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20200408.1638.043.html.

[8] 高雅，陳新梅，趙元，等.Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化昆侖雪菊總黃酮提取工藝及抗氧化研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2019，33（5）：54-61.

[9] 李文莉，吳芳芳，陳路，等.響應(yīng)面法優(yōu)化溪黃草的揮發(fā)油提取工藝[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2019，33（4）：50-53.

[10] 李世杰，張丹雁，嚴(yán)婭娟，等.響應(yīng)面法優(yōu)化陽春砂多糖的超聲輔助提取工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（22）：47-51.

[11] 楊孝輝，郭君.響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓提取枸杞多糖工藝[J].食品工業(yè)科技，2020，41（17）：187-192.

[12] 李官浩，楊詠潔，南昌希.車前草多糖的提取及純化工藝研究[J].食品科技，2008，33（10）：156-159.

[13] 郭婕，胡春紅，袁淑培，等.車前草多糖微波提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35（16）：223-225，230.

作者簡介 邱曼榆（1990—），女，廣東普寧人，中藥師，從事用藥指導(dǎo)與監(jiān)護(hù)工作。

收稿日期 2020-04-29