von-Hippel Lindau基因同義突變導(dǎo)致家族性嗜鉻細(xì)胞瘤

馬曉森，張學(xué)斌，周 颋，崔云英，童安莉*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科； 2.泌尿外科， 北京 100730)

家族遺傳性嗜鉻細(xì)胞瘤/副神經(jīng)節(jié)瘤(pheochromocytoma/paraganglioma, PPGL)占嗜鉻細(xì)胞瘤的35%～40%，其發(fā)病與致病基因的胚系突變有關(guān)，包括VHL、RET、SDHB、SDHC和SDHD等20余種致病基因。VHL基因突變除導(dǎo)致家族性嗜鉻細(xì)胞瘤外，臨床上患者還可出現(xiàn)其他多種良惡性腫瘤或囊腫，包括：中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜血管母細(xì)胞瘤、腎透明細(xì)胞癌或腎囊腫、嗜鉻細(xì)胞瘤、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤或胰腺囊腫或囊腺瘤、內(nèi)淋巴囊腫瘤等[1]。由VHL基因突變導(dǎo)致的上述疾病稱為von Hippel-Lindau (VHL) 病。VHL病為常染色體顯性遺傳，患病率約為1/36 000[1]。嗜鉻細(xì)胞瘤在VHL病患者中發(fā)病率為10%～34%，常為VHL基因錯義突變、無義突變、移碼突變和大片段缺失。而同義突變僅在數(shù)個家系中進(jìn)行報道[2-4]。本研究報道1個罕見的VHL同義突變導(dǎo)致的家族性嗜鉻細(xì)胞瘤的家系，并探討該突變在嗜鉻細(xì)胞瘤中的發(fā)生頻率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象：先證者為2018年在北京協(xié)和醫(yī)院診治的1例雙側(cè)嗜鉻細(xì)胞瘤患者，收集患者及其家系成員的臨床資料及外周血。本研究獲得北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(S-K431)，獲得了患者及其家屬同意并簽署知情同意書。

1.1.2 試劑盒：取先證者及其家系成員的外周血，采用Blood DNA Midi Kit (Omega Bio-Tek)提取外周血DNA。

1.2 方法

1.2.1 二代測序：將先證者外周血DNA送天津諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行建庫及全外顯子測序(Illumina HiSeq PE150測序儀)，并對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用的過濾條件如下:1) 保留測序深度>10乘位點；2) 保留千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫人群等位基因頻率<1 %或沒有注釋的位點；3) 保留外顯子和剪切位點；4) 保留在“Clinvar”顯示為“Pathogenic”的位點。

1.2.2 一代驗證：針對二代測序發(fā)現(xiàn)的致病突變，采用Primer 5軟件設(shè)計引物，使用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增相應(yīng)外顯子。擴增產(chǎn)物純化后，使用熒光自動測序儀(ABI3700)直接測序。

1.2.3VHL同義突變在PPGL中發(fā)生頻率：為明確致病突變在PPGL中的發(fā)生頻率，在另外的107例PPGL隊列中篩查是否存在該位點的胚系變異(這些樣本進(jìn)行了二代測序)。

2 結(jié)果

2.1 先證者及其家系成員的臨床特點

先證者(Ⅳ：1，圖1)，男，15歲，因“陣發(fā)性心悸、大汗3月，發(fā)現(xiàn)雙側(cè)腎上腺占位2月”，于2018年1月就診于北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科?；颊哂诨顒雍蟪霈F(xiàn)發(fā)作性心悸、大汗，伴惡心和嘔吐、面色蒼白，發(fā)作時測血壓最高達(dá)180/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。入院檢查：臥位血壓：148/90 mmHg, 心率：82 beats/min；立位血壓：125/85 mmHg,心率：139 beats/min，雙下肢無水腫，四肢末端皮溫偏涼。輔助檢查：檢測24 h尿兒茶酚胺顯示去甲腎上腺素明顯升高(表1)，腎上腺增強CT顯示雙側(cè)腎上腺占位(右側(cè)占位5.1 cm×6 cm，左側(cè)占位2.2 cm×3.8 cm)，腎上腺髓質(zhì)顯像提示雙腎上腺區(qū)占位對放射性核素攝取增高(圖2)，奧曲肽顯像僅顯示右腎上腺占位輕度放射性核素攝取，左腎上腺占位無明顯攝取?；颊邿o其他VHL病相關(guān)的臨床表現(xiàn)及陽性檢查結(jié)果?；颊呓?jīng)過酚芐明術(shù)前準(zhǔn)備后，于全麻下行腹腔鏡雙腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤切除術(shù)。術(shù)后病理符合雙腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，免疫組化染色：Ki-67(index2%)，CgA(+)，S-100(支持細(xì)胞+)，α-inhibin(-)，Melan-A(-)，AE1/AE3(-)，SDHB(+)。術(shù)后患者發(fā)作性心悸、大汗等癥狀消失，血壓正常，復(fù)查24 h尿兒茶酚胺恢復(fù)到正常范圍內(nèi)。

