一株絮凝劑產(chǎn)生菌死谷芽孢桿菌Z11的篩選和鑒定

張曉飛, 孫云龍, 韓國紅, 李刻秦 , 師曉喆, 胡加超, 董淑敏, 王 錚 , 趙 哲, 于 茹, 曲 杰, 宋 峰, 李正華*

1. 山東省生物物理重點實驗室， 山東 德州 253023； 2. 德州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 山東 德州 253023； 3. 肥城市第三高級中學(xué)， 山東 泰安 217600

絮凝沉降法[1]在污水處理行業(yè)應(yīng)用廣泛，目前絮凝劑主要包括無機絮凝劑[2]、有機絮凝劑[3]及生物絮凝劑[4]，其中生物絮凝劑最為有效。生物絮凝劑因其來源廣泛、安全高效、無二次污染等優(yōu)點近年來逐漸成為研究熱點。微生物絮凝劑是由微生物分泌的天然絮凝劑[5]，是絮凝微生物在生長過程中代謝產(chǎn)生的一種具有絮凝活性、高效、環(huán)保的新型水處理劑[6-9]。在重金屬污水中加入絮凝劑產(chǎn)生菌[10,11]，將其分泌物提取純化，可獲得安全高效的天然降解劑，可用于除濁、脫脂，去除金屬離子，促進污泥脫水[12]，并廣泛應(yīng)用于發(fā)酵、食品加工[13,14]和環(huán)保等領(lǐng)域。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于MBF方面的研究報道很多，上世紀(jì)70年代以來，美國、日本等其他國家非常重視對MBF的研究，20世紀(jì)美國科學(xué)家Butterfield首次從活性污泥中篩選出產(chǎn)絮凝劑菌株，近百種產(chǎn)絮凝劑菌株從土壤和活性污泥中篩選出[15]，包括真菌、細菌、放線菌和藻類[16,17]，其中最主要的有芽孢桿菌屬(GenusBacillus)[18]、類芽孢桿菌(Bacteroides)[19]、假單胞菌(Pseudomonas)[20]等。但由于大多數(shù)絮凝劑絮凝活性較低[21]，且可工業(yè)化生產(chǎn)的MBF并不多，因此，MBF高產(chǎn)菌株一直是該領(lǐng)域的熱點工作之一。

本研究從活性污泥中篩選分離出7株絮凝效果良好的菌株W7、Z9、Z11、X11、Z12、J9和Z18，選取絮凝效率最高的菌株Z11為研究對象。通過形態(tài)、生理生化特性和16S rRNA序列分析等，初步確定菌株Z11種屬，并結(jié)合單因素試驗及高嶺土懸濁液為處理體系，研究菌株Z11的絮凝特性。

1 材料與方法

1.1 材料

(1) 樣品：德州卓奧水質(zhì)凈化有限公司的活性污泥。

(2) 實驗儀器：高壓蒸汽滅菌鍋，MLS-3750 日本三洋；超凈工作臺，JHT-DSC濟南潔康凈化設(shè)備廠；分析天平，PL203上海梅特勒；高速離心機，5418R德國Eppendorf；生化培養(yǎng)箱，QYC-200上海新苗；恒溫搖床，ZWY-211C上海智誠；紫外分光光度計，TU-1900濟南明智科學(xué)儀器有限公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱，WGL-125B天津市泰斯特儀器有限公司；生物顯微鏡，CX23 OLYMPUS奧林巴斯；PCR擴增儀，Thermo Arktik賽默飛。

(3) 培養(yǎng)基及試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等試劑，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；可溶性淀粉、硝酸鉀、瓊脂等試劑，上海博微生物科技有限公司；95%乙醇，結(jié)晶紫，過氧化氫溶液，番紅，伊紅，美藍，路哥式碘液，吲哚試劑，甲基紅染液等，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1絮凝劑產(chǎn)生菌的分離純化

供試活性污泥采自德州卓奧水質(zhì)凈化有限公司，用無菌水稀釋成濃度分別為(10-1～10-8)懸濁液，利用稀釋涂布、平板劃線法分離細菌單菌落，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察單菌落長勢及菌落特征。將純菌種接種到LB液體培養(yǎng)基中，220 r/min 30 ℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)12 h，測定其對高嶺土懸濁液的絮凝活性。

