核糖體蛋白在骨肉瘤中的研究進(jìn)展

陸禹嚴(yán)，賀茂林，羅書鉅#

1玉林市第一人民醫(yī)院脊柱骨病外科，廣西 玉林 537000

2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，南寧 530021

骨肉瘤起源于間葉組織，是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，平均年發(fā)病率為4.4/100萬(wàn)[1]，發(fā)病年齡呈雙峰分布，分別于青春期和60歲后達(dá)到峰值。骨肉瘤好發(fā)于長(zhǎng)骨干骺端，包括股骨遠(yuǎn)端、脛骨和肱骨的近端，以惡性程度高、易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)為特征，是兒童和青少年腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[2]。影響骨肉瘤患者預(yù)后的主要因素包括腫瘤部位、轉(zhuǎn)移情況、手術(shù)切除的完整性及對(duì)放化療的組織學(xué)反應(yīng)等。既往骨肉瘤僅依靠手術(shù)治療，5年生存率低于20%[3]，新輔助化療和外科手術(shù)的飛速發(fā)展可使骨肉瘤患者的5年生存率提高至70%[4]，一旦發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率也僅有20%[5-6]。近20年來(lái)，骨肉瘤患者的生存率并沒有進(jìn)一步改善[7]，治療已進(jìn)入瓶頸期，從分子水平闡明骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制、尋找可靠的藥物靶點(diǎn)并研發(fā)安全有效的新型藥物是目前迫切需要解決的問題。

核糖體蛋白是構(gòu)成核糖體的重要成分，在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。核糖體蛋白基因的正常調(diào)控對(duì)核糖體的精確合成和維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)至關(guān)重要。既往研究認(rèn)為，核糖體蛋白只在核糖體形成過程中起到維持核糖體RNA（ribosome RNA，rRNA）特殊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和協(xié)助rRNA正確折疊的作用。研究表明，核糖體蛋白除了參與核糖體的組成外，還與翻譯調(diào)控和正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化等多種核糖體外功能相關(guān)[8-9]。研究者在多種惡性腫瘤中均已發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白基因的突變或表達(dá)模式的變化，包括白血病[10-11]、結(jié)直腸癌[12]、骨肉瘤[13]、胃癌[14]、肺癌及惡性膠質(zhì)瘤[11,15]等，且核糖體蛋白參與了骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移并與骨肉瘤患者的預(yù)后相關(guān)。本文就核糖體蛋白在骨肉瘤中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 核糖體概述和核糖體的異質(zhì)性

核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，主要功能是促使信使RNA（messenger RNA，mRNA）和rRNA的相互識(shí)別，并將mRNA上的核苷酸序列翻譯成多肽鏈上的氨基酸序列。翻譯過程是在核糖體、轉(zhuǎn)移RNA（transfer RNA，tRNA）及多種輔助蛋白質(zhì)的協(xié)助下進(jìn)行的。真核生物的核糖體由60S大亞基和40S小亞基組成。60S大亞基的成分包括5S rRNA、28S rRNA、5.8S rRNA和大約46種核糖體蛋白，而40S小亞基包含18S rRNA和大約33種核糖體蛋白。組成大、小亞基的核糖體蛋白分別稱之為大亞基核糖體蛋白（ribosomal protein large subunit，RPL）和小亞基核糖體蛋白（ribosomal protein small subunit，RPS）。核糖體作為蛋白質(zhì)合成的裝配機(jī)，既往被認(rèn)為是一種靜態(tài)的實(shí)體，但近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越清晰地認(rèn)識(shí)到核糖體存在異質(zhì)性，它的活動(dòng)受到高度調(diào)控，且某些原癌基因蛋白和抑癌因子，如磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱 AKT）、MYC、雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）、p53及RB等，已被證實(shí)調(diào)控了核糖體生物合成或蛋白質(zhì)翻譯起始[16-18]。

