miR-105-5p靶向MAPK1抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的生長、運(yùn)動和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化①

李耀杰 湯素娜 王保收 王 偉 楊攀娜 劉 玉

(開封中心醫(yī)院心胸外科，開封475000)

肺癌是一種常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，是全球癌癥死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和死亡率在我國惡性腫瘤中位居第一[1]。而非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌全球死亡病例的85%[2]。由于NSCLC確診時一般已經(jīng)進(jìn)入癌癥晚期，手術(shù)已經(jīng)不再適合治療，且其預(yù)后差，5年和10年的存活率分別只有15%和7%，因此，尋找NSCLC的新型診斷方法和治療靶點迫在眉睫[3]。已有研究表明miRNA的異常表達(dá)與多種疾病包括癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且miRNA能夠通過與靶基因mRNA分子3′-UTR端特異性結(jié)合調(diào)控靶基因表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的生長、運(yùn)動及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[4]。miR-105在人類癌癥中具有重要作用，其表達(dá)缺失與患者生存不良密切相關(guān)，且已有研究表明，miR-105-1低表達(dá)與NSCLC患者生存不良有關(guān)[5，6]。本文探討了miR-105-5p在NSCLC細(xì)胞A549的表達(dá)及miR-105-5p靶向MAPK1對NSCLC細(xì)胞A549的生長、運(yùn)動和EMT的影響，以期為NSCLC的診斷和治療提供新的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞及動物來源 人肺癌細(xì)胞株A549和人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購自中國科學(xué)院細(xì)胞文庫菌物保藏中心；裸鼠購自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證：SYXK(川)2017-203。

1.1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自德國PAN公司；Lipofectamine 2000 購于美國 Invitrogen 公司；mimic-NC、miR-105-5p mimic、MAPK1質(zhì)粒購自上海生物工程有限公司；Dual Luciferase報告基因試劑盒購自美國 Promega 公司；MTT試劑盒購自于北京索寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將A549細(xì)胞菌株置于含10%熱滅活胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素100 U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液中，在5% CO2、37℃培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、mimic-NC組、miR-105-5p mimic組、MAPK1組、mimic+MAPK1組。根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將mimic-NC、miR-105-5p mimic、MAPK1質(zhì)粒分別或者聯(lián)合轉(zhuǎn)染至各組肺癌A549細(xì)胞。

1.2.2qRT-PCR檢測miR-105-5p和MAPK1表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，定量分析并調(diào)平后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR檢測。GAPDH上游引物：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，下游引物：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTG-3′；miR-105-5p上游引物：5′-AGGACUCAAAUGCUCAG-3′，下游引物：5′-UCAAAUGCUCAGACUCCUGU-3′；MAPK1上游引物：5′-AAGTTTCGACGTGGGG-3′，下游引物：5′-TCCTTCGGCAAGTCATC-3′。

1.2.3靶向預(yù)測 運(yùn)用基因預(yù)測軟件：miRanda(http://www.microna.org /microrna/home.do、TarBase (http://diana.calab.ece.ntua.gr/tarbase)、TargetScan (http://www.targetscan.org) 和Pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)預(yù)測miR-128-3p的靶基因。

1.2.4熒光素酶實驗檢測靶向關(guān)系 以海腎熒光素酶的熒光值為內(nèi)參，按照Dual Luciferase報告基因試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5MTT法檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞懸浮液以2×103個/孔加入96孔板，待細(xì)胞生長至50% 時，更換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，加入MTT(10 ml/孔)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液加入DMSO，上機(jī)測定A490，吸光值代表細(xì)胞活力。

1.2.6Western blot檢測增殖標(biāo)記蛋白(Ki67、 PCNA)和凋亡標(biāo)記蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3、 Caspase-9)、上皮性標(biāo)記蛋白(E-cadherin)和間充質(zhì)標(biāo)記蛋白( N-cadherin)表達(dá)水平 向各組A549細(xì)胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測各組總蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜，并加入脫脂牛奶，室溫條件下封閉蛋白2 h，加入一抗(Ki67：1∶1 000，PCNA：1∶1 000，Bcl-2：1∶1 000，Bax：1∶500，Caspase-3：1∶1 000，Caspase-9：1∶1 000，E-cadherin：1∶1 000，N-cadherin：1∶1 000)4℃封閉過夜，加入對應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴ECL曝光。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 加入適量胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。離心棄上清，加入190 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10 μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.2.8Transwell檢測細(xì)胞侵襲 將細(xì)胞以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化以3×105個/ml傳代接種于無血清培養(yǎng)基和Mntrigel預(yù)處理過的小室上層，加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，小室下層則加入含血清的正常培養(yǎng)液。48 h后用無菌棉簽擦去小室上層細(xì)胞，小室下層細(xì)胞以結(jié)晶紫染色后計數(shù)統(tǒng)計。