先證者姑姥姥(Ⅱ：5)于42歲診斷“右側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤”，已行手術(shù)治療，術(shù)后15年無復(fù)發(fā)(表1)，無其他VHL病相關(guān)的臨床表現(xiàn)。否認(rèn)其他家族成員患高血壓或其他腫瘤。

圖1 VHL基因測序Fig 1 Sanger sequencing of VHL gene

圖2 VHL病家系的家系圖Fig 2 Pedigree of the family with VHL disease

2.2 先證者及其及家系成員的突變位點確認(rèn)

先證者(Ⅳ：1)在VHL基因第二號外顯子存在同義突變(c.414A>G，p.Pro138Pro，NM_000551.3)，該突變在ClinVar數(shù)據(jù)庫中顯示為“致病性”，且在多個人群正常參考數(shù)據(jù)庫中沒有該位點的記錄。該突變位點通過一代測序驗證進(jìn)行了確認(rèn)(圖3)。

共獲得5例家系成員的胚系DNA，進(jìn)行VHL基因第二號外顯子的擴增及測序，結(jié)果顯示，先證者母親(Ⅲ:4)和妹妹(Ⅳ:2)均攜帶有該變異位點。檢測這2例突變攜帶者的血漿甲氧基腎上腺素和甲氧基去甲腎上腺素，結(jié)果均在正常范圍。

2.3 107例PPGL中該VHL同義突變的發(fā)生頻率

在另外107例PPGL隊列中僅發(fā)現(xiàn)1例患者攜帶有相同突變位點(c.414A>G，p.Pro138Pro)。該患者出現(xiàn)右側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，患者平時血壓130/90 mmHg，無明顯頭痛、心悸、大汗等不適，檢測24 h尿兒茶酚胺在正常范圍，具體臨床特點見表1。

3 討論

VHL為抑癌基因， 編碼的VHL蛋白， 通過與低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF)的結(jié)合使其降解，VHL突變后使VHL蛋白功能下降，則HIF-1α和HIF-2α降解減少，它們作為轉(zhuǎn)錄因子，促使血管內(nèi)皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素和其他生長因子水平升高，從而刺激腫瘤生長。VHL基因編碼產(chǎn)生兩種不同長度的轉(zhuǎn)錄本：全長轉(zhuǎn)錄本包括外顯子1、2和3(NM_000551.3)。而較短轉(zhuǎn)錄本僅包括外顯子1和3(NM_198156.2)，已知VHL蛋白與HIF結(jié)合域大部分由外顯子2編碼產(chǎn)生，因此預(yù)計較短轉(zhuǎn)錄本不會產(chǎn)生腫瘤抑制作用[5-6]。目前國外僅在8個家系[3-4,7]中檢測到VHL基因同義突變(均為c.414A>G，p.Pro138Pro)，功能學(xué)研究顯示，該突變引起VHL剪切的改變，產(chǎn)生不包含外顯子2的較短轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而引起HIF累積，激活缺氧信號通路。由此看來，盡管同義突變因不改變氨基酸序列而被認(rèn)為是沉默的突變，但仍然可以通過改變剪切位點而致病[8-10]。

A.computer tomography; B.131I-metaiodoenzylguanidine scintigraphy; C.99mTc-octreotide scintigraphy圖3 先證者的影像學(xué)表現(xiàn)Fig 3 Radiological findings of the proband

clinical featuresⅣ:1Ⅱ:5another case with VHLsynonymous mutation?age at onset/year154136duration/month3122highest blood pressure/mmHg180/90165/100146/90symptomspalpitation,profusesweatingnono24 h urinary catecholamine before/after operation/(μg/24 h) norepinephrine(16.69-40.65)549.64/24.21-24.64/- epinephrine(1.74-6.42)2.89/1.95-2.99/ - dopamine(120.93-330.59)280.15/181.55-226.23/ -MN(s) after operation/(nmol/L) normetanephrine(<0.9)-0.37- metanephrine (<0.5)-0.03-locationbilateral PCCright PCCright PCCtumor size/cmleft:3.0right:10.06.03.5follow up/year1152metastasisnononopresent blood pressurenormalnormalnormalfamily historyyesyesnoother clinical manifestations nonono

攜帶有該同義突變位點的VHL病患者，其嗜鉻細(xì)胞瘤臨床表現(xiàn)與VHL錯義突變引起的嗜鉻細(xì)胞瘤相似[11-12]：以去甲腎上腺素分泌為主、腫瘤常為多發(fā)性、很少惡變。對患者家系的隨訪，沒有發(fā)現(xiàn)除嗜鉻細(xì)胞瘤以外的VHL病相關(guān)臨床表現(xiàn)，但是國外報道攜帶有此突變位點的患者中，除嗜鉻細(xì)胞瘤外，還有脊髓和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的臨床表現(xiàn)[2-4]，這提示要對患者及其家系中突變攜帶者進(jìn)行隨訪以及必要的檢查，以早期發(fā)現(xiàn)可能的相關(guān)臨床表現(xiàn)。

本文首次報道中國人中VHL同義突變引起VHL病的家系，該突變在PPGL隊列中的發(fā)生頻率約為1%。在解讀VHL測序結(jié)果時要關(guān)注VHL同義突變致病的可能性，以免漏診。