導(dǎo)致核糖體異質(zhì)性的機(jī)制是多方面的。為適應(yīng)外部環(huán)境的變化，細(xì)胞可以改變核糖體蛋白的表達(dá)水平或產(chǎn)生不同核糖體蛋白組成成分的核糖體，也可以使rRNA在轉(zhuǎn)錄后或核糖體蛋白在翻譯后的修飾模式發(fā)生變化[9,16-17]。核糖體異質(zhì)性可導(dǎo)致核糖體病甚至形成腫瘤。核糖體病以各種先天性缺陷和腫瘤易感性增加為特征，這類患者體內(nèi)存在核糖體蛋白基因的突變或rRNA轉(zhuǎn)錄后修飾的變化，如Diamond-Blackfan貧血癥中RPS19、RPS17及RPS24基因突變，5q-綜合征中RPS14雜合性缺失及先天性角化不良1（dyskeratosis congenita 1，DKC1）基因突變使rRNA特定位點(diǎn)的假尿嘧啶化修飾異常，這類患者發(fā)展為白血病的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[8]。此外，人類腫瘤中也經(jīng)常出現(xiàn)核糖體蛋白基因的表達(dá)異常，如前列腺癌中RPL7A、RPL19、RPL37的過表達(dá)[19-20]，鼻咽癌中RPL27、RPL37A和RPL41的低表達(dá)[21]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞的核糖體異質(zhì)性尤為突出并可能與腫瘤細(xì)胞的功能相關(guān)，這種差異可能為抗腫瘤治療開辟新的途徑。

2 核糖體蛋白在骨肉瘤中的表達(dá)變化和對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

骨肉瘤中存在糖體蛋白基因的表達(dá)異常已得到多項(xiàng)研究的證實(shí)。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)RPS15A的表達(dá)敲減明顯抑制了人骨肉瘤U2OS細(xì)胞的體外增殖和克隆形成，且明顯增加了G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量。Nagao-Kitamoto等[23]研究證實(shí)，骨肉瘤組織中RPS3的表達(dá)明顯高于正常骨組織，且RPS3在侵襲性骨肉瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平高于非侵襲性骨肉瘤細(xì)胞株，RPS3高表達(dá)與原發(fā)性骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移相關(guān)。RPS3的敲減或過表達(dá)能夠明顯抑制或增加骨肉瘤細(xì)胞的遷移，且GLI2敲減的U2OS細(xì)胞中RPS3表達(dá)顯著下調(diào)，GLI2敲減導(dǎo)致的骨肉瘤細(xì)胞遷移率降低可以通過RPS3過表達(dá)來(lái)恢復(fù)。該研究表明，RPS3作為Hedgehog信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子GLI2的靶基因而參與了骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。Cheng等[24]研究表明，RPS9在骨肉瘤組織和骨肉瘤細(xì)胞株中高表達(dá)且表達(dá)水平與Enngin分期和腫瘤復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)，RPS9低表達(dá)在體外抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖和集落形成能力并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1/S期阻滯，而RPS9高表達(dá)通過激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的增殖。

研究顯示[13]，RPL34在骨肉瘤中的表達(dá)模式發(fā)生了變化，對(duì)11例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織和癌旁組織樣本的定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，63.64%的骨肉瘤組織中RPL34表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)癌旁組織；免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，95例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織標(biāo)本中，78.95%呈RPL34強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，21.05%呈RPL34弱陽(yáng)性表達(dá)，而60例正常骨組織的RPL34均為弱陽(yáng)性表達(dá)；生存分析結(jié)果顯示，RPL34高表達(dá)患者的3年生存率明顯更差。RPL34表達(dá)敲減明顯抑制了人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞的增殖和克隆能力，誘導(dǎo)了Saos-2細(xì)胞的凋亡并將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期?；诩又荽髮W(xué)圣克魯茲分校（University of California Santa Cruz，UCSC）數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)和STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白-蛋白互作分析表明，RPL34基因受原癌基因蛋白MYC的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其編碼的蛋白與真核起始因子3（eukaryotic initiation factor 3，eIF3）的亞基發(fā)生相互作用，這提示RPL34可能通過MYC/RPL34/eIF3亞基信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與骨肉瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控。

核糖體蛋白基因也可以在骨肉瘤中低表達(dá)。Zheng等[25]對(duì)47例骨肉瘤組織、12例骨良性病變組織以及8例正常骨組織樣本的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織和人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中RPL7A的表達(dá)水平明顯低于骨良性病變組織和正常骨組織。RPL7A低表達(dá)與血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）升高相關(guān)，RPL7A低表達(dá)是骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后不良標(biāo)志物。骨肉瘤中RPL7A低表達(dá)可能與9號(hào)染色體上基因的雜合性缺失有關(guān)。

