基于表觀遺傳學(xué)探討針灸緩解內(nèi)臟高敏感的可能機(jī)制＊

郭 靜，裴麗霞，宋亞芳，孫建華

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南京 210029）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種以腹痛及排便習(xí)慣改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的功能性腸病[1]。內(nèi)臟高敏感是IBS重要的發(fā)病機(jī)制，主要表現(xiàn)為內(nèi)臟痛覺過敏、感覺異常，在接受擴(kuò)張刺激時，結(jié)直腸的容積和壓力閾值均明顯降低[2]。內(nèi)臟高敏感的機(jī)制尚不清楚，可能與結(jié)腸傷害性刺激輸入、腸道通透性增加、腸神經(jīng)內(nèi)分泌活動改變等有關(guān)[3,4]。近年來，日趨增多的證據(jù)表明，表觀遺傳修飾在慢性內(nèi)臟疼痛的致敏和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5,6]。臨床研究表明針灸治療IBS 安全有效[7]，動物實驗顯示針灸可以緩解IBS 內(nèi)臟高敏感[8,9]。針灸緩解內(nèi)臟高敏感的機(jī)制復(fù)雜，表觀遺傳修飾可能參與其中。

1 表觀遺傳學(xué)的定義與基本內(nèi)容

表觀遺傳學(xué)是指由發(fā)育或環(huán)境因素引起的，在沒有DNA 序列改變的情況下，基因功能發(fā)生穩(wěn)定的、可遺傳的改變。其基本內(nèi)容包括：DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控、染色質(zhì)重塑等[10-14]。DNA甲基化是指在DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化作用下，將甲基基團(tuán)與DNA 的CpG 二核苷酸的胞嘧啶核苷共價結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)[15]。組蛋白修飾包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、糖基化等，通過影響組蛋白與DNA 的親和性從而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)[16]。組蛋白修飾不僅可以直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，還可以影響DNA的修復(fù)與復(fù)制、細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期等[12]。非編碼RNA 包括長鏈非編碼RNA 和短鏈非編碼RNA，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控[17,18]。同時，非編碼RNA 能夠參與DNA 甲基化、組蛋白修飾等環(huán)節(jié)，引起基因的沉默或上調(diào)[13]。

2 表觀遺傳學(xué)與內(nèi)臟高敏感

2.1 DNA甲基化與內(nèi)臟高敏感

中樞致敏是IBS 患者內(nèi)臟高敏感重要原因之一，應(yīng)激引起的下丘腦- 垂體- 腎上腺皮質(zhì)軸（hypothalamic-pituitary adrenal，HPA）激活在其中扮演重要角色[5]。近年來一些研究顯示DNA甲基化參與調(diào)節(jié)應(yīng)激誘發(fā)的內(nèi)臟高敏感。反復(fù)避水應(yīng)激（water avoidance stress，WAS）可以引起嚙齒類動物內(nèi)臟疼痛，是常用的IBS 內(nèi)臟高敏感的模型[19,20]。一項研究結(jié)果表明，WAS 應(yīng)激大鼠表現(xiàn)出內(nèi)臟敏感性增加，杏仁核中糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）基因的甲基化增加而促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotropin releasing factor，CRF）啟動子的甲基化減少，伴隨著GR mRNA 的表達(dá)減少而CRF mRNA 表達(dá)增加。而在腦室中注入組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑曲古抑菌素A 可顯著緩解WAS 引起的內(nèi)臟超敏反應(yīng)[21]。早期生活應(yīng)激的母嬰分離模型同樣可以使HPA 軸活化，CRF 的表達(dá)增加[5]。在另一項研究表明，母嬰分離引起的HPA 軸活化與CRF 啟動子低甲基化有關(guān)，并增強(qiáng)了成年后CRF 對應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[22]。針灸可以減少腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）患者及模型大鼠血清及下丘腦中CRF 的表達(dá)，減輕內(nèi)臟高敏感癥狀[23,24]。目前，針灸調(diào)控CRF 的上游機(jī)制尚未闡明，針灸是否可以通過降低CRF啟動子DNA甲基化水平，調(diào)節(jié)HPA 軸從而緩解內(nèi)臟高敏感有待進(jìn)一步證明。