1.2.2絮凝活性的測定方法

以高嶺土懸濁液為處理體系，向40 mL高嶺土懸濁液(4 g/mL)中加2 mL1%的CaCl2和3 mL培養(yǎng)液的上清液，調(diào)pH為7.0，攪拌5 min，靜置20 min，在550 nm處測定OD值，對照組為不加培養(yǎng)液的樣品。測定各相同深度上清液OD值，與第一次絮凝相比，差值較小其穩(wěn)定性好。計算絮凝率的方法如下:

絮凝率F(%)=(A0-A) /A0×100%

式中A0為空白對照組OD550;A為測試組樣品OD550

選擇其中絮凝率較高菌株，命名為菌株Z11。

1.3 菌株Z11菌種鑒定

1.3.1形態(tài)學(xué)觀察

挑取少許單菌落接種至LB固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h至菌落生長良好，觀察菌落形態(tài)特征；在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，觀察試管中的菌體生長狀況；選擇生長良好的單菌落進行簡單染色、革蘭氏染色，觀察細菌細胞形態(tài)，鑒別細菌的種類。

1.3.2生理生化實驗

對菌株進行生理生化實驗，依據(jù)《伯杰氏細菌分類手冊》對菌種的生理生化特性進行鑒定。

1.3.316S rRNA 序列測序

(1) 細菌DNA抽提試劑盒快速提取菌株Z11基因組總DNA。

(2) 以細菌16S rRNA通用引物27F和1492R為擴增引物進行PCR擴增。

PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)體系如下：0.5 μL樣品DNA模板，12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，兩種引物27F和1492R各1 μL (10 pmol)，10 μL ddH2O。

PCR擴增條件：94 ℃熱啟動3 min， 94 ℃變性30 sec循環(huán)30次，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后72 ℃延伸5 min。

反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測5 μL PCR擴增產(chǎn)物，將產(chǎn)物純化后測序，結(jié)果提交至NCBIGenBank，并與數(shù)據(jù)庫中已有序列進行Blast比對，并通過MEGA進行序列分析，確定該菌株的分類地位。

1.4 菌株Z11絮凝特性研究

1.4.1溫度對菌株Z11絮凝率的影響

在種子培養(yǎng)基中，分別在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃條件下220 r/min培養(yǎng)菌株，將培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h的菌液取3 mL加入到高嶺土懸濁液(4 g/mL)中，攪拌5 min后靜置20 min。檢測各組絮凝率，處理3組，取平均值。

1.4.2需氧量對菌株Z11絮凝率的影響

種子培養(yǎng)基初始pH調(diào)節(jié)到7.0，接種后分別在轉(zhuǎn)速為100 r/min、150 r/min、200 r/min、220 r/min以及250 r/min，30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12 h，取菌液3 mL加入到高嶺土懸濁液(4 g/mL)中，攪拌5 min后靜置20 min。檢測各組絮凝率，處理3組，取平均值。

1.4.3pH對菌株Z11絮凝率的影響

取40 mL高嶺土懸濁液(4 g/mL)于100 mL三角燒瓶中，分別加入2 mL1%的CaCl2，滴加鹽酸、CaOH2溶液將燒杯中的液體pH分別調(diào)為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，每個燒杯加入3 mL菌株Z11培養(yǎng)液，攪拌5 min后靜置20 min。吸取同一深度的上清液，以相同條件下不添加任何試劑的樣品為對照組，測OD550，計算絮凝率，處理3組，取平均值。

1.4.4CaCl2添加量對絮凝率的影響

以400 mL高嶺土懸濁液(4 g/mL)為處理體系，在500 mL燒杯中，分別加入濃度為1%的CaCl2溶液8 mL、14 mL、24 mL和32 mL，加入3 mL培養(yǎng)液，攪拌5 min后靜置20 min。吸取同一深度的上清液，對照組為不加任何試劑的樣品，相同條件下測上清液的吸光度OD550。測定絮凝率，處理3次，取平均值。

1.4.5菌株Z11培養(yǎng)液使用量對絮凝率的影響

以400 mL高嶺土懸濁液(4 g/mL)為處理體系，在500 mL燒杯中，加2 mL 1%的CaCl2溶液，并向其他燒杯中分別加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL 菌株Z11培養(yǎng)液，攪拌5 min，靜置20 min。取同一深度的上清液，對照組為不加任何試劑的樣品，測定其OD值，計算絮凝率，重復(fù)3組。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種篩選結(jié)果

