HPV-DNA及TCT檢測(cè)在宮頸癌早期診斷中的應(yīng)用

楊飛翔 江俊青 羅克鍇 趙 錚

宮頸癌(cervical cancer) 常發(fā)生于子宮頸腺上皮部位或鱗狀上皮部位，是臨床最常見的婦科惡性腫瘤之一[1,2]。我國(guó)作為宮頸癌高發(fā)地區(qū)，每年新發(fā)宮頸癌病例數(shù)約占全球總病例的28%，病死率也約占全世界的1/3[3，4]。目前，宮頸癌篩查方法主要有肉眼觀察法、TCT檢測(cè)、HPV-DNA檢測(cè)、mRNA檢測(cè)、DNA倍體分析、陰道鏡活檢等，TCT檢測(cè)對(duì)宮頸癌的早期預(yù)防和篩查具有一定的意義，其操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，對(duì)于宮頸細(xì)胞瘤變具有較高的特異性[5，6]。研究發(fā)現(xiàn)HPV病毒持續(xù)感染宮頸上皮細(xì)胞是宮頸癌發(fā)生必要條件，而HPV-DNA對(duì)于宮頸癌早期診斷具有較高敏感度[7]。本研究旨在探討TCT、HPV-DNA單一和聯(lián)合檢測(cè)在宮頸癌早期篩查中的價(jià)值及優(yōu)勢(shì)。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選取2018年1月～2019年12月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院婦科行宮頸疾病篩查患者作為研究對(duì)象，同時(shí)行TCT、HPV-DNA和陰道鏡下活檢病例215例，以病理學(xué)結(jié)果為確診標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行回顧性分析。所有入選人員均有性生活，檢查時(shí)處于非月經(jīng)期、非妊娠期、無(wú)免疫性疾病及口服免疫抑制劑史、既往無(wú)婦科惡性腫瘤診斷史、無(wú)子宮切除術(shù)和宮頸手術(shù)史、無(wú)陰道用藥史，年齡為21～70歲的已婚女性。所有患者均簽署知情同意書。

2.主要儀器與試劑：液基細(xì)胞學(xué)制片分析系統(tǒng)、美國(guó)AB公司7500 PCR儀、中高速離心機(jī)、潮州凱普HPV基因分型檢測(cè)試劑盒等。

3.TCT檢測(cè)及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：采集前1天無(wú)性生活，標(biāo)本采集由婦產(chǎn)科醫(yī)師進(jìn)行，采用專用取樣刷于宮頸管內(nèi)口順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5～6圈，將宮頸移行帶區(qū)脫落細(xì)胞裝入配套的專用保存液中送檢。同時(shí)采集兩份，一份做TCT檢測(cè)，一份做HPV-DNA檢測(cè)。TCT檢測(cè)采用2001版國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)推薦的TBS系統(tǒng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)[8]。由兩名病理醫(yī)師對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀并符合，結(jié)果包括未見上皮病變或惡性細(xì)胞即nILM；無(wú)明確診斷意義的非典型鱗狀細(xì)胞即ASCUS；低度鱗狀上皮內(nèi)病變即LSIL；高度鱗狀上皮內(nèi)病變即HSIL；癌變包括鱗狀上皮細(xì)胞癌(SCC)、不典型腺上皮細(xì)胞/腺癌。TCT檢測(cè)異常是指ASCUS及以上病變。

4.HPV-DNA分析：采用潮州凱普公司的PCR+膜雜交法檢測(cè)HPV核酸，其中高危包括HPV16、18、31、33等共15種，低危包括HPV6、11等共6種。操作步驟及方法按相應(yīng)試劑說(shuō)明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；95℃變性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。雜交檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性點(diǎn)為清晰可見的藍(lán)紫色原點(diǎn)，根據(jù)膜條HPV分布圖，判斷HPV結(jié)果及其分型。本試劑盒中HPV分型中任一亞型檢測(cè)陽(yáng)性視為患者HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果異常。