1.2.9劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 將各組肺癌A549細(xì)胞消化鋪滿單層后以小號槍頭垂直劃痕，加入無血清培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃恒溫的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別在顯微鏡下拍照，用 Image J 軟件分析。

1.2.10裸鼠體內(nèi)實驗 將裸鼠隨機(jī)分為Control組和miR-105-5p mimic組，20只/組，雌雄各半。在各組裸鼠右后肢腹側(cè)皮下分別注射 0.2 ml的肺癌A549細(xì)胞(1×107個/ml)和轉(zhuǎn)染miR-105-5p mimic的肺癌A549細(xì)胞懸液，SPF條件下正常飲食飼養(yǎng)，觀察裸鼠皮下成瘤情況。第 30 天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，電子天平稱重，Western blot檢測Ki67、Bax、Caspase-3和E-cadherin的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1miR-105-5p 在NSCLC A549中低表達(dá) miR-105-5p 在NSCLC A549中表達(dá)比正常肺組織細(xì)胞明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1A)；與Control組A549細(xì)胞相比，mimic-NC組A549細(xì)胞中 miR-105-5p無變化，而 miR-105-5p mimic組A549細(xì)胞中 miR-105-5p表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1B)，說明質(zhì)?？蛰d對A549細(xì)胞無影響，而miR-105-5p mimic 構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實驗。

2.2miR-105-5p靶向抑制MAPK1 通過基因預(yù)測軟件篩選出MAPK1作為 miR-105-5p的靶基因，miR-105-5p與MAPK1在3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點(圖2A)。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明，miR-105-5p對野生型(WT)MAPK1表達(dá)有明顯下調(diào)作用，對突變型(MUT)無明顯作用，說明 miR-105-5p直接靶向作用于MAPK1(P<0.01，圖2B)。

檢測各組NSCLC A549細(xì)胞中MAPK1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，mimic-NC組細(xì)胞MAPK1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均無明顯變化，miR-105-5p mimic組MAPK1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，MAPK1組MAPK1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，說明空載質(zhì)粒對細(xì)胞MAPK1表達(dá)無影響，miR-105-5p mimic對MAPK1具有抑制作用；mimic+MAPK1組MAPK1 mRNA和蛋白表達(dá)量與Control組和mimic-NC組比無明顯變化，比 miR-105-5p mimic組顯著上調(diào)，比MAPK1組顯著下調(diào)，說明 miR-105-5p和MAPK1具有靶向關(guān)系，并且過表達(dá) miR-105-5p抑制MAPK1表達(dá)(P<0.01，圖2C、D)。

2.3miR-105-5p靶向MAPK1抑制NSCLC A549細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 mimic-NC組與Control組NSCLC A549細(xì)胞增殖速度、凋亡率及增殖標(biāo)記蛋白(Ki67、PCNA)和凋亡標(biāo)記蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3、 Caspase-9)表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)，說明空載質(zhì)粒對細(xì)胞增殖和凋亡無影響；與Control組相比，miR-105-5p mimic組細(xì)胞增殖速度及Ki67、 PCNA和Bcl-2表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率及Bax、Caspase-3和 Caspase-9表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)，說明miR-105-5p過表達(dá)抑制NSCLC A549細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；與Control組相比，MAPK1組細(xì)胞增殖速度及Ki67、 PCNA和Bcl-2表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡率及Bax、Caspase-3和 Caspase-9表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3A、B)，說明MAPK1過表達(dá)促進(jìn)NSCLC A549細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡；mimic+MAPK1組細(xì)胞增殖速度、凋亡率及增殖標(biāo)記蛋白(Ki67、PCNA)和凋亡標(biāo)記蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3、 Caspase-9)表達(dá)水平與Control組和mimic-NC組比無明顯變化，而細(xì)胞增殖速度及Ki67、 PCNA和Bcl-2表達(dá)比 miR-105-5p mimic組明顯增多，細(xì)胞凋亡率及Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)比 miR-105-5p mimic組明顯減少，細(xì)胞增殖速度及Ki67、 PCNA和Bcl-2表達(dá)比MAPK1組降低，細(xì)胞凋亡率及Bax、Caspase-3和 Caspase-9表達(dá)比 miR-105-5p mimic組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)，說明miR-105-5p過表達(dá)靶向MAPK1抑制NSCLC A549細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖1 qRT-PCR檢測miR-105-5p mRNA表達(dá)水平Fig.1 miR-105-5p mRNA expression levels were detected by qRT-PCRNote:A.**.P<0.01 vs BEAS-2B normal lung tissue cells；B.##.P<0.01 vs Control group.

