不同溶劑對(duì)枇杷落葉提取物的影響

潘 炘，莊曉偉，于海霞，蔣應(yīng)梯，張文福，王 進(jìn)

（浙江林業(yè)科學(xué)研究院，浙江省森林資源與生物質(zhì)化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023）

枇杷Eriobotrya j aponica是薔薇科Rosaceae 枇杷屬Eriobotrya常綠小喬木。枇杷葉是一味常用傳統(tǒng)中藥，最早記載于《名醫(yī)別錄》[1]，具有清肺止咳、降氣化痰、抗炎、祛痰、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗癌和保肝功效[2-4]。目前，對(duì)枇杷葉中熊果酸、齊墩果酸、黃酮等成分含量分析測試的報(bào)道較多[5-6]。國內(nèi)學(xué)者對(duì)枇杷葉天然產(chǎn)物的提取分離方式也做了大量工作[7-8]，并通過對(duì)不同時(shí)期枇杷葉主要化學(xué)成分的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)落葉期枇杷葉中的三帖酸類含量最高[9-12]，且葉為枇杷天然產(chǎn)物主要積累器官[13-14]。

由于收集枇杷自然落葉要比從樹上直接摘取葉片要節(jié)約大量人力，因此，本研究主要針對(duì)枇杷自然落葉中的成分進(jìn)行分析研究，研究不同萃取溶劑對(duì)其多酚、多糖類等化合物提取得率的影響，為枇杷自然落葉的深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2019 年2-3 月，在浙江省林業(yè)科學(xué)研究院林場枇杷種植場地面收集一周內(nèi)的枇杷落葉，清水洗凈，于60℃烘干，粉碎后過20 目篩，干燥器保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)儀器及試劑

紫外-可見光分光光計(jì)（上海精科責(zé)任有限公司）。天平BSA124s-cw（德國賽多利斯）。

福林酚試劑、單寧酸、花青素為分析純均購自Solarbio 公司，乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、鹽酸、醋酸等為化學(xué)純均購自由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取方法 將試驗(yàn)材料枇杷葉粉分別以體積比為1∶12 的水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇為溶劑索氏抽提6 h，浸出液經(jīng)65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，60℃真空干燥得提取物，并分別回配制成1 mg·mL-1的待測液，水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇為溶劑提取物，分別命名為S-1、S-2、S-3、S-4，并以重量法換算提取得率：

式中，M1為提取物干燥后的質(zhì)量，M2為提取前物料質(zhì)量。

所得提取物以相應(yīng)溶劑復(fù)溶成1 mg·mL-1溶液4℃保存待測。

1.3.2 提取物化學(xué)成分測定

1.3.2.1 多酚化合物測定 采用福林酚比色法，標(biāo)準(zhǔn)曲線由單寧酸配制成0.30，0.15，0.075，0.038，0.019，0.01，0.005，0.002 5，0.001 2，0.000 6 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)反應(yīng)在760 nm 波長下比色。

1.3.2.2 黃酮類化合物測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，標(biāo)準(zhǔn)曲由單寧酸配制成1.25，0.625，0.312 5，0.156，0.078，0.039，0.020，0.010，0.005 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)反應(yīng)在470 nm 波長下比色。

1.3.2.3 總糖含量測定 采用蒽酮比色法，標(biāo)準(zhǔn)曲線由無水葡萄糖配制成0.3，0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)反應(yīng)在620 nm 波長下比色。

1.3.2.4 花青素測定 以原花青素為對(duì)照標(biāo)樣，配制成5，2.5，1.25，0.625，0.312 5，0.156，0.078，0.039，0.02，0.01 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液，香草醛與60%乙醇配配成4%香草醛含量反應(yīng)液，反應(yīng)體系為0.4 mL 待測樣，加入0.8 mL 4%香草醛反應(yīng)液，再加入0.8 mL 11%鹽酸，30℃水浴30 min，在500 nm 波長條件下比色，標(biāo)準(zhǔn)樣以蒸餾水為空白對(duì)照，待測樣以原待測樣加1.6 mL 水為本底扣除。

