血清4型禽腺病毒山東株基因組序列的克隆及遺傳演化分析

宋玲玲

摘? 要：從山東某地區(qū)發(fā)生心包積液綜合征的發(fā)病雞中收集病料，按常規(guī)方法處理后接種SPF雞胚，分離到1株病毒，經(jīng)PCR和測序分析鑒定該分離株為I群禽腺病毒、血清4型禽腺病毒，命名為FAV-SD。合成引物成功擴(kuò)增病毒全基因組序列，并進(jìn)行序列的測定與分析，結(jié)果表明FAV-SD株全基因組大小為43752 bp，通過hexon基因同源性比對，F(xiàn)AV-SD與我國今年報(bào)道的禽腺病毒血清4型同源性最高;遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，F(xiàn)AV-SD分離株與我國禽腺病毒血清4型流行毒株處于同一分支，而與國外禽腺病毒血清4型毒株不在同一分支，存在遺傳差異，說明中國流行的血清4型禽腺病毒具有自身地域特點(diǎn)。該病毒株的分離鑒定為禽腺病毒疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：I群禽腺病毒;血清4型;分離鑒定;同源性

禽腺病毒（Fowl adenovirus， FAdV）根據(jù)群特異性抗原的不同分為3個群，I群禽腺病毒具有共同的群抗原[1]。該群病毒在雞、鴨、鵝體內(nèi)普遍存在，能使禽群呈隱性感染，作為繼發(fā)病原共同作用于家禽，并能垂直傳播，污染雞胚[2]。FAdV血清型眾多，根據(jù)血清中和試驗(yàn)可將FAdV分為12個血清型，分別為血清型1～8a、8b～11[3]。I群禽腺病毒的12個血清型均能感染雞，引發(fā)不同程度的肝炎癥狀。FAdV血清1型的雞胚致死孤兒病毒（Chicken embryo lethal orphan virus，CELO）可導(dǎo)致肌胃糜爛（Gizzard erosions，GE）;血清4型FAdV感染可引起心包積水綜合征（Hybropericardium syndrome，HPS），剖檢以淡黃色心包積液或者心包內(nèi)凍狀物為特征，同時伴有肝臟壞死，因此也常稱為肝炎-心包積水綜合征（Hepatitis-Hydropericardium syndrome，HHS），死亡率高達(dá)30%～90%[4-6]。1987年在巴基斯坦安卡拉地區(qū)的肉雞場爆發(fā)了一種以心包積液為特征的疾病，稱為心包積液綜合征，又稱安卡拉病，該病后來蔓延至全國，給當(dāng)?shù)氐娜怆u養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的損失。隨后心包積液綜合征在科威特、伊朗、日本、墨西哥等地相繼發(fā)生。經(jīng)研究證實(shí)，這些地區(qū)的心包積液綜合征均由I群禽腺病毒的血清4型引起。

自2013年以來，我國雞群陸續(xù)爆發(fā)以肝臟壞死為特征的雞包涵體肝炎，死亡率約10%～30%。2014年突然出現(xiàn)典型的以心包中有淡黃色液體或凝膠樣物為特征的心包積水綜合征，該病在我國雞群中大面積爆發(fā)，病雞出現(xiàn)突然死亡，死亡率達(dá)30%～90%。2015年6月，山東省部分地區(qū)的817肉雞中爆發(fā)了一種以死亡快、死亡率高、剖檢以心包積液為主要病變特征的傳染病，隨后該病傳至山東省多個地區(qū)，感染宿主也擴(kuò)大到蛋雞、麻雞、白羽肉雞、三黃雞、土雞等品種[7-9]。2015年夏，禽心包積水-包涵體肝炎綜合征（Hydropericardium syndrome-inclusion body hepatitis，HPS-IBH）在山東、河南、遼寧、廣東等地呈現(xiàn)大規(guī)模爆發(fā)，給我國家禽業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

根據(jù)病毒基因組特征，可將FAdV分為5個種，即A～E種。FAdV 12個血清型屬于不同種，其中A種包括血清1型，B種包括血清5型，C種包括血清4型和血清10型，D種包括血清2、3、9和11型，E種包括血清6、7、8a和8b。對我國2014～2016年部分地區(qū)雞群病料進(jìn)行檢測和流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，我國目前FAdV主要流行毒株為C、D、E三個種，其中C種FAdV以血清4型為主[10]。

