響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡根總黃酮的提取工藝①

王文婷， 肖慧敏， 馮 凡， 韓方凱， 封其虎

(宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000)

0 引 言

牛蒡在我國(guó)主要分布于東北、西北、安徽、浙江等地，在醫(yī)學(xué)上有廣泛應(yīng)用，具有治療感冒、頭痛、咳嗽等疾病的作用[1]。牛蒡除了可以藥用，還能夠作為保健食品，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，富含礦物元素和氨基酸，因此被人們稱為蔬菜之王[2]。近年來(lái)，在功能性食品需求量不斷增加的環(huán)境下，人們對(duì)藥食性動(dòng)植物的研究范圍不斷擴(kuò)大，而兼具藥用性和食用性的牛蒡根也得到研究人員的重視[3]。牛蒡根是牛蒡的根部，在日常生活中，牛蒡根被作為保健蔬菜，具有降血糖、抗衰老、提高免疫力等作用[3-5]。目前，有關(guān)牛蒡根的研究也越來(lái)越多，發(fā)現(xiàn)牛蒡根中含有黃酮類、多糖類等活性成分，具有較高的自由基清除力，能夠抗氧化，同時(shí)有抑菌、消炎的作用，進(jìn)一步提高了其藥用價(jià)值[4-6]。采用冷凝回流法提取牛蒡根中的總黃酮，為得到最佳提取工藝，以響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，為系統(tǒng)開(kāi)發(fā)牛蒡根中的活性成分并提高其應(yīng)用價(jià)值提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑

牛蒡根：市售，新鮮，無(wú)破損及病蟲(chóng)害。

NaNO2,Al(NO3)3,NaOH，CH3CH2OH等(西隴化工，均為分析純)。

1.2 主要儀器、設(shè)備

ME-T分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；RE-5000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(耀特儀器設(shè)備(上海)有限公司)；JYS-M01型粉碎研磨機(jī)(九陽(yáng)股份有限公司)；DHG-9245A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(一恒科學(xué)儀器(上海)有限公司)；UV-5300型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(元析儀器(上海)有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型真空泵(鞏義予華儀器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛蒡根總黃酮提取工藝

原料預(yù)處理：牛蒡根清洗、瀝干，切成小片，60℃烘干，粉碎以備用。

提?。簻?zhǔn)確稱量4 g牛蒡根粉，加入適量一定濃度的乙醇溶液，將水浴鍋調(diào)至一定的溫度，冷凝回流提取一定的時(shí)間，待提取完成后抽濾，收集濾液，濃縮后溶解、定容，得牛蒡根總黃酮提取液[7]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在各單因素試驗(yàn)中，分別準(zhǔn)確稱量6份牛蒡根粉4 g，置于圓底燒瓶中。設(shè)定料液比(g/mL)1:10，在90℃進(jìn)行冷凝回流提取2.5h，探究分析不同乙醇溶液濃度(30%,40%,50%,60%,70%,80%)對(duì)總黃酮提取效果的影響；設(shè)定料液比1:10、乙醇溶液濃度40%，進(jìn)行冷凝回流提取2.5h，探究分析不同提取溫度(50℃,60℃,70℃,80℃,90℃,100℃)對(duì)總黃酮提取效果的影響；設(shè)定乙醇溶液濃度40%，在90℃進(jìn)行冷凝回流提取2.5h，探究分析不同料液比(1:5,1:10,1:20,1:30,1:40,1:50)對(duì)總黃酮提取效果的影響；設(shè)定料液比1:10、乙醇溶液濃度40%，在90℃進(jìn)行冷凝回流提取，探究分析不同提取時(shí)間(1 h,1.5 h,2 h,2.5 h,3 h,3.5 h)對(duì)總黃酮提取效果的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到最佳提取條件。由于料液比對(duì)總黃酮提取效果無(wú)顯著影響，故選擇另外三個(gè)因素：提取溫度、乙醇溶液濃度、提取時(shí)間作為考察條件，以黃酮提取率作為響應(yīng)值進(jìn)行分析[7-9]。試驗(yàn)因素及水平如表1。

表1 試驗(yàn)因素水平

1.3.4 牛蒡根總黃酮提取率的測(cè)定

1.3.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定[8,9]。以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)x，吸光度值為縱坐標(biāo)y，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

y=10.441x+0.0047(R2=0.9994)。

1.3.4.2 樣液總黃酮濃度的測(cè)定

將上述提取液稀釋10倍，準(zhǔn)確移取1 mL于25 mL容量瓶中，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制步驟進(jìn)行操作，測(cè)得吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所測(cè)定的稀釋后樣液的牛蒡根總黃酮濃度。

1.3.4.3 總黃酮提取率的計(jì)算

式中，X：總黃酮提取率(mg/g)；M：稱取的牛蒡根粉樣品質(zhì)量(g)；c：稀釋后樣液總黃酮濃度(mg/mL)；V：牛蒡根粉樣品提取液總體積(mL)；n：稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 乙醇溶液濃度對(duì)牛蒡根總黃酮提取的影響

由圖1可見(jiàn)，當(dāng)乙醇溶液濃度在30%-40%范圍時(shí)，牛蒡根總黃酮的提取率隨濃度增大而不斷升高，濃度高于40%時(shí)，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榕］蚋悬S酮類化合物主要以黃酮苷的形式存在，而較低濃度的乙醇溶液適合黃酮苷的提取，較高濃度的乙醇溶液適合黃酮苷元的提取[10]。因此，牛蒡根總黃酮提取的最佳乙醇溶液濃度為40%。