1.3.2.5 總抗氧化能力測定 采用FRAP 法，標(biāo)準(zhǔn)曲線由以FeSO4配制成Fe2+含量為0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25，0.003 125，0.001 56，0.000 78 μmol·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)反應(yīng)在593 nm 波長下比色。FRAP 工作液由醋酸鹽緩沖液（0.3M），2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）的鹽酸溶液（10 μmol·mL-1）和FeCl3溶液（20 mmol·mL-1）按7∶1∶1 配比制得，樣品測試為0.03 mL 樣品與0.9 mL FRAP 工作液在37℃反應(yīng)10 min，測試吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

獲得樣品將Fe3+還原為Fe2+能力，單位為μmol·mg-1。進(jìn)一步計(jì)算其總抗氧化能力，計(jì)算公式為：

式中，W為反應(yīng)體系中的提取物質(zhì)量，公式計(jì)算后單位為μmol·mg-1。所得數(shù)據(jù)均為3 次平行測定的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測定數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，求其平均值。采用Excel 2010 作圖。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同溶劑混合天然產(chǎn)物提取得率Figure 1 Yield of natural products extracted from E.japonica leaf by different solvents

2.1 不同溶劑對(duì)枇杷葉中混合天然產(chǎn)物提取得率的影響

水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇枇杷葉混合天然產(chǎn)物提取得率見圖1。

從圖1 可知，以水提物的得率最高，其次為正丁醇，最低為乙酸乙酯。由于抽提方式為索氏回流，提取溫度并不相同，水為100℃、乙醇為78℃、乙酸乙酯為77℃、正丁醇為117℃。在較高溫度條件下細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的破壞更為徹底，溶劑浸出物也較多，所以在4 個(gè)溶劑中提取溫度較高的水和正丁醇的提取得率較高，其中，水提取得率高于正丁醇，表明枇杷葉中水溶性物質(zhì)較多，如多糖和多酚類物質(zhì)等。將四種提取物以4 種溶劑進(jìn)行交互溶解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水提物與醇提物可以在水或乙醇溶劑中互溶，未見明顯不溶物。正丁醇和乙酸乙酯提取物在水中難溶，在乙醇中可溶解大部分。水提物在正丁醇和乙酸乙酯難溶，醇提物在正丁醇和乙酸乙酯中的溶解性好于水提物，但仍有明顯不溶物存在。

2.2 不同溶劑對(duì)枇杷葉中多酚化合物提取得率的影響

圖2 多酚測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve of polyphenols

圖3 不同溶劑提取多酚化合物提取得率Figure 3 Yield of polyphenols extracted by different solvents

多酚化合物的測定標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，枇杷葉不同溶劑提取物多酚化合物含量見表1。由圖2 可知，枇杷葉中多酚化合物的測定標(biāo)準(zhǔn)曲線符合y=0.274 1x-0.004 5（R2=0.999 5）。從表1 可知，不同提取物中多酚化合物含量由高至低的順序?yàn)椋阂掖继崛?＞ 正丁醇提取 ＞ 乙酸乙酯提取 ＞ 水提取，其中，乙醇提取物中多酚化合物的含量是正丁醇提取物的1.07 倍，水提物中多酚含量為乙醇提取物的84.3%。

表1 不同抽提物中的化合物含量與其抗氧化能力Table 1 The content of chemical components in different extracts and its antioxidant ability

枇杷葉不同溶劑的多酚化合物提取得率見圖3，其結(jié)果與表1 并不完全相同，多酚化合物的總提取得率由高至低順序?yàn)椋核崛?＞ 乙醇提取 ＞ 正丁醇提取 ＞ 乙酸乙酯提取，其中，以水提多酚得率最高，其次為醇提。這與丁建英等的研究結(jié)果并不完全一致[15]，這可能是因?yàn)槎〗ㄓ⒌人捎锰崛》椒?7℃超聲輔助提取，而本實(shí)驗(yàn)采用提取方式為索式回流抽提，而水回流抽提溫度要高于乙醇回流抽提溫度，從而造成水提多酚化合物得率為醇提的1.29 倍。提取得率的最低的為乙酸乙酯，其提取得率僅為水提得率的39.9%。這表明在4 種溶劑中雖然水提取物中多酚化合物含量最低，但由于較高索式抽提溫度造成枇杷葉中溶出物質(zhì)較多導(dǎo)致水提物得率較大。乙醇、正丁醇雖然溶劑極性不同、回流抽提溫度各異，但提取物中多酚化合物含量以及多酚化合物得率相似。由于酚類物質(zhì)是由羥基（-OH）與芳烴核直接相連形成，因此此類成分極性較大。在4 種提取溶劑中水的極性最大。這也解釋了水提酚類成分得率高的原因。但在提取物中多酚含量最高的為醇提物，其含量為水提物1.2 倍，表明枇杷葉中多酚成分存在極性較小的組分進(jìn)而造成醇提物多酚成分主成分與水提物并不完全相同，這需進(jìn)一步深入研究。

