lncRNA UCA1靶向miR-145調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3增殖和遷移行為①

董志紅 古力加汗·艾爾肯 鐵麗萍 沈谷群

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,烏魯木齊830000)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響女性健康，預(yù)后較差且復(fù)發(fā)率較高[1，2]。因此，尋找新的診斷指標(biāo)和治療方法是改善卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA) 是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，是一類(lèi)不編碼蛋白質(zhì)的RNA[3]。研究表明，lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中，lncRNA UCA1參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，在卵巢癌組織中異常表達(dá)，通過(guò)上調(diào)MMP2、MMP9促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[4-8]。短鏈非編碼RNA miR-145過(guò)表達(dá)可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞增殖并降低其運(yùn)動(dòng)能力[9-11]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)UCA1和miR-145可能存在靶向關(guān)系，但UCA1和miR-145在卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移過(guò)程中是否存在靶向調(diào)控關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文將探究沉默和過(guò)表達(dá)UCA1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖與遷移的作用及其與miR-145的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 人卵巢癌細(xì)胞株A2780、SK-OV-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，人正常卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC由本院實(shí)驗(yàn)室保存；shUCA1、miR-145 inhibitor購(gòu)自廣州銳博生物公司；DMEM培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、胰酶、雙抗和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；pcDNA3.1質(zhì)粒、lipo3000、TRIzol試劑購(gòu)自賽默飛世爾公司；psiCHECK質(zhì)粒、Dual Luciferase報(bào)告基因試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自Promega 公司；CCK8試劑盒購(gòu)自同仁公司；UCA1全序列合成及引物合成由上海生工完成；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-15/-28 (matrix metalloproteinase-15/28,MMP-15/28)、CyclinD1、周期素依賴(lài)性激酶2(cdc2 related protein kinase,CDK2)、活化蛋白激酶B (jun B protooncogene,JunB)、GAPDH一抗及HRP 標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔二抗均購(gòu)自北京博奧森生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人正常卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC、人卵巢癌細(xì)胞A2780培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，SK-OV-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2，隔天觀察換液，細(xì)胞融合率達(dá)到90%時(shí)傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后按照操作手冊(cè)采用lipo3000將shUCA1、pcDNA3.1-UCA1重組質(zhì)粒、pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SK-OV-3細(xì)胞，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要采用lipo3000分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染shUCA1、miR-145 inhibitor，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SK-OV-3細(xì)胞進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)。胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5 000個(gè)/孔，接種于96孔板，150 μl/孔加入培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)，隨機(jī)分為miR-145 mock組、shUCA1組、miR-145 inhibitor組和shUCA1+miR-145 inhibitor組，用miR-145 inhi-bitor 和shUCA1分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24、48、72、96 h后，100 μl/孔加入培養(yǎng)基與20 μl CCK8試劑，避光孵育2 h；酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(OD)，OD值越大，細(xì)胞活力越強(qiáng)，細(xì)胞增殖越多。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，以2×105個(gè)/ml接種于24孔Transwell小室中，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，小室下層加入含血清的正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后用棉簽擦去上層細(xì)胞，用結(jié)晶紫對(duì)下層細(xì)胞進(jìn)行染色并統(tǒng)計(jì)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 通過(guò)starBase數(shù)據(jù)庫(kù)的miRNA-lncRNA interactions模塊預(yù)測(cè)分析UCA1與miR-145的結(jié)合位點(diǎn)?；蚝铣蒛CA1中含有miR-145結(jié)合位點(diǎn)的片段，并將該片段插入psiCHECK載體。用野生型UCA1質(zhì)粒、突變型UCA1質(zhì)粒和miR-145分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，根據(jù)Dual Luciferase報(bào)告基因試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.2.6RT-qPCR 根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，RT-qPCR檢測(cè)UCA1和miR-145表達(dá)，UCA1以β-actin為對(duì)照，miR-145以U6為對(duì)照。引物序列見(jiàn)表1，2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 收集培養(yǎng)的細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)，冰上充分裂解15 min，收集裂解液超聲裂解后于4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清煮沸10 min，測(cè)定蛋白濃度，-80℃保存。取40 μg蛋白行SDS-PAGE電泳(60、90 V恒壓)，電泳結(jié)束后恒流200 mA，濕法轉(zhuǎn)膜 2 h，TBST洗膜3次、每次5 min，5%脫脂奶粉封閉1 h。TBST洗3次、每次5 min，加入一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次、每次5 min，加入相應(yīng)二抗37℃孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1UCA1和miR-145在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá) 通過(guò)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA分析卵巢癌及癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNAs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UCA1在425例卵巢癌組織中的表達(dá)中位數(shù)為6.25，在88例癌旁組織中的表達(dá)中位數(shù)為0.02，提示UCA1在卵巢癌組織中表示升高(P<0.01，圖1)。與人正常卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC相比，UCA1在卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3和A2780中表達(dá)顯著升高(P<0.05)，SK-OV-3細(xì)胞表達(dá)升高更為顯著(P<0.01)，miR-145表達(dá)明顯降低(P<0.01，圖2)，SK-OV-3細(xì)胞變化最為顯著。因此，選擇SK-OV-3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 RT-qPCR引物序列