此外，表觀遺傳在應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)臟超敏反應(yīng)外周機(jī)制中同樣發(fā)揮作用。WAS 大鼠L6-S2 背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）中糖皮質(zhì)激素受體基因（nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1；NR3C1）啟動子的甲基化增加，下調(diào)了NR3C1 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。DNMT1 相關(guān)的大麻素1 型受體基因（cannabinoid receptor 1 gene，CNR1）啟動子甲基化上調(diào)，同時由NR3C1 介導(dǎo)的CNR1 表達(dá)下調(diào)。敲低大鼠L6-S2 DRG 神經(jīng)元中的DNMT1 可以減少CNR1 啟動子甲基化，并降低慢性應(yīng)激引起的內(nèi)臟痛[25]。內(nèi)源性大麻素受體廣泛分布于痛覺的傳導(dǎo)通路中，同時參與了針刺誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用[26,27]。針刺發(fā)揮減輕內(nèi)臟高敏感是否通過調(diào)節(jié)CNR1 啟動子的甲基化水平有待考證。

針灸調(diào)控DNA 甲基化緩解IBS 內(nèi)臟高敏感尚處于空白階段，但我們可以從針灸在其他疾病關(guān)于DNA甲基化機(jī)制的探索中找尋依據(jù)。電針大腸俞募穴干預(yù)慢性傳輸型便秘大鼠后發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸組織中膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）啟動子區(qū)的 CpG 水平增加，甲基化水平降低，影響了GDNF 的基因轉(zhuǎn)錄水平[28]。研究發(fā)現(xiàn)，IBS 結(jié)腸和脊髓組織中GDNF 高表達(dá)，艾灸可以降低GDNF 及 GDNF 家族受體α3 的表達(dá)[29]。艾灸是否通過調(diào)節(jié)GDNF 啟動子區(qū)的甲基化水平，影響GDNF 的表達(dá)，從而發(fā)揮對IBS 的治療效應(yīng)，還有待進(jìn)一步探索。在一項電針干預(yù)多囊卵巢綜合征模型大鼠的研究中，電針降低了下丘腦中整體DNA 甲基化水平和DNMT3b 的表達(dá)。焦磷酸測序表明，電針干預(yù)后Camk2b 和 Ar 的 DNA 甲基化水平降低[30]。艾灸“足三里”穴位局部可以引起低甲基化改變，主要發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)[31]?！白闳铩笔侵委烮BS 內(nèi)臟高敏感常用選穴，我們猜測針灸可能是通過引起某些靶基因低甲基化改變從而緩解內(nèi)臟高敏感。

2.2 組蛋白修飾與內(nèi)臟高敏感

環(huán)境或慢性應(yīng)激對表觀基因組的重塑可能導(dǎo)致基因表達(dá)的長期變化。現(xiàn)有研究表明，組蛋白去乙酰化可能加重內(nèi)臟疼痛，而HDAC 抑制劑可以通過增加組蛋白乙酰化水平來減輕內(nèi)臟高敏感。中央杏仁核（central amygdala，CeA）中的表觀遺傳程序，特別是組蛋白修飾，在維持慢性焦慮和疼痛中非常重要。CeA長時間暴露于升高的皮質(zhì)類固醇（corticosteroids，CORT），通過激活GRs 和CRF 促進(jìn)長期焦慮和內(nèi)臟疼痛[32]。一項研究利用染色質(zhì)免疫沉淀實驗證實CeA 中GR 表達(dá)的降低是由于GR 啟動子處組蛋白3 賴氨酸9乙?；╤istone 3 lysine 9 acetylation，H3K9Ac）的減少所導(dǎo)致的。此外，H3K9Ac 的減少可能是由于組蛋白去乙?；窼irtuin-6的活性增加引起的。Sirtuin-6可以通過CORT 誘導(dǎo)的NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)募集到GR 啟動子區(qū)域。在CeA 內(nèi)注射HDAC 抑制劑可以通過恢復(fù)GR 啟動子上H3K9Ac 來防止GR 表達(dá)的下降，從而逆轉(zhuǎn)CORT誘導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感[33]。