黃酮類化合物是酚類物質(zhì)中重要的功能成分，黃酮的測定標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。從圖4 可知，黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線符合y=3.130 5x-0.002 5（R2=0.999 6）。

圖4 類黃酮測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 4 Standard curve of flavonoid

圖5 不同溶劑提取總黃酮類化合物得率Figure 5 Yield of total flavonoids extracted by different solvents

從表1 中可知，黃酮類成分在不同極性溶劑含量差異明顯，乙醇提取物中黃酮類化合物含量最高，為正丁醇提取物含量的1.5 倍。黃酮類化合物含量最低為乙酸乙酯提取物，僅為乙醇提取物的31%。黃酮類化合物具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)成分，也即以C6-C3-C6 為基本碳架的一系列化合物，因此極性差異較大，如蘆丁、5,7-二羥基黃酮和芹菜素。從表1 可知枇杷葉黃酮類化合物極性較強(qiáng)，而強(qiáng)極性、弱極性和非極性的黃酮類化合物較少。

不同溶劑總黃酮成分的提取得率見圖5。由圖可知，總黃酮類化合物得率最高的為乙醇提取，最低為乙酸乙酯提取。由于水提物得率高于正丁醇提取得率，因此，雖然水提物中總黃酮含量為正丁醇提取物的76%，但總提取得率為正丁醇提取得率的1.11 倍。所以，如果用于膏方劑用途開發(fā)，水仍是最為經(jīng)濟(jì)有效和安全的溶劑。

2.3 不同溶劑對(duì)枇杷葉中總糖提取得率的影響

枇杷葉不同溶劑提取物中的總糖含量如表1 所示，總糖測定曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線符合y=3.130 5x-0.002 5（R2=0.999 6），如圖6。

從表1 中得出，隨著溶劑極性的減小，其總糖含量也相應(yīng)減小，總糖含量由高至低為：水浸提＞乙醇浸提＞正丁醇浸提＞乙酸乙酯浸提。圖7 為不同溶劑總糖提取得率。由圖7 可知，總糖提取得率與提取物含量和溶劑極性大小順序相吻合，這表明對(duì)于枇杷自然落葉中總糖的提取，極性大的水為最優(yōu)的溶劑。與新鮮枇杷葉水浸提取總糖比（料液比1∶15）其得率僅低10%[16]，因此通過進(jìn)一步提取工藝優(yōu)化完全可以達(dá)到新鮮枇杷葉多糖提取得率。這表明自然落葉中的總糖與新鮮采摘的枇杷葉總糖含量差異不大[17]。

圖6 總糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 6 Standard curve of total carbohydrate

圖7 不同溶劑總糖提取得率Figure 7 Yield of total carbohydrate extracted by different solvents

2.4 不同溶劑對(duì)枇杷葉中花青素提取得率的影響

花青素是一類糖苷衍生物，花青素測定標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8，不同抽提物花青素含量見表1。

圖8 花青素測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 8 Standard curve of anthocyanin