經(jīng)稀釋涂布平板法與平板劃線分離法，從德州卓奧水質(zhì)凈化有限公司的活性污泥中共篩選出158個單菌落，其中20株具有絮凝活性，以菌株Z12、J9、Z18、W7、Z9、Z11和X11的絮凝率效果較好，如表1所示，菌株Z11絮凝率最高，因此將其作為后續(xù)實驗研究對象。

表1 各絮凝劑菌株絮凝活性

2.2 菌株Z11菌種鑒定結(jié)果

2.2.1菌落形態(tài)特征

菌株Z11的菌落在LB固體培養(yǎng)基上呈圓形、淡黃色、不透明狀，其表面不光滑、有褶皺，菌落有粘性，易挑取。簡單染色后觀察菌株Z11菌體形狀為直桿狀，部分為彎曲狀，且兩端粗細差異不大(見圖1)。

2.2.2生理生化鑒定

對菌株Z11進行生理生化分析，如表2該菌種為pH大于6.0，革蘭氏陰性菌，代謝產(chǎn)生有機酸、氣體、乙酰甲基甲醇和明膠酶，能夠分解淀粉。根據(jù)《伯杰氏菌種鑒定手冊》，初步鑒定為芽孢桿菌屬(GenusBacillus)。

2.2.316S rRNA基因序列測序

采用16S rRNA通用引物(27F和1492R)擴增菌株Z11基因組總DNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送至公司測序，結(jié)果提交至GenBank獲得序列登入號KY049897。在數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，結(jié)果顯示Z11菌株16S rRNA基因序列與BacillusvallismortisIGSI-2 (MH744666.1) 相似性為 99%。分析其系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系，結(jié)果顯示Z11菌株與Bacillusvallismortis聚在同一分支(圖2)。故初步鑒定為死谷芽孢桿菌屬，命名為BacillusvallismortisZ11。

A

B

表2 菌株Z11的生理生化特性

2.3 絮凝特性研究結(jié)果

2.3.1溫度對菌株Z11絮凝率的影響

溫度對菌株Z11絮凝率的影響呈現(xiàn)倒“U”型(見圖3)。在溫度低于25 ℃時，絮凝效果隨溫度升高而增加，在25 ℃～35 ℃之間菌株生長狀況較好，其中30 ℃時菌株生長率最高，絮凝率最高達到97.5%，之后溫度進一步升高，絮凝效果變差。

注：括號內(nèi)數(shù)值為GenBank登錄號；分支上數(shù)字表示Bootstrap支持率；標(biāo)尺刻度0.0002表示序列差異的分支長度。

圖3 溫度對菌株Z11絮凝效率的影響

2.3.2需氧量對菌株Z11絮凝率的影響

在一定轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，菌株Z11絮凝率隨著轉(zhuǎn)速增加而提高，超過一定轉(zhuǎn)速時，絮凝率保持穩(wěn)定。當(dāng)轉(zhuǎn)速達到220 r/min時，菌株絮凝率最高，達到97.5%，說明在轉(zhuǎn)速為220 r/min條件下菌株生長對氧的需求已經(jīng)基本達到飽和(見圖4)。

2.3.3不同pH對菌株絮凝率的影響

過酸或過堿均會影響微生物的代謝活性，從而影響微生物的絮凝效果，因此菌株在不同pH條件下產(chǎn)微生物絮凝劑的絮凝效果如圖5所示，培養(yǎng)液受pH的影響，最佳pH范圍為3.0～11.0，此范圍內(nèi)均有良好的絮凝效果，當(dāng)pH為5.0時菌體代謝活性最高，對高嶺土懸濁液的絮凝率為91.79%；當(dāng)pH為3.0時菌株生長較弱，絮凝活性較低； pH大于5.0，隨著pH的逐漸增加，菌株絮凝活性逐漸將低。所以在培養(yǎng)該培養(yǎng)液時，應(yīng)控制pH在5.0附近，在過酸或過堿條件下不利與菌株生長。

圖4 轉(zhuǎn)速對菌株Z11絮凝效率的影響

圖5 pH對菌株Z11絮凝效率的影響

2.3.4CaCl2添加量對菌株絮凝率的影響

二價金屬離子能降低膠體分子間的排斥力，促進絮凝效果。由圖6可知，Ca2+作為助凝劑，當(dāng)CaCl2含量為24 g時，絮凝活性最高，對高嶺土懸濁液的絮凝率達到91.60% ，CaCl2含量為40 g時，促進效果降低，對高嶺土懸濁液的絮凝率為68.2%。因此，CaCl2最優(yōu)添加量為24 g/L。