組蛋白修飾在內(nèi)臟高敏感外周機(jī)制中作用的現(xiàn)有研究主要集中在組蛋白乙酰化/去乙?；瘜ο嚓P(guān)受體的調(diào)節(jié)。瞬時受體電位辣椒素受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）是 IBS 內(nèi)臟高敏感重要的外周機(jī)制之一。慢性應(yīng)激會增加L6-S2 DRG 神經(jīng)元中TRPV1 啟動子處的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶EP300 的表達(dá)，增加TRPV1 啟動子的組蛋白乙酰化，從而導(dǎo)致TRPV1的表達(dá)的增加，形成內(nèi)臟高敏感。敲低大鼠DRG 神經(jīng)元中的EP300 減少了TRPV1 啟動子的組蛋白H3 乙?；?，并預(yù)防了應(yīng)激大鼠的內(nèi)臟痛覺過敏[25]。谷氨酸是迷走神經(jīng)回路中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptor，mGluR）與內(nèi)臟高敏感密切相關(guān)[34]。在慢性應(yīng)激的大鼠模型中，HDAC 抑制劑可以增強(qiáng)脊髓中H3K9Ac、雌激素受體α與代謝型谷氨酸受體2 型基因（metabotropic glutamate receptor type 2 gene，GRM2）啟動子相同區(qū)域的結(jié)合，減輕雌激素引起的內(nèi)臟高敏感[35]。該團(tuán)隊后來進(jìn)一步研究顯示HDAC 抑制劑增加了脊髓中 H3K9Ac、H3K18Ac 與 GRM2、GRM3 啟動子上的幾個位點(diǎn)的結(jié)合，上調(diào)了mGluR2 和mGluR3 的表達(dá)，并減輕了應(yīng)激引起的內(nèi)臟超敏反應(yīng)[36]。

目前尚無針灸通過改變組蛋白修飾緩解內(nèi)臟高敏感的研究，但是朱冰梅老師團(tuán)隊首次揭示的針刺保護(hù)缺血性心肌病的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制為我們提供了很好的思路。研究表明針刺能明顯增加血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）啟動子上H3K9Ac，從而證實針刺可通過調(diào)控組蛋白H3K9Ac 水平，促進(jìn)VEGF 轉(zhuǎn)錄表達(dá)，介導(dǎo)缺血心肌血管新生，實現(xiàn)心肌保護(hù)效應(yīng)[37]。新近研究顯示，針刺百會、印堂穴可以通過下調(diào)慢性應(yīng)激模型大鼠海馬HDAC2 蛋白表達(dá)，促進(jìn)海馬組蛋白H3K3 乙?；黾幽X源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）表達(dá)，緩解大鼠的抑郁樣行為[38]。BDNF同時又與IBS 內(nèi)臟高敏感相關(guān)，前期臨床研究顯示針刺可以降低IBS-D 患者血清BDNF 水平[39]，進(jìn)一步可以探究針刺是否通過調(diào)控組蛋白修飾改變BDNF的表達(dá)，從而發(fā)揮緩解內(nèi)臟高敏感的效應(yīng)。