圖9 不同溶劑花青素提取得率Figure 9 Yield of anthocyanin extracted by different solvents

從表1 可知，枇杷葉中不同溶劑提取物中花青素含量存在較大差異，其中，乙酸乙酯提取物中的花青素含量最高，水提物中的最低。乙酸乙酯提取物中的花青素含量為水提物中的2.9 倍，表明枇杷葉中花青素的極性較小。酯類溶劑乙酸乙酯與醇類溶劑乙醇極性相似，抽提溫度相近，但乙酸乙酯提取物中的花青素含量為乙醇提取物中的1.5 倍，由此表明，枇杷葉中花青素成分多為酯溶性而非醇溶性。圖9 為不同溶劑抽提物中的花青素得率。從圖9 中可知，花青素提取得率最高的為乙醇，最低的為正丁醇，其中，醇提花青素提取得率分別為乙酸乙酯和正丁醇的1.2 倍和1.7 倍。這也證明對(duì)花青素類植物功能成分的提取效率而言，由水、醇互溶提取再由乙酸乙酯萃取是合理的，但此類提取方式也可能會(huì)造成部分脂溶性功能成份的丟失。因此，在實(shí)際生產(chǎn)加工中需對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行合理分類進(jìn)而選擇合適的提取工藝。

2.5 不同溶劑對(duì)枇杷葉中提取物總抗氧化能力的影響

三價(jià)鐵離子還原為二價(jià)鐵離子的能力通常用于天然產(chǎn)物抗氧化能力測定[18]。由表1 可知，不同溶劑提取物的抗氧化能力由高至低為乙醇提取物＞水提取物＞正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物，這與郭宇研究的結(jié)果相同[19]。不同溶劑提取物總抗氧化能力如圖10 所示。

圖10 不同溶劑對(duì)提取物抗氧化能力的影響Figure 10 Antioxidant capacity of extracts by different solvents

由圖10 和表1 可知，雖然水提物的單位質(zhì)量抗氧化能力為乙醇提取物的77%，但其提取得率為醇提的1.5倍，因此，其提取物總抗氧化能力為4 種溶劑中最高?？筛鶕?jù)枇杷葉開發(fā)產(chǎn)品定位選擇不同的溶劑，如以開發(fā)含總糖膏方產(chǎn)品為主選擇以水為主溶劑的復(fù)合提取系統(tǒng)。如果以進(jìn)一步黃酮類成分精深分離為定位，則以乙醇為主溶劑的復(fù)合提取系統(tǒng)為宜。

3 討論與結(jié)論

將自然衰老離枝的枇杷葉，通過不同極性的溶劑水、乙醇、丁醇和乙酸乙酯進(jìn)行索式抽提，得到提取物。通過成份分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)多酚化合物而言，以乙醇提取物含量最高，而以水提取得率最高。枇杷葉水提物的總糖含量和提取得率在4 種提取液中均為最高，這也表明傳統(tǒng)枇杷葉膏方采用水作為溶媒是高效的[20]。正丁醇用于水提物中萃取用于去除糖類組分[21]，但試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，正丁醇提取物含有糖類成分，說明枇杷葉中糖類成分中極性差異度較大。水與正丁醇提取物中的糖類并非同類物質(zhì)，其具體組分需進(jìn)一步深入研究。

對(duì)花青素成分而言，以乙酸乙酯提取物中的含量最高而以乙醇的提取得率最高。黃酮類成分以乙醇的提取得率和提取物中含量均為最高。黃酮類成分是枇杷葉中重要的功能組分，對(duì)其相應(yīng)研究也較多[12,22]，通過對(duì)比試驗(yàn)，水與乙醇對(duì)黃酮類成分提取得率均較高，而在實(shí)際應(yīng)用中也采用了水-乙醇兩相體系用于擴(kuò)大枇杷葉中黃酮的提取效率，并可有效地降低提取成本[7]。對(duì)于三價(jià)鐵離子還原能力，以乙醇提取物的單位質(zhì)量還原能力最強(qiáng)，水提物的總還原能力最高。通過研究發(fā)現(xiàn)，自然衰老枇杷葉中的功能組分豐富，這與李繼楊的研究結(jié)果相似[9]，具有進(jìn)一步精深加工的利用價(jià)值，且采用自然衰落的枇杷葉比采摘枇杷葉節(jié)約了大量人工費(fèi)用，不同溶劑對(duì)于枇杷自然衰老葉中不同功能組分的提取存在較大差異。本研究成果可為枇杷自然衰老葉不同功能成分如多糖、黃酮類化合物萃取體系的選擇提供理論依據(jù)。