圖1 乙醇溶液濃度對(duì)牛蒡根總黃酮提取的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)牛蒡根總黃酮提取的影響

由圖2可見(jiàn)，溫度處于50℃-90℃范圍時(shí)，牛蒡根總黃酮提取率隨溫度上升而不斷增加，當(dāng)溫度在90℃時(shí)，提取效果最好，當(dāng)溫度繼續(xù)上升至100℃時(shí)，提取率有所降低，提取效果受到抑制?？赡艿脑蚴禽^低溫度時(shí)，升高溫度利于分子擴(kuò)散從而提高黃酮類物質(zhì)的溶解，但到達(dá)90℃后繼續(xù)使溫度升高，高溫會(huì)導(dǎo)致其穩(wěn)定性有所下降，結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生分解，造成提取率下降[11]。因此，牛蒡根總黃酮最佳的提取溫度為90℃。

圖2 提取溫度對(duì)牛蒡根總黃酮提取的影響

2.1.3 料液比對(duì)牛蒡根總黃酮提取的影響

由圖3可見(jiàn)，牛蒡根總黃酮提取率隨提取劑的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但在一定范圍內(nèi)，料液比對(duì)提取率并無(wú)太大影響，總體影響效果不明顯。在料液比為1:10時(shí)，牛蒡根總黃酮提取率達(dá)最大值，因此選擇該比例為最佳料液比，且在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中不將該因素列為操作條件進(jìn)行研究。

圖3 料液比對(duì)牛蒡根總黃酮提取的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)牛蒡根總黃酮提取的影響

由圖4可見(jiàn)，當(dāng)提取時(shí)間在1.0h-2.5h范圍內(nèi)時(shí)，牛蒡根總黃酮提取率隨時(shí)間增加而升高，且在2.0h-2.5h范圍內(nèi)上升非常明顯，但當(dāng)時(shí)間超過(guò)2.5 h后，提取率在一定的范圍內(nèi)維持穩(wěn)定，說(shuō)明已經(jīng)提取完全，時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)對(duì)提取影響不明顯[9]。因此，牛蒡根總黃酮最佳的提取時(shí)間為2.5 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)牛蒡根總黃酮提取的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 回歸模型分析

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)和結(jié)果如表2所示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到Y(jié)(黃酮提取率)對(duì)A(乙醇溶液濃度)、B(提取溫度)、C(提取時(shí)間)的二次多項(xiàng)式回歸模型：Y=5.67-0.030A-0.074B+0.21C+0.075AB-0.055AC+0.17BC-0.39A2-0.57B2-0.39C2。將回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)整體模型P值小于0.0002(具有極顯著差異)，失擬項(xiàng)P值為0.2686(不具有顯著差異)，說(shuō)明方程對(duì)試驗(yàn)有較好的擬合性。此外，提取時(shí)間(C)對(duì)牛蒡根總黃酮提取率有極顯著的影響，提取溫度(B)與提取時(shí)間(C)的交互作用對(duì)牛蒡根總黃酮提取率的影響顯著，各因素的二項(xiàng)式影響均極顯著。從數(shù)據(jù)得出R2=0.9682，說(shuō)明Y的變化有96.82%與A、B、C有關(guān)，擬合度較好?；貧w方程能夠較好地描述響應(yīng)面值因素之間的關(guān)系，該試驗(yàn)方法可靠[12]。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)和結(jié)果

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面分析

通過(guò)試驗(yàn)分析得到不同因素交互作用對(duì)牛蒡根總黃酮提取影響的響應(yīng)面三維圖，如圖 5 所示。曲面比較彎曲陡峭代表操作條件對(duì)Y值影響很大；曲面相對(duì)平緩代表操作條件對(duì)Y值影響偏小[12,13]。因此，不同因素交互作用對(duì)提取率影響程度為：提取溫度(B)與提取時(shí)間(C)交互作用>乙醇溶液濃度(A)與提取溫度(B)交互作用>乙醇溶液濃度(A)與提取時(shí)間(C)交互作用。同時(shí)，三個(gè)因素對(duì)牛蒡根總黃酮提取率的影響程度為：提取時(shí)間(C)>提取溫度(B)>乙醇溶液濃度(A)。這與回歸模型方差分析結(jié)果吻合。通過(guò)響應(yīng)面分析，預(yù)測(cè)得到最佳的提取牛蒡根總黃酮的工藝為料液比1:10、乙醇溶液濃度39%的條件下，在溫度 88℃提取2.6 h，此時(shí)提取率為5.903 mg/g。于最佳工藝條件下提取牛蒡根總黃酮，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得提取率為5.914 mg/g，符合預(yù)期值。

圖5 不同因素交互作用對(duì)牛蒡根總黃酮提取影響的響應(yīng)面三維圖

3 結(jié) 論

通過(guò)冷凝回流法，采用單因素與響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到牛蒡根總黃酮提取的最佳工藝：料液比(g/mL)1:10、乙醇溶液濃度39%、提取溫度88℃、提取時(shí)間2.6 h，牛蒡根總黃酮提取率達(dá)5.914 mg/g。這為牛蒡根中活性成分黃酮類化合物的提取與利用提供了理論依據(jù)，對(duì)其相關(guān)性質(zhì)的研究也有待更深入的探索。