2.3 非編碼RNA與內(nèi)臟高敏感

2008 年 microRNA（miRNA）開始出現(xiàn)在 IBS 機(jī)制研究中。研究顯示miRNA-510 和血清素受體3E 基因共定位在IBS-D 患者的腸上皮細(xì)胞中，表明特有的miRNA 存在于 5-HT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的 IBS 患者中[40]。5-HT信號傳遞系統(tǒng)與腸道感覺密切相關(guān)，在IBS 發(fā)病中發(fā)揮重要作用。隨后多個研究報道了miRNA-24、miRNA-16、miRNA-103 和 miRNA-200a 對 5-HT 信號系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。IBS 患者和小鼠結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞中miRNA-24 表達(dá)增加。5-HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體（serotonin transporter，SERT）是miR-24 的潛在靶基因。miRNA-24抑制劑可以增加IBS小鼠近端結(jié)腸的疼痛閾值和傷害性閾值水平，降低過氧化物酶活性，并上調(diào)腸粘膜上皮細(xì)胞SERT 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平[41]。另一項研究表明，IBS-D 患者空腸中miRNA-16 和miRNA-103 表達(dá)水平降低可能導(dǎo)致5-HT4 受體活性升高，進(jìn)而引起腸道分泌和蠕動增加[42]。在IBS-D 大鼠模型中發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miRNA-200a 可以通過下調(diào)CNR1 和SERT加重IBS內(nèi)臟高敏感[43]。

據(jù)報道，IBS-D 患者血液微囊泡、小腸和結(jié)腸組織中均存在miRNA-29a 表達(dá)增加。miRNA-29a 的互補(bǔ)序列與谷氨酰胺合成酶（glutamate-ammonia ligase，GLUL）基因的 3'-UTR 結(jié)合，減少了 GLUL 的合成，從而增加腸道黏膜通透性[44]。該團(tuán)隊進(jìn)一步在IBS 患者和miRNA 基因敲除（Mir29-/-）小鼠模型中驗證miRNA-29 家族對腸道通透性的影響，研究表明miRNA-29a/b 可以通過降低閉合蛋白-1（claudin 1）和NF-κB 抑制因子的表達(dá)，增加腸道通透性[45]。在IBSD 大鼠模型中miRNA-29a 的作用機(jī)制也得到了證實，上調(diào)的miRNA-29a 可以降低水通道蛋白1（aquaporin 1，AQP1）、AQP3、AQP8 的表達(dá)，增加腸道通透性[46]。此外，一項新近研究進(jìn)一步探索了miRNA-29a 介導(dǎo)5-HT 信號系統(tǒng)在內(nèi)臟高敏感的機(jī)制作用，5-HT7 受體是miRNA-29a的直接靶標(biāo)，miRNA-29a敲除可以導(dǎo)致5-HT7受體的過表達(dá)和內(nèi)臟痛覺過敏的減弱[47]。

IBS 患者血液中循環(huán)miRNA-150 和miRNA-342-3p表達(dá)水平升高。值得注意的是，miRNA-150與腸道炎癥及疼痛密切相關(guān)，而miRNA-342-3p 則可以通過電壓門控性L型鈣離子通道α1C蛋白來進(jìn)行疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低結(jié)直腸痛閾，從而增加內(nèi)臟敏感性[48]。本團(tuán)隊前期通過篩選IBS-D 患者與健康志愿者血清miRNA 差異表達(dá)譜系，發(fā)現(xiàn)IBS-D 患者血清中miRNA-1305、miRNA-575、miRNA-149-5p、miRNA-190a-5p、miRNA-135a-5p、miRNA-148a-3p 表 達(dá) 上調(diào)，miRNA-194-5p、miRNA-127-5p 表達(dá)下調(diào)。針刺可以下調(diào)IBS-D患者血清miRNA-148a-3p的表達(dá)。

IBS-D 患者結(jié)腸組織中miRNA-199 表達(dá)明顯下降。miRNA-199 的表達(dá)水平與VAS 評分及胃腸道癥狀呈負(fù)相關(guān)。通過熒光素酶報告檢測，從分子機(jī)制水平證實了miRNA-199 是TRPV1 關(guān)鍵的調(diào)控因子，miRNA-199 在細(xì)胞內(nèi)可以通過抑制TRPV1-mRNA 的轉(zhuǎn)錄的方式下調(diào)TRPV1 的表達(dá)。IBS-D 患者miRNA-199 缺乏直接造成TRPV1 表達(dá)增加，導(dǎo)致了IBS 患者的慢性內(nèi)臟疼痛[49]。本團(tuán)隊尚未發(fā)表的研究結(jié)果表明，IBS-D 患者與健康志愿者相比結(jié)腸組織中miRNA-199 的表達(dá)下降，TRPV1 表達(dá)升高。經(jīng)過12周的針刺治療，患者腹痛等不適癥狀得到有效緩解。針刺可能是通過上調(diào)miR-199，減少TRPV1 的表達(dá)發(fā)揮效應(yīng)。