3 核糖體蛋白調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的可能機(jī)制

3.1 核糖體蛋白參與原癌基因或抑癌基因介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

核糖體蛋白參與原癌基因蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最典型例子是RPS6。多種惡性腫瘤患者均存在PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的失調(diào)，骨肉瘤患者常出現(xiàn)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上某些成分的活性異?；蛲蛔僛26-27]，并在骨肉瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和患者的預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮重要作用。PI3K可以被活化的大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）通路、有絲分裂原、生長(zhǎng)因子和應(yīng)力狀態(tài)等多種刺激所激活，活化的PI3K募集并磷酸化激活下游分子AKT，后者主要通過激活MTOR來(lái)調(diào)控mRNA的翻譯。MTOR能夠通過磷酸化的4EBP1和S6K1來(lái)激活eIF4E和RPS6，最終促進(jìn)含5'TOP結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯起始、延長(zhǎng)和細(xì)胞周期的進(jìn)程。這類含5'TOP結(jié)構(gòu)的mRNA包含多種核糖體蛋白、延長(zhǎng)因子和涉及核糖體生成或翻譯調(diào)控的蛋白質(zhì)[17]。腫瘤細(xì)胞的快速增殖需要更多的核糖體成分和更高效的翻譯機(jī)制來(lái)維持，而PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的翻譯調(diào)控機(jī)制可能滿足了腫瘤細(xì)胞的這種需求。

MYC是一種通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄進(jìn)程來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要原癌基因蛋白。參與核糖體和蛋白質(zhì)合成過程的某些成分的編碼基因在轉(zhuǎn)錄水平也受MYC調(diào)控，如核糖體蛋白基因、核糖體生成所需各種因子以及細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)的因子[17]。MYC通過修飾這些因子的表達(dá)而調(diào)控核糖體生成和特定mRNA的翻譯并改變核糖體蛋白和rRNA的總量，導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定和腫瘤的發(fā)生[9]，在MYC過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，表達(dá)上調(diào)的基因絕大部分是參與核糖體大小亞基構(gòu)成的核糖體蛋白基因[28-30]。此外，MYC還可以通過富集eIF4E、eIF4G、eIF4A和eIF3的亞基來(lái)上調(diào)核糖體蛋白基因的表達(dá)并促進(jìn)核糖體蛋白與翻譯起始因子的相互作用[9]。這與MYC/RPL34/eIF3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞增殖調(diào)控的研究推測(cè)相一致[13]。近年來(lái)已有研究表明，eIF3的不同亞基eIF3b、eIF3c和eIF3h與骨肉瘤細(xì)胞的增殖或凋亡相關(guān)[31-33]。因此，調(diào)控蛋白質(zhì)合成可能是MYC調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和驅(qū)動(dòng)腫瘤生成的重要機(jī)制。

包括骨肉瘤在內(nèi)的約50%的人類惡性腫瘤中存在腫瘤抑制基因p53的突變或缺失[34]。在MYC等原癌基因異?；罨蚝颂求w蛋白基因突變、rRNA合成抑制導(dǎo)致核糖體生成障礙等應(yīng)激條件下，部分核糖體蛋白以游離的形式增多（如RPL5和RPL11）并與鼠雙微體2同系物（mouse double minute 2 homolog，MDM2）相互作用從而抑制了MDM2對(duì)p53的泛素化降解，p53的穩(wěn)定和活化最終誘導(dǎo)了細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和自噬、DNA損傷修復(fù)、腫瘤生成抑制；此外，腫瘤抑制因子p14ARF也可以通過RP與MDM2結(jié)合而抑制其介導(dǎo)的p53泛素化降解[8]。因此，RP/MDM2/p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抑制腫瘤生成中發(fā)揮了重要作用，但骨肉瘤細(xì)胞中何種核糖體蛋白基因突變或表達(dá)異常導(dǎo)致RP/MDM2/p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失調(diào)進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤的生成和進(jìn)展仍需要更多試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)證實(shí)。

