自噬在CaSR介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549遷移中的作用

劉佳龍，李春臨，李光偉

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

肺癌(lung canser)在全國(guó)惡性腫瘤發(fā)病中列首位，是影響人類健康的重要?dú)⑹?，非小?xì)胞肺癌(non-small-cell carcinoma，NSCLC) 是其最常見的類型[1]，多數(shù)病例在診斷時(shí)已處于晚期，導(dǎo)致其5年生存率低，且肺癌患者發(fā)病率處逐年上升趨勢(shì)[2]，但其具體機(jī)制不詳。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)是廣泛存在于細(xì)胞膜上一種G蛋白偶聯(lián)受體, 其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]，但在肺癌中關(guān)于CaSR與自噬及轉(zhuǎn)移的關(guān)系鮮有報(bào)道。惡性腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境中存在低氧，且低氧可以活化多種細(xì)胞的CaSR。通過前期對(duì)臨床肺癌組織標(biāo)本探究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌和鱗癌的組織中均有CaSR蛋白的表達(dá)，CaSR可上調(diào)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲過程[4]，同時(shí)CaSR的表達(dá)與細(xì)胞自噬具有一定相關(guān)性，自噬在CaSR介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移中是否起作用，目前尚不十分清楚。為探究其具體機(jī)制，本課題以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對(duì)象，進(jìn)行以下研究，以期為臨床肺癌治療研發(fā)潛在引導(dǎo)方案、開創(chuàng)新的藥物靶向作用點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象：人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(non-small-cell carcinoma cell line)A549(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.1.2 主要試劑：氯化釓 (gadlinium chloride,GdCl3)、NPS2390、CaSR鼠源單克隆抗體、重組人自噬效應(yīng)蛋白(Beclin-1)鼠源單克隆抗體、HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗(Santa Cluz公司)；3-甲基腺嘌呤自噬抑制劑(3-methyladenine,3-MA)(Sigma-Aldrich公司)；胎牛血清血清(杭州四季青生物科技有限公司)；BCA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Transwell小室 (Corning 公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：將細(xì)胞分為：對(duì)照組(control，N)；低氧組(H)：三氣培養(yǎng)箱(93% N2、2% O2、5% CO2)培養(yǎng)24 h；GdCl3(CaSR激動(dòng)劑，Gd)干預(yù)組(H+Gd)：加入GdCl3(30 μmol/L)；NPS2390(CaSR抑制劑,NPS)干預(yù)組(H+NPS): 加入NPS2390(10 μmol/L)；3-MA干預(yù)組(H+Gd+3-MA)：加入3-MA(30 μmol/L)和GdCl3(30 μmol/L)，均置于三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。

1.2.2 Western blot檢測(cè)Beclin-1 和CaSR表達(dá)水平：刮取細(xì)胞分別加入蛋白裂解液及PMSF，冰上孵育30 min，超聲波裂解細(xì)胞，4 ℃ 12 000 r/min離心 15 min，取上清進(jìn)行蛋白定量。取30 μg樣品，10% SDS-PAGE，300 mA轉(zhuǎn)膜90 min，封閉2 h；Ⅰ抗分別為anti-CaSR (1∶500)，anti-β-actin(1∶500)，anti-Beclin-1 (1∶500) 4 ℃過夜。洗膜后，堿性磷酸酶標(biāo)記IgG 二抗室溫孵育2 h，發(fā)光，掃描半定量分析顯影條帶。

1.2.3 Wound healing實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移：取2塊6孔板, 用marker筆在板的背面水平劃線, 每隔0.5 cm標(biāo)記1次, 橫穿孔徑, 每孔至少5條線穿過。每孔加入約5×105個(gè)A549細(xì)胞, 以過夜能鋪滿整孔為標(biāo)準(zhǔn), 細(xì)胞貼壁后去血清培養(yǎng)24 h。次日用200 μL移液器頭垂直于背側(cè)線進(jìn)行劃痕。PBS洗滌3次, 去除移液器頭劃下細(xì)胞, 1號(hào)板置于正常培養(yǎng)箱內(nèi),2號(hào)板置于三氣培養(yǎng)箱內(nèi), 分別培養(yǎng)24 h。進(jìn)行取樣拍照[3]。應(yīng)用Image J軟件分析分別檢測(cè)各組細(xì)胞0 和24 h的細(xì)胞劃痕面積, 傷口愈合百分比=(0 h的劃痕面積-24 h的劃痕面積)/0 h的劃痕面積×100%。

1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：按基質(zhì)膠∶DMEM=1∶29比例稀釋基質(zhì)膠后鋪入上室。分別離心各組細(xì)胞，用去血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞懸液至1.0×105個(gè)/mL接種于上室，加去血清培養(yǎng)基，按照分組情況分別于上室內(nèi)加藥，將含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基800 μL加入下室，置于常氧及三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；取出上室, 用棉簽擦拭去未轉(zhuǎn)移細(xì)胞, PBS洗滌2次，甲醇固定上室細(xì)胞20 min，PBS洗滌，適當(dāng)風(fēng)干，0.5%的結(jié)晶紫進(jìn)行細(xì)胞染色20 min, PBS洗滌, 風(fēng)干。倒置顯微鏡下隨機(jī)抽取5個(gè)不同視野, 拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同組CaSR表達(dá)水平

低氧組CaSR的表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，激動(dòng)劑組CaSR表達(dá)進(jìn)一步增加(P<0.05)，抑制劑組CaSR表達(dá)有所下降(P<0.05)(圖1)。