圖2 miR-105-5p靶向作用于MAPK1Fig.2 miR-105-5p targets to MAPK1Note:A.Target genes of miR-105-5p were screened by gene prediction software;B.Targeting relationship was detected by luciferase activity;C.expression of MAPK1 mRNA was detected by qRT-PCR;D.1.Control；2.mimic-NC；3.miR-105-5p；4.MAPK1;5.MAPK1+mimic.△△.P<0.01 vs mimic-NC group;**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

圖3 miR-105-5p靶向MAPK1抑制NSCLC A549細(xì)胞的生長Fig.3 miR-105-5p inhibits growth of NSCLC A549 cells by targeting MAPK1Note:A.Cell proliferation was detected by MTT assay;B.Apoptosis was detected by flow cytometry;C.1.Control；2.mimic-NC；3.miR-105-5p；4.MAPK1;5.MAPK1+mimic.**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

2.4miR-105-5p靶向MAPK1抑制NSCLC A549細(xì)胞的侵襲和遷移 mimic-NC組與Control組侵襲細(xì)胞數(shù)目、劃痕寬度和傷口愈合率均無明顯變化，說明空載質(zhì)粒對NSCLC A549侵襲和遷移能力無影響；與Control組相比，miR-105-5p mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)目和傷口愈合率降低(P<0.01)，劃痕明顯變寬，說明miR-105-5p過表達(dá)抑制HSCLC A549的侵襲和遷移；與Control組相比，MAPK1組侵襲細(xì)胞數(shù)目和傷口愈合率明顯升高(P<0.01)，劃痕明顯變窄，說明MAPK1過表達(dá)促進(jìn)NSCLC A549細(xì)胞侵襲和遷移； mimic+MAPK1組侵襲細(xì)胞數(shù)目和傷口愈合率與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-105-5p mimic組增多，比MAPK1組減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明miR-105-5p過表達(dá)通過靶向調(diào)控MAPK1抑制NSCLC A549細(xì)胞侵襲和遷移(圖4)。

2.5miR-105-5p靶向MAPK1抑制NSCLC A549細(xì)胞EMT mimic-NC組與Control組E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)無明顯變化，說明空載質(zhì)粒對NSCLC細(xì)胞EMT無影響；與Control組相比，miR-105-5p mimic組E-cadherin表達(dá)上調(diào)、N-cadherin表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明miR-105-5p過表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞的EMT；與Control組相比，MAPK1組E-cadherin表達(dá)下調(diào)、N-cadherin表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明MAPK1過表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的EMT； mimic+MAPK1組E-cadherin表達(dá)與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-105-5p mimic組明顯下調(diào)，比MAPK1組明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，mimic+MAPK1組N-cadherin表達(dá)與Control組和mimic-NC組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，比 miR-105-5p mimic組明顯上調(diào)，比MAPK1組明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明miR-105-5p過表達(dá)通過靶向調(diào)控MAPK1抑制NSCLC細(xì)胞的EMT(圖5)。

圖4 miR-105-5p靶向MAPK1抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的運(yùn)動Fig.4 miR-105-5p inhibits movement of non-small cell lung cancer A549 cells by targeting MAPK1Note:A.Cell invasion deteced by Transwell;B.Cell migration detected by scratch test.1.Control；2.mimic-NC;3.miR-105-5p;4.MAPK1;5.mimic-MIPK1.**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

圖5 Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)Fig.5 Expression levels of E-cadherin and N-cadherin were detected by Western blotNote:1.Control；2.mimic-NC;3.miR-105-5p;4.MAPK1;5.mimic-MAPK1.**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

2.6miR-105-5p過表達(dá)抑制體內(nèi)NSCLC A549移植瘤的發(fā)展 30 d后檢測移植瘤重量發(fā)現(xiàn)，miR-105-5p mimic組與Control組相比，移植瘤明顯較小，重量明顯減輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖6A、B)，說明miR-105-5p過表達(dá)抑制體內(nèi)NSCLC A549移植瘤的發(fā)展。與Control組相比，miR-105-5p mimic組MAPK1、Ki67 、Bax和Caspase-3表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖6C)，說明miR-105-5p過表達(dá)抑制體內(nèi)NSCLC A549細(xì)胞生長和EMT，與體外實驗結(jié)果一致。