3.2 參與腫瘤相關(guān)特定基因的翻譯起始調(diào)控

翻譯過程包括起始、延長(zhǎng)、終止和再循環(huán)4個(gè)階段，起始是限速步驟和涉及翻譯調(diào)控的主要步驟。在翻譯起始階段，40S小亞基需要多種eIF的協(xié)助才能與mRNA結(jié)合。首先是mRNA的5'帽結(jié)構(gòu)與 eIF4E結(jié)合，后者再與eIF4G結(jié)合并通過 eIF3的橋接作用將mRNA定位于40S小亞基上，從而起始翻譯。起始因子eIF4E、eIF4G和eIF4A共同構(gòu)成三聚復(fù)合物eIF4F。這種依賴eIF4F和5'帽結(jié)構(gòu)的翻譯大約占細(xì)胞內(nèi)總翻譯的90%。MYC過表達(dá)能夠促進(jìn)eIF4F的形成，而激活的eIF4F能夠極大地刺激與腫瘤調(diào)控相關(guān)并依賴5'帽結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯[31]。但這種調(diào)控機(jī)制是否涉及起始因子與核糖體蛋白的相互作用仍未明確，如MYC是否可能通過調(diào)控RPL34的轉(zhuǎn)錄及RPL34與eIF3亞基的相互作用而影響骨肉瘤細(xì)胞增殖相關(guān)mRNA的翻譯[13]，目前仍不清晰。此外，在核糖體蛋白基因突變或表達(dá)異常導(dǎo)致核糖體壓力、有絲分裂原刺激和營(yíng)養(yǎng)壓力等應(yīng)激條件下，5'帽結(jié)構(gòu)依賴的翻譯機(jī)制受到抑制，細(xì)胞可以利用特定mRNA 5'端的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry sites，IRES）來(lái)促進(jìn)mRNA與40S小亞基的結(jié)合而起始翻譯過程[35-36]。雖然IRES介導(dǎo)的翻譯只占細(xì)胞內(nèi)總翻譯的10%，但MYC、p53和p27Kip1等腫瘤相關(guān)基因mRNA的5'端也包含IRES[37-38]，這表明IRES依賴的翻譯可能是腫瘤細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的重要翻譯機(jī)制。因此，靶向作用于翻譯起始是一種潛在的腫瘤治療策略。

3.3 調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程

細(xì)胞周期檢查點(diǎn)是保證DNA復(fù)制和染色體分配的質(zhì)量、維持基因組穩(wěn)定的重要機(jī)制，主要包括G1/S期檢查點(diǎn)、S期檢查點(diǎn)和G2/M期檢查點(diǎn)等。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，任何原因引起的異常事件如DNA損傷等，將導(dǎo)致細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的激活，進(jìn)而中斷細(xì)胞周期的進(jìn)程并進(jìn)行修復(fù)，如損傷無(wú)法修復(fù)，細(xì)胞將啟動(dòng)凋亡程序并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。骨肉瘤細(xì)胞中核糖體蛋白表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致的核糖體合成異常已被證實(shí)是細(xì)胞周期進(jìn)程中的異常事件而阻滯了細(xì)胞周期[13,24]。RB、p53在G1/S期和G2/M期檢查點(diǎn)的正常調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但骨肉瘤細(xì)胞中存在RB、p53的突變或表達(dá)缺乏[39-40]，導(dǎo)致細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)控功能喪失，使核糖體蛋白表達(dá)異常的腫瘤細(xì)胞能夠避開檢查點(diǎn)的監(jiān)督而繼續(xù)進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，最終令無(wú)限增殖成為可能[41]。

4 小結(jié)與展望

雖然有原癌基因蛋白和腫瘤抑制因子已被發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄或翻譯起始水平調(diào)控了核糖體蛋白基因的表達(dá)進(jìn)而影響了骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，而且這種潛在的機(jī)制可能是通過靶向特定的mRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。但在骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)連接原癌基因蛋白或腫瘤抑制因子、核糖體蛋白與轉(zhuǎn)錄和翻譯起始以及細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的分子機(jī)制仍需要更多令人信服的研究來(lái)闡明。靶向作用于核糖體蛋白從而抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成可能是一種具有重大意義的抗腫瘤治療策略?？梢灶A(yù)見的是，當(dāng)那些能夠被利用成為治療靶點(diǎn)的核糖體蛋白得到充分認(rèn)識(shí)后，更有效的骨肉瘤靶向治療藥物的研發(fā)將成為可能。