2.3.5菌株Z11培養(yǎng)液使用量對絮凝率的影響

培養(yǎng)液添加量不同對高嶺土懸濁液的絮凝效果不同，如圖7所示，培養(yǎng)液添加量為1 mL時，絮凝活性較好達到85.75%，當(dāng)培養(yǎng)液不斷增加時，絮凝活性在一定范圍內(nèi)隨培養(yǎng)液的使用量增加而增加，當(dāng)培養(yǎng)液添加達到3 mL～5 mL時，絮凝活性變化不明顯，因此，每1 L高嶺土及CaCl2懸濁液中菌株Z11培養(yǎng)液的最佳添加量為3 mL。

圖6 CaCl2添加量對絮凝率的影響

圖7 不同培養(yǎng)液使用量的絮凝活性

2.3.6最優(yōu)條件下菌株Z11絮凝率

將菌株Z11在30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)12 h，取3 mL添加到4 g/mL高嶺土懸濁液和24 g/L 1%氯化鈣溶液混合液中，調(diào)節(jié)pH為5.0，攪拌5 min后靜置20 min。測定菌株Z11絮凝率，重復(fù)3次，取平均值(見表3)。

表3 菌株Z11絮凝率測定

3 結(jié)論

MBF在水處理中具有廣闊的應(yīng)用前景，對城市污水具有良好的絮凝活性。陳金發(fā)等[22]篩選鑒定出了一株路德維希腸桿菌，此菌株在最優(yōu)條件下處理生活污水去除率可達72.2% 。GUO等[23]從活性污泥中篩選出MBF，在最優(yōu)條件對畜禽廢水的處理效率為87.9%。MBF在供水濁度和除菌效果等方面均優(yōu)于有機和無機絮凝劑，且用量少，對人體無副作用。郭俊元等[24]以淀粉生產(chǎn)廢水為原料制備MBF，將其應(yīng)用于淀粉廢水的處理，能夠去除淀粉廢水中72. 1%的濁度和47. 9%的COD。隨著工業(yè)廢水、生活污水以及畜業(yè)廢水的產(chǎn)生和排放的不斷增加，尋找出高絮凝效率的微生物菌株具有重要意義。

本研究從活性污泥中分離獲得158株單菌落，對其進行絮凝活性檢測，篩選鑒定得到7株絮凝活性較高的菌株。并對其中絮凝活性最高的菌株Z11培養(yǎng)條件進行優(yōu)化并進行單因素實驗，得到其在30 ℃、220 r/mn條件下培養(yǎng)菌液，菌株培養(yǎng)液添加量3 mL、pH 5.0條件下，對4 g/mL高嶺土懸濁液和24 g/L 1%氯化鈣溶液混合液的絮凝率最高為96.66%。昝繼清等[25]篩選出的絮凝劑產(chǎn)生菌JX18，在最適培養(yǎng)條件下，對高嶺土懸濁液的絮凝活性達到84%；李娜等[26]篩選分離得到菌株G1-3對高嶺土懸濁液的絮凝率可達93.06%；武曉暢等[27]研究了培養(yǎng)條件對絮凝效果的影響，篩選鑒定出菌株P(guān)Y-M3在最佳絮凝條件下絮凝率為96%。數(shù)據(jù)分析表明，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，菌株BacillusvallismortisZ11的絮凝活性在已報道菌株中處于較高水平，以該菌株培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，對其他死谷芽孢桿菌進行絮凝條件優(yōu)化，從而為獲得活性污泥高效處理菌株提供條件。

經(jīng)形態(tài)、生理生化特性和16S rRNA序列分析，菌株Z11初步鑒定為死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)。通過對菌株BacillusvallismortisZ11的絮凝特性研究，分析絮凝菌株添加量、pH、Ca2+和溫度等在培養(yǎng)過程對菌株的影響，為后續(xù)探究最佳發(fā)酵條件提供理論參考。由于發(fā)酵條件不成熟，絮凝效果不穩(wěn)定，且培養(yǎng)費用較高等缺點，MBF還未得到廣泛的應(yīng)用和生產(chǎn)，因此對于影響絮凝劑產(chǎn)生菌生長代謝的因素還需開展更深入的研究。同時，尋找絮凝效果更加穩(wěn)定的菌株，并優(yōu)化菌株的培養(yǎng)條件，對MBF的工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。