3 討論

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，可分為NSCLC和小細(xì)胞肺癌，且NSCLC占肺癌病例的75%～80%，其發(fā)病率和死亡率逐年上升[7，8]。手術(shù)是延長肺癌患者生命的最佳手段，但由于NSCLC確診時一般已經(jīng)進(jìn)入癌癥晚期，手術(shù)已經(jīng)不再適合治療，且其化療和放療都存在預(yù)后差的問題，靶向治療成為了新型手段。已有研究表明miRNA與肺癌細(xì)胞的生長、運(yùn)動等密切相關(guān)，如miR-154、miR-181a、miR-202等抑制NSCLC的生長和運(yùn)動，miR-150、miR-21、miR-155等則促進(jìn)其生長和運(yùn)動[9-13]。因此，尋找與NSCLC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA分子對其的治療具有重要意義。miR-105作為與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNA 分子，在肝癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞中均呈低表達(dá)，其表達(dá)量和預(yù)后呈正相關(guān)，是一類癌癥抑制基因[5,14]。本文通過研究發(fā)現(xiàn)miR-105在NSCLC A549細(xì)胞中低表達(dá)，其可能在NSCLC中起抑癌基因作用，有望成為NSCLC的治療靶點。為了驗證該預(yù)測，本文構(gòu)建miR-105-5p mimic載體后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過各實驗證實了miR-105-5p過表達(dá)可以抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和EMT，并誘導(dǎo)凋亡。

圖6 miR-105-5p過表達(dá)抑制體內(nèi)非小細(xì)胞肺癌A549移植瘤的發(fā)展Fig.6 miR-105-5p overexpression inhibits development of NSCLC A549 xenografts in vivoNote:A.Photo of transplanted tumor;B.Weight of transplanted tumor;C.1.Control；2.miR-105-5p;**.P<0.01 vs control group.

為了更好地理解miR-105-5p作為抑癌miRNA的機(jī)制，課題組預(yù)測了miR-105-5p可能的靶基因。利用生物信息學(xué)技術(shù)和雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)，MAPK1是 miR-105-5p的靶基因，在3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點。絲裂原活化蛋白激酶是一組能被不同的細(xì)胞外物質(zhì)如細(xì)胞因子、細(xì)胞應(yīng)激、激素、神經(jīng)遞質(zhì)及細(xì)胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶[15]。MAPK廣泛存在于細(xì)胞中的蛋白激酶家族成員，作為不依賴第二信使的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，能將細(xì)胞外的信息傳至細(xì)胞內(nèi)部，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂、代謝、程序性死亡和炎癥反應(yīng)等多種生理活動過程，在多種疾病的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[16]。MAPK1是MAPK的下游靶標(biāo)，不同的物理或化學(xué)刺激均可激活MAPK1蛋白，進(jìn)而激活P38信號通路，啟動力級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)[17]。MAPK1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的生物學(xué)作用，在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中均可檢測到MAPK1的活化或高表達(dá)[18]。同樣，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過調(diào)控MAPK1影響腫瘤的生物學(xué)行為。例如，MAPK1是miR-329-3p在宮頸癌中的直接靶基因，miR-329-3p可調(diào)控MAPK1抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[19]。本文通過實驗證明miR-105-5p過表達(dá)靶向抑制MAPK1表達(dá)，且miR-105-5p過表達(dá)對NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和EMT抑制作用和對凋亡的促進(jìn)作用是通過下調(diào)MAPK1實現(xiàn)的。

通過體外實驗可知，miR-105-5p過表達(dá)靶向MAPK1抑制NSCLC A549細(xì)胞生長、運(yùn)動和EMT。相比單一的外部環(huán)境，生物體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多變，為了更好地了解miR-105-5p對NSCLC A549細(xì)胞的生長、運(yùn)動和EMT的影響，本文進(jìn)行了裸鼠體內(nèi)實驗。研究發(fā)現(xiàn)miR-105-5p過表達(dá)抑制NSCLC A549細(xì)胞移植瘤的生長，并抑制 NSCLC A549體內(nèi)增殖和EMT、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-105-5p過表達(dá)靶向MAPK1抑制NSCLC A549細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT，為miR-105-5p和MAPK1在NSCLC中的臨床靶向應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。