FAdV屬于禽腺病毒I群，結(jié)構(gòu)為非折疊的二十面體，病毒粒子大小在70～90 nm。該病毒粒子具有252個衣殼粒，其中240個非頂角殼粒為六鄰體（hexon），12個頂角殼粒為五鄰體（Penton），每個五鄰體有2條纖維突起（Fiber）。研究表明，hexon蛋白帶有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇，可以引發(fā)極強(qiáng)的中和反應(yīng)，具有被中和抗體識別表位，因此hexon基因通常用于FAdV種的分類[11-13]。FAdV基因組為雙股線性DNA，基因組大小約為43～45 kb，不同種FAdV基因組結(jié)構(gòu)不完全相同，但同一種內(nèi)不同血清型病毒的基因組結(jié)構(gòu)相似。某些基因在各血清型FAdV中較為保守，如hexon基因的部分片段，因此該基因可作為診斷型和群的首選蛋白。本研究對分離獲得的FAdV毒株進(jìn)行全基因組克隆，對該病毒株進(jìn)行鑒定及遺傳變異分析，探討我國流行毒株與已報(bào)道的禽腺病毒的親緣關(guān)系，了解該病的感染流行特點(diǎn)，為禽腺病毒感染的防控提供理論依據(jù)，以促進(jìn)家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

1? 材料和方法

1.1? 病毒、載體及雞胚? FAdV-4 SD2016毒株由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所分離、鑒定、純化并保存，pEASY-T3 Cloning Vector、DH5a感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，SPF雞胚由山東昊泰實(shí)驗(yàn)動物繁育公司提供。

1.2? 工具酶和主要試劑? LA Taq with GC buffer、dNTP Mixture、DL2000DNA Marker、病毒基因組DNA提取試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司;T3載體為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒購自BIOMIGA公司;其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3? 引物合成? 參考GenBank公布的I群禽腺病毒全基因組序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增病毒全基因組的引物序列，見表1;引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。離心后加入DEPC水溶液至工作濃度10 μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4? 病毒基因組DNA的提取與PCR擴(kuò)增? 取SPF雞胚擴(kuò)增的FAdV-4 SD2016病毒絨毛尿囊膜上清液，將準(zhǔn)備的病毒液反復(fù)凍融三次，8000 r/min離心10 min后取上清，將200 μL上清液作為病毒DNA提取樣品，按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit說明書進(jìn)行操作。

以病毒DNA為模板，分別用相應(yīng)的引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：DNA模板3 μL，用滅菌去離子水補(bǔ)至總體積50 μL，于控?zé)嵫h(huán)儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR循環(huán)反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)入94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共進(jìn)行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，最后停止于4 ℃。將PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.5? PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定? 用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增的核苷酸片段，回收產(chǎn)物與pEasy-T3克隆載體連接，并轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞。挑取白色菌落接種于抗氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃， 220 r/min振蕩培養(yǎng)。使用引物M13F、M13R對液體LB培養(yǎng)菌液進(jìn)行PCR鑒定。

1.6? 序列測定與分析? 將鑒定為陽性的菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果用DNAStar軟件包進(jìn)行核苷酸序列的拼接、開放閱讀框（ORF）的確定以及氨基酸推到序列的預(yù)測，并分析全基因組特點(diǎn)。

1.7? 序列比對及遺傳進(jìn)化分析? PCR擴(kuò)增得到的hexon基因序列經(jīng)BLAST在線比對和Lasergene軟件分析（DNAStar），與國內(nèi)外FAdV毒株的同源基因序列進(jìn)行同源性比對，利用分子生物學(xué)軟件MEGA6.0對分離毒株和參考毒株進(jìn)行遺傳演化分析，用最大似然法（Maximum Likelihood， ML）繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2? 結(jié)果

2.1? 序列的測定、處理與基因組分析? 用引物成功地?cái)U(kuò)增出FAdV-4 SD2016毒株的基因全序列，并進(jìn)行了鑒定和測序。用DNAStar軟件包將測序所得結(jié)果進(jìn)行拼接，對部分ORF的位置以及編碼的蛋白進(jìn)行了預(yù)測，見表2。

2.2? 分離株Hexon蛋白基因序列測定及同源性分析? 對分離株FAdV-4 SD2016的hexon基因序列與已報(bào)道的FAdV毒株同源基因進(jìn)行同源性比對，F(xiàn)AdV-4 SD2016與FAdV血清4型同源性最高，結(jié)果如圖1所示。其中FAdV-4 SD2016分離株與近幾年中國血清4型FAdV分離株JSJ13、HN/151029、HLJFAd15、HLJDAd2015、CH/AHBZ/2015、CH/JSXZ/2015、HLJ/151118的同源性為100%，與墨西哥毒株MX-SHP95的同源性為98.6%。分離株FAdV-4 SD2016與A、B、D和E種FAdV的同源性分別為76.1%、73.4%、69.5%～71.5%和74.3%～75.2%。hexon基因序列比對的結(jié)果表明，分離株與A、B、D和E種FAdV核酸序列差異較大。

