白芍總苷對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦保護(hù)作用的研究

王 麗

腦血管病具有高發(fā)生率、高致殘率和高致死率，流行病學(xué)調(diào)查顯示，腦血管病在世界范圍內(nèi)60歲以上人群中居致死疾病譜第2位，在我國居首位，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1, 2]。腦血管病患者中約85%為缺血性腦病，即腦血流障礙導(dǎo)致腦組織局部缺血性壞死，其疾病進(jìn)展過程涉及氧化應(yīng)激、鈣超載、細(xì)胞凋亡等多種病理機(jī)制[3～6]。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是從毛茛科植物芍藥的干燥根(中藥白芍)中提取的一類活性化合物，包括芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TGP具有良好的抗氧化、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等多種藥理學(xué)作用[7, 8]。本研究將探討TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦組織的保護(hù)作用。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：240只無特定病原微生物級(jí)雄性SD大鼠，7周齡，體質(zhì)量240±20g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004；適應(yīng)性飼養(yǎng)1周(12h晝夜交替，室溫25±1℃)后開展實(shí)驗(yàn)。按數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平(nimodipine，NMP)10mg/(kg·d)組和TGP 50、100、200mg/(kg·d)組，每組40只。

2.藥物與試劑：TGP膠囊(寧波立華制藥有限公司，規(guī)格0.3克/粒)；NMP膠囊(浙江海力生制藥有限公司，規(guī)格：20毫克/粒)；伊文思藍(lán)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氧化應(yīng)激指標(biāo)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TUNEL染色試劑盒(北京博奧森生物科技有限公司)。

3.給藥與模型制備：(1)給藥：精確稱取TGP膠囊與NMP膠囊內(nèi)容物并分別加入適量0.9%氯化鈉注射液制備濃度10、20、40mg/ml的TGP溶液和濃度2mg/ml的NMP溶液；TGP 50、100、200mg/(kg·d)組于造模前7天開始分別1次/天給予濃度為10、20、40mg/ml的TGP溶液(5ml/kg)灌胃，NMP 10mg/(kg·d)組給予2mg/ml的NMP溶液灌胃，假手術(shù)組和模型組分別同步給予0.9%氯化鈉注射液(5ml/kg)。(2)模型制備：參照王新鳳等[9]的報(bào)道采用線栓堵塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈的方法制備缺血性腦損傷大鼠模型；假手術(shù)組除不插入線栓外，其余操作同模型組。造模術(shù)后24h行各指標(biāo)檢測(cè)。

4.神經(jīng)功能評(píng)估與腦組織BBB通透性檢測(cè)：(1)每組大鼠隨機(jī)取10只，由兩位經(jīng)過相關(guān)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員參照Zausinger等[10]報(bào)道的六分法獨(dú)立進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，取平均值。(2)尾靜脈注射4ml/kg伊文思藍(lán)溶液(濃度2%)，1h后麻醉、開胸、由左心室-右心耳通路快速灌注300ml 0.9%氯化鈉注射液，斷頭取右側(cè)大腦，研磨勻漿后加3倍量50%的甲酰胺溶液，60℃孵育24h后3000r/min離心10min取上清液，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)610nm波長處吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算伊文思藍(lán)含量，伊文思藍(lán)含量可反映BBB通透性。

5.腦組織含水量測(cè)定：各組另隨機(jī)取10只大鼠，麻醉后斷頭取腦、稱量右側(cè)腦組織(W濕)，110℃烘烤至恒重后稱重(W干)，含水量(%)=[(W濕-W干)/W濕]×100%

6.腦組織病理學(xué)檢查和神經(jīng)細(xì)胞凋亡觀察：各組另隨機(jī)取10只大鼠，麻醉后，由左心室-右心耳通路灌注300ml 0.9%氯化鈉注射液、300ml 4%多聚甲醛溶液，斷頭取腦、置4%多聚甲醛溶液固定72h，行石蠟包埋、切片、梯度乙醇脫蠟。行HE染色，梯度乙醇脫水后中性樹膠封片，通過光學(xué)顯微鏡觀察腦組織病理學(xué)改變；按照TUNEL試劑盒操作說明處理，封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察，凋亡指數(shù)(AI)計(jì)算：每張切片于缺血區(qū)皮質(zhì)隨機(jī)選取5個(gè)互不重疊的視野計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值，AI(%)=(陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

7.腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)：取各組剩余10只大鼠，麻醉后斷頭取腦，于冰上切取右側(cè)大腦、剪碎后加入9倍量4℃冷裂解液研磨勻漿，3000r/min離心10min后取上清液，然后采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性、高錳酸鉀滴定法測(cè)定CAT活性、硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較行單因素方差分析，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能和BBB通透性的影響：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Zausinger評(píng)分顯著降低、伊文思藍(lán)滲透量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TGP 100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)組Zausinger評(píng)分顯著升高、伊文思藍(lán)滲透量顯著降低(P<0.05)；與NMP 10mg/(kg·d)組比較，TGP 200mg/(kg·d)組Zausinger評(píng)分升高且伊文思藍(lán)滲透量降低(P<0.05)，詳見表1。

