兔VX2骨腫瘤模型中IFN-γ、IL-4和PCNA的表達(dá)及關(guān)系

呂家興 白磊鵬 曹海營 孔令偉 李哲宏 金 宇

VX2腫瘤起源于Shope病毒誘發(fā)兔外陰乳頭狀瘤衍生的鱗狀細(xì)胞上皮癌，種植于兔骨骼可進(jìn)行性破壞骨髓及骨皮質(zhì)并出現(xiàn)骨膜反應(yīng)，與人類惡性骨腫瘤生物學(xué)行為相似，對于研究惡性骨腫瘤的生長特性有極為重要的價值，目前已廣泛應(yīng)用于惡性骨腫瘤的動物實驗研究[1]。輔助性T細(xì)胞(T helper cells，Th)在不同細(xì)胞因子的作用下可主要分為Th1和Th2兩種亞群，Th1細(xì)胞亞群主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，分泌IFN-γ、IL-2等因子，Th2細(xì)胞亞群主要調(diào)節(jié)體液免疫,分泌IL-4、IL-10等因子[2]。PCNA稱為周期性蛋白,可有效反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性及判斷腫瘤的惡性程度、侵襲性及轉(zhuǎn)移能力，是目前公認(rèn)的細(xì)胞增殖基因之一[3]。但目前關(guān)于IFN-γ、IL-4及PCNA在兔VX2骨腫瘤模型中的表達(dá)情況報道較少。因此，本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)進(jìn)行定量分析，探討兔VX2骨腫瘤模型外周血中IFN-γ和IL-4及骨腫瘤組織中IFN-γ、IL-4和PCNA的表達(dá)水平及三者之間的相關(guān)性。

材料與方法

1.實驗動物、瘤系、儀器及試劑：30只日本大耳白兔，月齡3個月，均為雄性，體質(zhì)量2.0～2.5kg，購自北京市昌揚西山養(yǎng)殖場，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0007，所有實驗動物隔籠圈養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)兔飼料及衛(wèi)生水飼養(yǎng),符合承德醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)相關(guān)規(guī)定；VX2腫瘤購自重慶蒙博生物科技有限公司；X線檢測機(OEC9800，美國GE公司)，光學(xué)顯微鏡(Olympus-BX53，日本Olympus公司)，全波長酶標(biāo)儀(Multiskan FC，美國Thermo Fisher公司)；IFN-γ、IL-4及PCNA ELISA試劑盒購自河北瑞帕特生物科技有限公司。本實驗動物使用流程已通過承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院機構(gòu)動物護(hù)理與使用委員會的審查和批準(zhǔn)，遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

2.制備VX2腫瘤組織塊：取VX2荷瘤種兔1只，3%戊巴比妥(35mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉后，取仰臥位固定于無菌操作臺上，瘤區(qū)備皮消毒后逐層切開，將腫瘤組織完全去除，放置于磷酸鹽緩沖液中，仔細(xì)去除周圍纖維結(jié)締組織及壞死組織，留取魚肉狀組織，在無菌條件下將腫瘤組織制備成1mm×1mm×1mm的組織塊。

3.實驗動物分組及構(gòu)建動物模型：30只日本大耳白兔隨機分為實驗組和對照組，每組各15只。將30只日本大耳白兔經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥(35mg/kg)麻醉后，仰臥位固定于無菌操作臺上，去除兔后肢毛發(fā)，常規(guī)消毒后，鋪無菌孔單，選擇脛骨內(nèi)側(cè)較平整處作1.5cm長切口，逐層切開皮膚、皮下組織顯露脛骨，選用1.6mm克氏針垂直于脛骨內(nèi)側(cè)鉆孔，鉆入骨髓腔深度約1.5cm，實驗組用頂棒將2～3塊VX2腫瘤組織塊置入骨髓腔，對照組不植入VX2腫瘤，骨蠟封堵植瘤孔，蒸餾水沖洗植瘤孔周圍組織，絲線逐層縫合，碘伏消毒后無菌紗布包扎，家兔完全復(fù)蘇后送回飼養(yǎng)籠，術(shù)后3天肌內(nèi)注射抗生素預(yù)防感染。

4.外周血及組織ELISA檢測：2組實驗兔植瘤2周后抽取耳緣靜脈血3ml，抽取血液于室溫下靜置待血清析出；實驗組留取的腫瘤組織稱重后加入磷酸鹽緩沖液(1mg∶9ml)溶液并充分勻漿，均以2000r/min離心10min后收集上清液于-80℃低溫冰箱凍存。所有上清液收集完成后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測IFN-γ、IL-4及PCNA的濃度。

5.脛骨X線及組織病理檢查：植瘤后第1、2周行脛骨X線檢查，觀察腫瘤生長情況；兩組實驗兔采集外周血后經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞法處死并切取腫瘤組織、植瘤孔周圍軟組織，觀察腫瘤組織大體形態(tài)，予以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片經(jīng)蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)形態(tài)。