5.陰道鏡宮頸組織病理活檢：檢測(cè)前1天無(wú)性生活，陰道沖洗及上藥，在婦科醫(yī)師指導(dǎo)下進(jìn)行陰道鏡檢查，充分暴露宮頸陰道部、擦凈陰道及宮頸分泌物，使用陰道鏡對(duì)可疑部位進(jìn)行多點(diǎn)取材，如未發(fā)現(xiàn)異常則在宮頸3、6、9、12點(diǎn)4處取材，組織標(biāo)本用1%甲醛溶液固定后送病理學(xué)檢測(cè)。由高年資病理醫(yī)師做最后組織病理學(xué)診斷，組織病理學(xué)結(jié)果包括正常或慢性炎癥、宮頸上皮細(xì)胞瘤變(CIN)Ⅰ～Ⅲ級(jí)及宮頸癌(浸潤(rùn)性鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、其他宮頸細(xì)胞癌)。組織學(xué)陽(yáng)性指高級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞瘤變，即≥宮頸上皮內(nèi)瘤變CINⅡ者為陽(yáng)性。組織學(xué)陰性指正常、慢性炎癥、尖銳濕疣、CINⅠ。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料計(jì)算百分比(%)，組間比較采用χ2進(jìn)行分析，計(jì)算敏感度、特異性、陰性預(yù)測(cè)率值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HPV-DNA、TCT檢測(cè)及宮頸組織病理結(jié)果分析:12685例HPV-DNA檢測(cè)，其中1139例HPV-DNA陽(yáng)性，陽(yáng)性率為8.98%。同時(shí)行HPV-DNA、TCT檢測(cè)及陰道鏡下宮頸組織細(xì)胞活檢患者215例，TCT檢測(cè)異常169例，占78.60%，其中ASCUS 109例，LSIL 22例，HSIL 37例，SCC 1例；HPV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性患者156例，占72.56%(156/215)，其中ASCUS 57例，LSIL 18例，HSIL 34例，SCC 1例。HPV陽(yáng)性組與HPV陰性組對(duì)于CINⅡ及以上的檢出率分別為31.41%(49/156)和10.17%(6/59)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.145，P=0.001)。HPV-DNA陽(yáng)性在正?；蜓装Y組、CINⅠ組、CIN Ⅱ/Ⅲ組、宮頸癌組中組織學(xué)陽(yáng)性檢出率分別為55.79%(53/95)、83.08%(54/65)、88.00%(44/50)、100.0%(5/5)，隨著宮頸細(xì)胞瘤變及細(xì)胞學(xué)異常級(jí)別的增加，HPV陽(yáng)性率也逐漸增加，同樣HPV-DNA陽(yáng)性率隨著宮頸細(xì)胞學(xué)異常程度的增加而升高，ASCUS、LSIL、HSIL、SCC組中HPV-DNA陽(yáng)性率分別為52.29%(57/109)、81.82%(18/22)、91.89%(34/37)、100%(1/1)，詳見表1、表2。215例患者中，TCT異常169例，占78.60%(169/215)，TCT≥HSIL對(duì)于CINⅡ及以上的檢出率為76.32%(29/38)，顯著高于TCT

表1 HPV-DNA及TCT檢測(cè)及宮頸組織活檢結(jié)果

表2 215例患者HPV-DNA、TCT檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)與組織病理活檢結(jié)果分析[n(%)]

2.單一HPV-DNA及TCT檢測(cè)與兩者聯(lián)合檢測(cè)診斷效果比較：以宮頸病理組織活檢為診斷標(biāo)準(zhǔn)， HPV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)于預(yù)測(cè)CIN Ⅱ及以上病變結(jié)果預(yù)測(cè)的敏感度、特異性、陰性預(yù)測(cè)值及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為89.09%、33.13%、89.83%和31.41%，TCT≥HSIL對(duì)于預(yù)測(cè)CIN Ⅱ及以上病理結(jié)果的敏感度、特異性、陰性預(yù)測(cè)值及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為52.73%、94.38%、85.31%和76.32%。為提高其敏感度，降低漏診率，采取并聯(lián)試驗(yàn)，即TCT檢測(cè)和HPV-DNA檢測(cè)中任一為陽(yáng)性即判定為陽(yáng)性，二者聯(lián)合檢測(cè)應(yīng)用于預(yù)測(cè)高級(jí)別宮頸癌病變的敏感度、特異性、陰性預(yù)測(cè)值及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為92.73%、32.50%、92.86%和46.79%，詳見表3。

表3 TCT、HPV-DNA及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)CINⅡ及以上宮頸病變的診斷效果比較

討 論

宮頸癌嚴(yán)重威脅發(fā)展中國(guó)家女性健康，其發(fā)生率居女性惡性腫瘤第4位，我國(guó)每年大約有15萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例[9，10]。宮頸癌的發(fā)生起源于宮頸上皮細(xì)胞異常增生，而宮頸癌早期無(wú)明顯臨床指征，易造成漏診，因此，篩查識(shí)別出宮頸癌高危人群，對(duì)于患者科學(xué)預(yù)防和治療至關(guān)重要?，F(xiàn)階段，陰道鏡下宮頸組織活檢是診斷宮頸上皮細(xì)胞瘤變的金標(biāo)準(zhǔn)，具有很高的準(zhǔn)確率，但其屬于有創(chuàng)操作，患者接受度低，因此，探索一種高敏感度、無(wú)創(chuàng)的宮頸癌早期篩查方法具有重要價(jià)值。