2.TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦含水量的影響：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織含水量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TGP 100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)組腦組織含水量顯著降低(P<0.05)；TGP 200mg/(kg·d)組腦含水量與NMP 10mg/(kg·d)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

3.TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦組織病理學(xué)改變的影響：假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常；模型組大鼠腦組織皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減少、排列疏松、間隙增大、胞核固縮、胞質(zhì)著色不均勻、出現(xiàn)空泡性改變等病理學(xué)改變；TGP 50、100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)組上述病理學(xué)改變呈不同程度改善，其中TGP 200mg/(kg·d)組效果相對(duì)較優(yōu),詳見圖1。

圖1 TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦組織病理學(xué)改變的影響(HE，×200)A.假手術(shù)組；B.模型組；C.TGP 50mg/(kg·d)預(yù)處理組；D.TGP 100mg/(kg·d)預(yù)處理組；E.TGP 200mg/(kg·d)預(yù)處理組；F.NMP 10mg/(kg·d)預(yù)處理組

4.TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響：假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)僅可見極少量凋亡細(xì)胞；模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，AI顯著高于假手術(shù)組(49.26%±7.13% vs 2.81%±0.57%，P<0.01)；與模型組比較，TGP 50、100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)組AI顯著降低(42.51%±5.60%、34.09%±4.82%、22.58%±3.94%、26.91%±4.16% vs 49.26%±7.13%，P<0.05)；與NMP 10mg/(kg·d)組比較，TGP 200mg/(kg·d)組AI顯著降低(22.58%±3.94% vs 26.91%±4.16%，P<0.05)，詳見圖2。

5.TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOD、CAT活性顯著降低且MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TGP 100、200mg/(kg·d)組和NMP 10mg/(kg·d)組SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低(P<0.05)；與NMP 10mg/(kg·d)組比較，TGP 200mg/(kg·d)組SOD活性顯著升高且MDA含量顯著降低(P<0.05)，詳見表2。

圖2 TGP預(yù)處理對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL，×200)A.假手術(shù)組；B.模型組；C.TGP 50mg/(kg·d)預(yù)處理組；D.TGP 100mg/(kg·d)預(yù)處理組；E.TGP 200mg/(kg·d)預(yù)處理組；F.NMP 10mg/(kg·d)預(yù)處理組

討 論

人大腦重量約占體重的2.5%～3.0%，卻約占全身耗氧量的25%，腦缺血5min以上即可出現(xiàn)不可逆損傷，最終致殘甚至致死。所以，高危人群預(yù)防及發(fā)病后及早治療以減輕缺血早期腦組織損傷對(duì)降低病死率、改善預(yù)后具有重要意義。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腦組織供血不足將導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙、ATP合成受阻而引發(fā)活性氧簇(ROS)大量生成，既往研究發(fā)現(xiàn)，通過藥物抑制氧化應(yīng)激對(duì)缺血性腦損傷大鼠具有一定的保護(hù)作用[11～13]。TGP為中藥白芍的主要活性成分，具有良好的抗氧化、抗凋亡作用，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TGP預(yù)處理能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能缺損，抑制腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)病變和神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提示TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦組織具有保護(hù)作用。

BBB主要是由內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白、骨架蛋白等相互作用形成的三維網(wǎng)狀超微結(jié)構(gòu)，能夠阻止有害高分子物質(zhì)由血管進(jìn)入腦組織，對(duì)維持中樞神經(jīng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義[14]。BBB通透性升高是血管源性腦水腫的主要原因，而腦水腫是缺血性腦病致殘、致死的重要病理基礎(chǔ)[15, 16]。生理狀態(tài)下伊文思藍(lán)不能通過BBB，但當(dāng)BBB結(jié)構(gòu)受損、通透性升高時(shí)伊文思藍(lán)則可進(jìn)入腦組織，所以伊文思藍(lán)滲透量能夠反映BBB通透性[17]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TGP預(yù)處理能夠抑制腦組織伊文思藍(lán)含量和含水量的升高，提示TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠BBB通透性具有保護(hù)作用，對(duì)腦水腫具有抑制作用。

腦組織血氧供應(yīng)不足導(dǎo)致ROS大量生成，以ROS為底物的還原酶SOD、CAT過度消耗，致使ROS過剩而攻擊核酸、蛋白質(zhì)等產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的MDA[18]。此外，ROS將攻擊細(xì)胞骨架，破壞BBB結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其通透性升高[19, 20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TGP預(yù)處理能夠抑制SOD、CAT活性的降低和MDA含量的升高，提示TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷具有抑制作用。

綜上所述，TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦組織具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激、保護(hù)BBB通透性、抑制腦水腫有關(guān)。