3 基于表觀遺傳學(xué)對內(nèi)臟高敏感的治療

表觀遺傳標(biāo)記由表觀遺傳修飾酶催化和維持，一般來說是可以長期持續(xù)的，但在某些條件下可以被修改甚至逆轉(zhuǎn)。表觀遺傳標(biāo)記的可逆性和表觀遺傳修飾酶的抑制劑為內(nèi)臟高敏感的表觀遺傳相關(guān)治療的發(fā)展提供了潛力。上文中提及的一些臨床前研究提示，HDAC 抑制劑可能是緩解IBS 相關(guān)的內(nèi)臟高敏感的潛在方法。HDAC 抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）可以逆轉(zhuǎn)早期應(yīng)激引起的內(nèi)臟高敏感反應(yīng)和結(jié)腸動力增加[50]。在中樞CeA 內(nèi)注射HDAC 抑制劑可以通過增加GR啟動子上H3K9Ac，恢復(fù)GR表達(dá)水平，從而逆轉(zhuǎn)CORT 誘導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感[33]。在脊髓水平，HDAC 抑 制 劑 增 加 了 脊 髓 中 H3K9Ac、H3K18Ac 與GRM2、GRM3 啟動子上的幾個位點(diǎn)的結(jié)合，上調(diào)了mGluR2 和mGluR3 的表達(dá)，從而減輕內(nèi)臟高敏感[36]。目前被批準(zhǔn)用于臨床的HDAC 抑制劑包括羅米地辛、伏立諾他、貝利司他、西達(dá)本胺，主要用于惡性腫瘤的治療，尚無用于緩解IBS 內(nèi)臟高敏感的HDAC 抑制劑藥物。DNA 甲基化、組蛋白乙?；?、miRNA 等過程參與IBS 內(nèi)臟高敏感形成。針灸可以緩解內(nèi)臟高敏感，盡管基于表觀遺傳學(xué)探討針灸相關(guān)機(jī)制的研究仍為空白，但是前輩們關(guān)于針刺調(diào)控表觀遺傳學(xué)的相關(guān)結(jié)論以及本團(tuán)隊圍繞miRNA 展開的兩項探索性實驗，為未來該領(lǐng)域的研究提供了思路。

4 結(jié)語

綜上，表觀遺傳調(diào)控在IBS 內(nèi)臟高敏感的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。IBS 是一種環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的疾病，環(huán)境和應(yīng)激可以導(dǎo)致表觀遺傳標(biāo)記的持續(xù)性改變。在研究IBS內(nèi)臟高敏感機(jī)制時引入表觀遺傳調(diào)控，可以為我們提供更全面的視角。DNA 甲基化、組蛋白修飾、miRNA 調(diào)控可以導(dǎo)致離子通道或受體表達(dá)的長期變化，改變神經(jīng)元的興奮性，促進(jìn)慢性內(nèi)臟疼痛的發(fā)生。表觀遺傳修飾在某種程度上是可逆的，DNMT 抑制劑、HDAC 抑制劑可以逆轉(zhuǎn)內(nèi)臟高敏感，目前這些藥物尚停留在臨床前實驗階段。針灸可以有效緩解IBS 內(nèi)臟高敏感，一些前期的探索性研究提示表觀遺傳調(diào)控機(jī)制可能參與其中。然而表觀遺傳調(diào)控機(jī)制在該領(lǐng)域的研究尚處于空白狀態(tài)，我們有理由相信表觀遺傳學(xué)可以為針灸治療IBS內(nèi)臟高敏感的機(jī)制探索提供較好的研究方向。