2.2UCA1對(duì)miR-145表達(dá)的影響 UCA1過(guò)表達(dá)可顯著降低卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3 miR-145表達(dá)(P<0.01,圖3A)。下調(diào)UCA1表達(dá)可顯著促進(jìn)SK-OV-3細(xì)胞miR-145表達(dá)(P<0.01,圖3B)，表明UCA1可影響卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3 miR-145表達(dá)。

2.3下調(diào)UCA1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響 CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與miR-145 mock組相比，miR-145 inhibitor組細(xì)胞活性明顯提高，表明miR-145可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，而shUCA1組細(xì)胞活性明顯降低(P<0.05)，可能是UCA1低表達(dá)可促進(jìn)miR-145表達(dá)，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖;與shUCA1組相比，shUCA1+miR-145 inhibitor組細(xì)胞活性明顯升高(P<0.05) ，進(jìn)一步證實(shí)下調(diào)UCA1可促進(jìn)miR-145升高，而miR-145 inhibitor抑制miR-145表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，見(jiàn)圖4。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)UCA1表達(dá)模式Fig.1 UCA1 expression pattern was predicted by GEPIA databank

圖2 UCA1和miR-145在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.2 Expressions of UCA1 and miR-145 in ovarian cancer cell linesNote:*.P<0.05，**.P<0.01 vs HOSEpiC group.

2.4沉默UCA1對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移的影響 Trans-well小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與miR-145 mock組相比，miR-145 inhibitor組細(xì)胞遷移數(shù)顯著增多(P<0.05)，表明miR-145可抑制卵巢癌細(xì)胞遷移，而shUCA1組細(xì)胞遷移較明顯減少(P<0.05)，可能與UCA1低表達(dá)促進(jìn)miR-145升高，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞遷移有關(guān);與shUCA1組相比，shUCA1+miR-145 inhibitor組細(xì)胞遷移數(shù)增多(P<0.05) ，進(jìn)一步證實(shí)下調(diào)UCA1可促進(jìn)miR-145升高，而miR-145 inhibitor抑制miR-145表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移，見(jiàn)圖5。

2.5UCA1靶向結(jié)合miR-145 UCA1基因序列上存在miR-145的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-145和野生型UCA1質(zhì)?？娠@著減弱帶有UCA1片段的野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.05)，UCA1結(jié)合位點(diǎn)突變后，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-145和野突變型UCA1質(zhì)粒熒光素酶活性升高。表明UCA1和miR-145間存在靶向調(diào)控關(guān)系，見(jiàn)圖6。

2.6沉默UCA1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與NC組相比，shUCA1組卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-15和MMP-28表達(dá)顯著降低，與miR-145 mock組及shUCA1組相比，miR-145 inhibitor 組MMP-15和MMP-28表達(dá)明顯升高，與shUCA1組相比，shUCA1+miR-145 inhibitor組MMP-15和MMP-28表達(dá)明顯升高。在SK-OV-3細(xì)胞株中，敲低UCA1后，PCNA和JunB表達(dá)顯著降低，而miR-145 inhibitor 組PCNA和JunB表達(dá)明顯升高，與shUCA1組相比，shUCA1+miR-145 inhibitor組PCNA和JunB表達(dá)明顯升高。但CyclinD1和CDK2蛋白檢測(cè)結(jié)果卻與預(yù)期相反，shUCA1 CyclinD1和CDK2組升高，miR-145 inhibitor組顯著降低，shUCA1+miR-145 inhibitor組顯著升高，提示存在其他信號(hào)通路參與UCA1/miR-145調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞增殖的過(guò)程，有待進(jìn)一步研究。

圖3 UCA1對(duì)SK-OV-3細(xì)胞miR-145表達(dá)的影響Fig.3 Effects of UCA1 on expression of miR-145 of SK-OV-3 cellsNote:A.Overexpression UCA1;B.Silencing UCA1;**.P<0.01 vs pcDNA3.1 group;##.P<0.01 vs shNC group.

圖4 沉默UCA1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of silencing UCA1 on cell proliferation of ovarian cancer cellsNote:*.P<0.05 vs miR-145 mock group;#.P<0.05 vs NC group.