2.2 不同處理對(duì)Beclin-1 表達(dá)水平產(chǎn)生影響

低氧組較對(duì)照組比較Beclin-1 的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，低氧基礎(chǔ)上CaSR激動(dòng)劑使Beclin-1 表達(dá)進(jìn)一步下降(P<0.05)，CaSR抑制劑組使Beclin-1表達(dá)升高(P<0.05)，3-MA組使Beclin-1 表達(dá)降低(P<0.05)(圖2)。

2.3 不同處理對(duì)細(xì)胞遷移的影響

低氧組細(xì)胞劃痕間傷口愈合距離百分比明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，H+Gd細(xì)胞劃痕間傷口愈合距離百分比進(jìn)一步上升(P<0.05)，H+NPS細(xì)胞劃痕間傷口愈合距離百分比明顯下降(P<0.05)，3-MA組細(xì)胞劃痕間傷口愈合距離百分比進(jìn)一步提高(P<0.05)(圖3)。

2.4 不同處理?xiàng)l件對(duì)細(xì)胞趨化、侵襲的影響

低氧組細(xì)胞穿膜數(shù)量高于對(duì)照組(P<0.05)：CaSR激動(dòng)劑組細(xì)胞穿膜數(shù)量上升(P<0.05)，抑制劑組穿膜數(shù)量下降(P<0.05)，與H+Gd組比較3-MA自噬通路抑制劑組穿膜數(shù)量有所增高(P<0.05)(圖4)。

3 討論

近年來(lái)肺癌發(fā)病率不斷升高,目前治療手段仍以手術(shù)治療、放化療、靶向治療為主，其五年生存率為4%～17%[6]，晚期肺癌患者常常失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。肺癌治療研究相關(guān)報(bào)道較多，《美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)臨床實(shí)踐指南更新》提出由單方面因素對(duì)癥治療逐漸形成綜合系統(tǒng)性治療方案[7]。但晚期治療方式依舊處于基礎(chǔ)階段，肺癌的發(fā)生機(jī)制仍不明確。

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with H+Gd group;△P<0.05 compared with H group圖1 Western blot 檢測(cè)CaSR蛋白表達(dá)水平Fig 1 Protein expression relative level of CaSR determined by Western

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with H+Gd group;△P<0.05 compared with H group圖2 Western blot檢測(cè)Beclin-1 蛋白表達(dá)水平Fig 2 Protein expression relative level of Beclin-1 determined by Western

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H+Gd group;△P<0.05 compared with H group圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞劃痕傷口愈合Fig 3 Wound closure was observed by wound healing in A549 cells (scale bar=50 μm)

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H+Gd group;△P<0.05 compared with H group圖4 Transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞穿膜數(shù)量Fig 4 Number of invaded under different conditions by Transwell (scale bar=50 μm)

CaSR是一種人體廣泛表達(dá)的同型二聚體G蛋白偶聯(lián)受體，其功能除維持Ca2+和其他金屬離子的穩(wěn)態(tài)及調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素的釋放外，與細(xì)胞的分化、遷移，大腦發(fā)育、干細(xì)胞移植、傷口愈合以及腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，CaSR在侵襲轉(zhuǎn)移性腫瘤中的高表達(dá)被認(rèn)為是預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移的一種新的潛在預(yù)后標(biāo)志物[8]。

低氧是實(shí)體腫瘤普遍存在的微環(huán)境。低氧可以活化多種細(xì)胞的CaSR，在海馬神經(jīng)元、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、人氣道上皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞中均存在CaSR且在低氧狀態(tài)下表達(dá)量升高[4,9-11]。非小細(xì)胞肺癌是肺癌的常見類型，前期通過對(duì)臨床肺癌組織標(biāo)本的調(diào)研發(fā)現(xiàn)：在非小細(xì)胞肺癌組織中存在CaSR的表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤TNM分期呈正相關(guān)趨勢(shì)，提示CaSR的表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移侵襲有關(guān)[12]。本研究結(jié)果亦顯示低氧能夠增加A549細(xì)胞CaSR的表達(dá)。

以自噬為研究對(duì)象提出創(chuàng)新的治療策略，能夠改善包括癌在內(nèi)的不同疾病的治療方案[13]。本研究結(jié)果顯示，自噬效應(yīng)蛋白(Beclin-1)的表達(dá)變化與CaSR的表達(dá)趨勢(shì)恰恰相反，而自噬通路抑制劑組Beclin-1表達(dá)明顯降低。因此，推測(cè)A549細(xì)胞中的CaSR可能通過抑制自噬的發(fā)生，引起細(xì)胞其他的生物學(xué)行為發(fā)生改變。

細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步提示：低氧活化的CaSR在某種程度上抑制了細(xì)胞自噬的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲過程，通過多機(jī)制間相互作用達(dá)到協(xié)同目標(biāo)。細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲現(xiàn)象隨著細(xì)胞內(nèi)CaSR的表達(dá)程度而同步變化，3-MA抑制劑阻斷了細(xì)胞自噬發(fā)生，細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移指標(biāo)也相應(yīng)上調(diào)。文獻(xiàn)報(bào)道，CaSR介導(dǎo)的整合素激活能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移活動(dòng)[8,10]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究表明：低氧條件下活化的CaSR抑制了A549細(xì)胞自噬的發(fā)生在某種程度上促進(jìn)了細(xì)胞遷移、侵襲過程。

綜上所述，低氧活化的CaSR介導(dǎo)細(xì)胞自噬過程促進(jìn)了A549的轉(zhuǎn)移與侵襲，但更多詳細(xì)機(jī)制仍有待闡明，本研究為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療方向提供了新思路與新靶點(diǎn)。