2.3? 分離株hexon蛋白基因遺傳進(jìn)化分析? 對分離株FAdV-4 SD2016的hexon基因序列與已報(bào)道的FAdV毒株同源基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，用ML方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。根據(jù)hexon基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，F(xiàn)AdV分為5個種，分別為FAdV A～E種（見圖2）;分離株劃分為禽腺病毒C種、血清4型。在C種內(nèi)，分離株與中國分離株HLJFAd15、HLJ/151118、CH/AHBZ/2015、HN/151029、HN/151025、JSJ13、CH/JSX2/2015、HLJDAd2015親緣關(guān)系最近，處于同一個分支，與奧地利毒株KR5、加拿大毒株ON1和墨西哥毒株MX-SHP95的遺傳進(jìn)化有一定差異，而且分離株與FAdV A、B、D、E種毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3? 討論

禽心包積水-包涵體肝炎綜合征（HPS-IBH）主要是由FAdV-4引起的一種高死亡率的傳染病，研究表明該病爆發(fā)造成了巴基斯坦多個養(yǎng)殖場雞只死亡率高達(dá)75%，而在印度該病的死亡率高達(dá)80%[14]。自1987年在巴基斯坦報(bào)道心包積水綜合征后，美國、西班牙、韓國、日本、波蘭等國先后報(bào)道了該病的流行[15-19]。2012年起，禽心包積水-包涵體肝炎綜合征（HPS-IBH）在我國多地零星爆發(fā);2015年，我國部分地區(qū)出現(xiàn)高死亡率的雞心包積水綜合征，死亡率約30%～90%，給我國養(yǎng)雞業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。對2014～2016年的禽腺病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國大部分地區(qū)的雞群均存在禽腺病毒感染[20]。

臨床病料檢測發(fā)現(xiàn)，多數(shù)心包積液的病例不僅僅存在禽腺病毒感染，而是同時存在傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus， IBDV）或雞傳染性貧血病毒（Chicken Infectious Anemia Virus，CIAV）感染，甚至3種病毒的混合感染。研究發(fā)現(xiàn)傳染性法氏囊病病毒、傳染性貧血病毒可導(dǎo)致I群禽腺病毒的繼發(fā)感染，同時傳染性法氏囊病病毒本身就有很強(qiáng)的致死性，這些都是造成禽腺病毒高發(fā)病率、高死亡率的原因[17，21]。因此，加強(qiáng)原發(fā)病原的免疫防控對預(yù)防禽腺病毒感染意義重大。

近年來，陸續(xù)有報(bào)道指出適應(yīng)細(xì)胞的FAdV-4活病毒疫苗、油乳劑滅活疫苗、雞胚弱化的活毒疫苗均可對該病產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)作用[22]。利用該分離株進(jìn)行了滅活疫苗免疫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，滅活疫苗具有良好的免疫保護(hù)作用，可為禽腺病毒的疫苗防控提供候選疫苗株。

本研究對分離獲得的血清4型禽腺病毒FAdV-4 SD2016毒株的全基因組進(jìn)行了克隆，序列分析表明，其與國內(nèi)近期公布的血清4型禽腺病毒親緣關(guān)系很近，可用于該病的防控措施研究。禽腺病毒hexon蛋白含有主要的特異性抗原決定簇，可被中和抗體識別，是FAdV的主要免疫保護(hù)性蛋白。本研究對分離株的hexon基因進(jìn)行同源性分析和遺傳進(jìn)化分析，二者分析結(jié)果較為一致，分離株FAdV-4 SD2016與C種、血清4型病毒株同源性最高，在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中與血清4型處于同一分支。該分離株與國內(nèi)目前報(bào)道的多個病毒株同源性較高，與國外病毒株存在一定差異，說明國內(nèi)的血清4型禽腺病毒在遺傳進(jìn)化上有地域特點(diǎn)。分析發(fā)現(xiàn)，該分離株Hexon基因的氨基酸發(fā)生了變異，其變化位點(diǎn)可能屬于主要抗原表位區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)抗原表位可作為新型多肽疫苗的有效成分，因此該分離株對開發(fā)新型疫苗具有重要意義。

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