結(jié) 果

1.動物模型構(gòu)建情況：2組實驗兔在實驗過程中無實驗動物感染及死亡現(xiàn)象，處死后經(jīng)病理證實腫瘤均種植成功。

2.IFN-γ、IL-4及PCNA表達(dá)水平：實驗組外周血及腫瘤組織IFN-γ表達(dá)水平低于對照組(P<0.05)，外周血及腫瘤組織表達(dá)IL-4水平高于對照組(P<0.05)，實驗組PCNA表達(dá)水平高于對照組(P<0.05,表1)。

組別 對照組實驗組tP外周血IFN-γ(ng/ml)736.9±23.0698.0±33.0-3.7410.001外周血IL-4(ng/ml)158.2±16.4207.6±24.76.449<0.01腫瘤組織IFN-γ(ng/ml)782.5±33.6747.6±37.4-2.6860.012腫瘤組織IL-4(ng/ml)83.7±5.396.8±8.05.288<0.01腫瘤組織PCNA(ng/L)69.6±2.685.8±4.013.031<0.01

3.相關(guān)性分析結(jié)果：實驗組外周血與腫瘤組織IFN-γ的水平呈正相關(guān)(r=0.737，P=0.002)，外周血與腫瘤組織IL-4的水平呈正相關(guān)(r=0.869，P<0.01)；外周血及腫瘤組織的IFN-γ與IL-4的水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.537，P=0.039；r=-0.812，P<0.01)。實驗組外周血及腫瘤組織IFN-γ與腫瘤組織PCNA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.604，P=0.017；r=-0.785，P=0.001)，外周血及腫瘤組織IL-4與腫瘤組織PCNA呈正相關(guān)(r=0.884，P<0.01；r=0.846，P<0.01)。

4.脛骨植瘤第1、2周X線檢測：植瘤第1周腫瘤于髓腔內(nèi)生長速度緩慢，破壞面積??；植瘤第2周腫瘤生長速度增快，髓腔破壞面積增大，可見骨皮質(zhì)輕度破壞(圖1)。

圖1 實驗組每周脛骨X線A.植瘤第1周；B.植瘤第2周；箭頭示植瘤

5.脛骨大體觀及病理檢測結(jié)果：脛骨解剖縱切面可見魚肉狀VX2腫瘤位于脛骨上端，髓腔腫瘤增大但未見明顯液化壞死(圖2A)；病理結(jié)果顯示低倍鏡下可脛骨髓腔及骨質(zhì)內(nèi)腫瘤細(xì)胞呈浸潤性巢狀，呈片狀分布，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞異型性大，周圍軟組織未見明顯異常；高倍鏡下可見腫瘤細(xì)胞大小不等、形態(tài)不一，胞界不清，核大，染色質(zhì)豐富呈粗顆粒狀，核仁明顯，核分裂象多見(圖2B～E)。

圖2 脛骨大體觀及腫瘤組織病理改變A.脛骨縱切面大體觀；B.脛骨髓腔腫瘤細(xì)胞(HE，×40)；C.脛骨骨質(zhì)腫瘤細(xì)胞(HE，×40)；D.脛骨骨質(zhì)腫瘤細(xì)胞(HE，×100)；E.周圍軟組織(HE，×40)；箭頭示植瘤

討 論

合適的骨腫瘤動物模型對于研究骨腫瘤的生物學(xué)特性以及檢驗和改進(jìn)骨腫瘤治療新方式具有重要意義。在大鼠及小鼠上可誘發(fā)骨腫瘤，但該動物骨骼較小以及骨骼的礦化度高于人體骨，需特殊定制操作器械，導(dǎo)致操作結(jié)果無法與人體骨骼比較，同時也不利于骨的大體和微觀骨形態(tài)觀察。在豬、羊、犬等大型動物上由于目前不存在相匹配的骨腫瘤細(xì)胞系，同樣不適合本研究的腫瘤模型制作[4]。而兔具有相對適中的骨骼，可使用與人骨骼相同的材料，并且骨的成分與密度與人骨骼相似，將VX2腫瘤直接移植于兔脛骨即可制作成兔VX2骨腫瘤模型，該模型制作簡單、周期短、生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、成瘤率高，發(fā)生類似于人轉(zhuǎn)移性骨腫瘤的溶骨性改變和骨膜反應(yīng)，是目前研究惡性骨腫瘤較為理想的實驗動物[5]。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及本研究預(yù)實驗結(jié)果，采用腫瘤組織塊法構(gòu)建兔VX2骨腫瘤模型2周內(nèi)腫瘤生長穩(wěn)定，在14～21天腫瘤組織因血供不足可發(fā)生液化性壞死并向周圍組織浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故本研究選擇在植瘤后2周進(jìn)行外周血及腫瘤組織ELISA檢測，避免因腫瘤發(fā)生壞死或轉(zhuǎn)移影響實驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性[6]。

IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子的關(guān)鍵因子，可活化T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer clle，NK)和巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)其分化，上調(diào)P21受體的表達(dá)并促進(jìn)Rb磷酸化，誘導(dǎo)G1期阻滯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，與鈣調(diào)磷酸酶B亞基發(fā)揮協(xié)同作用，促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)化，增強巨噬細(xì)胞抗腫瘤活性，改善腫瘤微環(huán)境，并能誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的增殖及分化，增強機體免疫的抗腫瘤能力[7～9]。IL-4是Th2最特異的細(xì)胞因子，能下調(diào)Th1細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制Th1分泌IFN-γ，使IFN-γ對NK細(xì)胞的活化作用及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)對腫瘤抗原的識別能力降低，使腫瘤細(xì)胞可逃避特異性CTL的殺傷作用，還能直接作用于CD8+T細(xì)胞，降低其對腫瘤細(xì)胞的毒性，增加調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞和髓系來源的抑制細(xì)胞，并對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞增殖起重要作用，促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞等抑制免疫細(xì)胞的產(chǎn)生[10,11]。

本研究中實驗組外周血及腫瘤組織IFN-γ表達(dá)水平較對照組下降，IL-4表達(dá)水平較對照組上升(P<0.01)，而脛骨X線顯示植瘤第2周髓腔破壞面積明顯大于植瘤第1周，病理結(jié)果顯示植瘤第2周腫瘤向骨皮質(zhì)浸潤，筆者認(rèn)為可能是植入VX2腫瘤后機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)未被完全抑制，IFN-γ會抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但隨著VX2腫瘤于兔體內(nèi)植入時間的延長，VX2腫瘤會以自分泌的方式產(chǎn)生大量IL-4以及通過腫瘤細(xì)胞上的IL-4受體介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖，IL-4的表達(dá)水平增加會抑制抗原呈遞作用，抑制IFN-γ的增殖及Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，IFN-γ的減少會降低對CTL及NK細(xì)胞的活化作用，介導(dǎo)機體的細(xì)胞毒效應(yīng)降低，并且IL-4會誘導(dǎo)更多的Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，抑制Th0細(xì)胞向Thl細(xì)胞分化，機體腫瘤免疫調(diào)節(jié)受到抑制，腫瘤增殖及浸潤能力增強[12，13]。

PCNA表達(dá)水平的高低可提示腫瘤細(xì)胞增殖是否活躍，客觀反映腫瘤生物學(xué)特性及生長狀態(tài)[14]。PCNA在細(xì)胞內(nèi)的變化存在周期性，在靜止期G0～G1期表達(dá)不明顯，G1晚期開始表達(dá)，到S期達(dá)到高峰，在G2/M期明顯下降，并且是DNA聚合酶δ的輔助蛋白及DNA復(fù)制必需的組分，在細(xì)胞增殖時參與協(xié)調(diào)DNA前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成，是DNA增殖的重要調(diào)控因子[15，16]。本研究結(jié)果顯示，構(gòu)建兔VX2骨腫瘤模型2周后實驗組腫瘤組織PCNA表達(dá)水平高于對照組(P<0.01)，結(jié)合脛骨X線及病理結(jié)果表明PCNA可反映VX2骨腫瘤的生長情況，也間接佐證了VX2腫瘤作為一種惡性程度較高、復(fù)制能力較強的鱗狀細(xì)胞腫瘤，降低了模型制作時間，是一種理想的骨腫瘤模型。

細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞間生長相互抑制的失衡是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素，而腫瘤免疫調(diào)節(jié)的抑制會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖及發(fā)生轉(zhuǎn)移[17]。本研究中IFN-γ與IL-4、PCNA呈負(fù)相關(guān)，IL-4與PCNA呈正相關(guān)，說明IL-4與PCNA可能在VX2骨腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有促進(jìn)作用，IFN-γ抑制腫瘤增殖的作用可能受到影響。筆者認(rèn)為出現(xiàn)這種情況是因為IFN-γ可上調(diào)P21受體的表達(dá)并促進(jìn)Rb磷酸化，誘導(dǎo)G1期阻滯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但腫瘤細(xì)胞可通過自分泌形式分泌IL-4以及生成IL-4受體，誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化增加，Th1細(xì)胞減少，使IFN-γ的表達(dá)水平降低，導(dǎo)致IFN-γ抑制腫瘤增殖及促進(jìn)腫瘤凋亡的功能降低[18]。并且隨著IFN-γ表達(dá)水平的降低，在腫瘤細(xì)胞增殖G1期的抑制作用減弱，PCNA在G1期的表達(dá)會呈上升趨勢，進(jìn)一步增強了VX2腫瘤的增殖及復(fù)制能力，腫瘤細(xì)胞分泌的IL-4不斷增加使IFN-γ的表達(dá)水平不斷降低[19，20]。

綜上所述，兔VX2骨腫瘤模型增殖迅速，惡性程度高，導(dǎo)致IFN-γ表達(dá)水平的降低及IL-4、PCNA表達(dá)水平的上升，機體腫瘤免疫功能抑制腫瘤增殖及促進(jìn)凋亡的作用降低，腫瘤生長速度及侵襲性不斷增強。因此，檢測IFN-γ、IL-4及PCNA的表達(dá)水平并協(xié)同分析有利于分析該動物模型的腫瘤免疫調(diào)節(jié)及腫瘤增殖情況，為今后以兔VX2骨腫瘤模型為載體進(jìn)行相關(guān)治療研究時驗證其治療效果提供依據(jù)。