圖5 沉默UCA1對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移的影響

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率、病死率較高的惡性腫瘤，臨床治療方式主要為腫瘤減滅術(shù)合并鉑類(lèi)、紫杉醇聯(lián)合化療[12,13]。目前腫瘤復(fù)發(fā)與化療耐藥是卵巢癌臨床治療的重大難題，因此，探究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的防治靶點(diǎn)，對(duì)改善卵巢癌患者治療效果及預(yù)后至關(guān)重要。

朱靜等[14]及瞿秋紅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，抑制或過(guò)表達(dá)編碼基因PinX1、B7-H1等可顯著影響卵巢癌細(xì)胞增殖遷移，為卵巢癌的診療提供了重要的分子生物學(xué)依據(jù)，而非編碼RNA是一類(lèi)不參與蛋白質(zhì)編碼的RNA，根據(jù)剪切長(zhǎng)度可分為長(zhǎng)鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA。非編碼RNA具有多種生物學(xué)功能，參與調(diào)節(jié)基因、蛋白質(zhì)表達(dá)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝，同時(shí)參與癌癥的發(fā)生發(fā)展[16-18]。尿路上皮癌相關(guān)因子(urothelial carcinoma associated antigen 1,UCA1)位于人染色體19p13.12區(qū)域，是膀胱癌中特異性高表達(dá)的lncRNA，UCA1在多種癌癥中呈高表達(dá)，與癌癥患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[19,20]。異常表達(dá)的UCA1參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、惡化及藥物耐受等病理過(guò)程，發(fā)揮原癌基因或抑癌基因功能[21]。非編碼RNA中的miRNA是lncRNA發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)，lncRNA可作為結(jié)合miRNA的“海綿”，下調(diào)miRNA表達(dá)發(fā)揮作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA UCA1在卵巢癌中高表達(dá)，上調(diào)UCA1可在體內(nèi)外促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移；而miR-145在卵巢癌中呈低表達(dá)[7,23]。尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道UCA1和miR-145在卵巢癌中的靶向關(guān)系和具體作用。本研究檢測(cè)了UCA1和miR-145在多種卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果提示UCA1在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平高于正常卵巢上皮細(xì)胞，miR-145的表達(dá)水平低于正常卵巢上皮細(xì)胞，以SK-OV-3細(xì)胞UCA1和miR-145的表達(dá)變化最為顯著，因此選擇SK-OV-3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 UCA1靶向結(jié)合miR-145Fig.6 UCA1 targeted combinates with miR-145Note:*.P<0.05 vs UCA1-mut group.

圖7 沉默UCA1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of silencing UCA1 on cell proliferation and migration related proteins expressions of ovarian cancer cell

lncRNA UCA1可通過(guò)調(diào)控多種非編碼RNA的表達(dá)影響癌癥發(fā)生發(fā)展。UCA1可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)miR-193a的表達(dá)誘發(fā)非小細(xì)胞肺癌，還可通過(guò)抑制miR-143下調(diào)mTOR/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)己糖激酶2表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的糖代謝[24，25]。研究表明，UCA1還可通過(guò)下調(diào)miR-193誘導(dǎo)遷移蛋白HMGB1表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展[26]。miR-145是抑癌基因，其過(guò)表達(dá)可降低卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，UCA1在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，miR-145在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，UCA1過(guò)表達(dá)可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞miR-145表達(dá)。沉默UCA1可上調(diào)卵巢癌細(xì)胞miR-145表達(dá)，減弱miR-145 inhibitor對(duì)miR-145表達(dá)的抑制作用，提示UCA1和miR-145可能存在靶向調(diào)控關(guān)系。為進(jìn)一步驗(yàn)證UCA1和miR-145的關(guān)系，本研究采用starBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)UCA1和miR-145的靶向關(guān)系。結(jié)果表明，UCA1基因序列上存在miR-145結(jié)合位點(diǎn)，且熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明UCA1和miR-145間存在靶向調(diào)控關(guān)系，提示UCA1可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-145表達(dá)影響卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。UCA1過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)能力，miR-145可通過(guò)調(diào)節(jié)UCA1表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，UCA1也可能通過(guò)ceRNA機(jī)制調(diào)節(jié)miR-145表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游與細(xì)胞增殖遷移相關(guān)基因表達(dá)，影響卵巢癌細(xì)胞增殖遷移。研究表明，下調(diào)miR-145表達(dá)可提高卵巢癌細(xì)胞活性，促進(jìn)FSCN1、CDK6表達(dá)[27,28]。課題組將深入探究UCA1是否與miR-145形成ceRNA，進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞增殖遷移。本實(shí)驗(yàn)僅研究了1種miRNA和lncRNA UCA1的關(guān)系，UCA1是否和其他miRNA有直接或間接的調(diào)控關(guān)系，是否共同影響卵巢癌的生物學(xué)過(guò)程，課題組將進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究提示UCA1 可靶向調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞miR-145 表達(dá)，沉默 UCA1 可通過(guò)誘導(dǎo) miR-145表達(dá)減弱癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，調(diào)控卵巢癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程和惡性行為，有可能成為預(yù)測(cè)卵巢癌進(jìn)展、預(yù)后和監(jiān)測(cè)治療效果的分子標(biāo)志物，為闡明卵巢癌的發(fā)病機(jī)制和防治提供新的思路。