TCT檢查具有操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、特異性高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用到臨床宮頸癌篩查中。本研究中單一TCT檢測(cè)對(duì)于宮頸CIN Ⅱ及以上病變的敏感度為52.73%，特異性為94.38%，與文獻(xiàn)報(bào)告基本一致[11，12]。TCT異常在不同宮頸病理組織中均具有較高的檢出率，在LSIL、HSIL及SCC與宮頸癌的病理活檢結(jié)果的符合率分別為40.91%(9/22)、75.68%(28/37)和100%(1/1)，提示TCT檢測(cè)對(duì)宮頸細(xì)胞瘤變具有較高的診斷準(zhǔn)確率，隨著宮頸細(xì)胞瘤變程度升高TCT檢測(cè)正確率增高。同樣，其也存在一定的漏診，在CINⅡ/Ⅲ和宮頸癌組中，其假陰性率分別為48.00%(24/50)和40.00%(2/5)，這可能與臨床醫(yī)生取材、病理技師制片效果有一定影響[13,14]。因此，規(guī)范化采集及病理制片培訓(xùn)和考核對(duì)于宮頸癌癌前病變的檢出尤為重要。

生殖道HPV持續(xù)感染是宮頸上皮細(xì)胞瘤變、宮頸癌發(fā)生的必然條件[15,16]。宮頸細(xì)胞瘤變患者中80%～90%伴有HPV 感染，通常認(rèn)為大多數(shù)年輕女性感染HPV是一過(guò)性的，會(huì)隨著時(shí)間的推移自然清除，僅5%～10%發(fā)展為持續(xù)感染。在本研究中215例患者中，HPV-DNA陽(yáng)性檢出率為72.56%，HPV-DNA陽(yáng)性對(duì)于CIN Ⅱ及以上的檢出率顯著高于HPV-DNA陰性病例檢出率，且隨著瘤變級(jí)別的增加，HPV陽(yáng)性率也逐漸升高，因此，對(duì)于宮頸癌早期篩查患者，HPV-DNA陽(yáng)性結(jié)果可有效地篩選出高級(jí)別宮頸細(xì)胞瘤變及宮頸癌病變。需要注意的是在高級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞瘤變病例中，也有少量HPV陰性病歷，這可能與檢測(cè)試劑盒檢測(cè)范圍的局限性有關(guān)，也可能與宮頸脫落細(xì)胞取材有關(guān)，因此，對(duì)于HPV-DNA檢出陰性者，美國(guó)陰道鏡和宮頸病理學(xué)會(huì)指出對(duì)于年齡在30～65歲HPV核酸檢測(cè)陰性女性，應(yīng)間隔1年定期復(fù)查HPV-DNA檢測(cè)。在宮頸癌早期篩查中，HPV-DNA檢測(cè)具有較高的敏感度。本研究中，以宮頸病理組織活檢為標(biāo)準(zhǔn)，HPV-DNA及TCT單一檢測(cè)對(duì)于預(yù)測(cè)CIN Ⅱ及以上病理結(jié)果的敏感度分別為89.09%和52.73%，特異性為33.13%和94.38%，二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于預(yù)測(cè)高級(jí)別宮頸癌病變的敏感度、特異性、陰性預(yù)測(cè)值以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為92.73%、32.50%、92.86%和46.79%。二者聯(lián)合檢測(cè)，可以有效提高對(duì)于高級(jí)別宮頸細(xì)胞瘤變檢出的敏感度和陰性預(yù)測(cè)值，提高對(duì)高級(jí)別宮頸細(xì)胞瘤變?cè)\斷的敏感度，減少宮頸疾病篩查患者中高級(jí)別瘤變的漏診，也可以減少不必要的陰道鏡下活檢等有創(chuàng)操作。

本研究中HPV-DNA與TCT聯(lián)合檢測(cè)可有效提高對(duì)宮頸癌癌前病變的檢出率，提高對(duì)高級(jí)別宮頸細(xì)胞瘤變檢出的敏感度，但是其檢測(cè)特異性降低。這主要是因?yàn)樵\斷試驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)中敏感度和特異性是一對(duì)矛盾體，二者不可兼得。前期研究血清SCC與HPV-DNA檢測(cè)在非典型鱗狀上皮細(xì)胞診斷的意義中，同樣發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合檢測(cè)可有效提高CINⅡ以上宮頸細(xì)胞瘤變的敏感度，但其特異性降低[16]。本研究主要通過(guò)二者聯(lián)合檢測(cè)提高對(duì)宮頸癌癌前病變的檢出率，提高宮頸癌癌前病變?cè)缙谠\斷的效率，但會(huì)犧牲一定的特異性，造成少數(shù)被誤判而做宮頸組織活檢，經(jīng)病理診斷為無(wú)明顯異常的假陽(yáng)性病例。與更早的診斷宮頸癌癌前病變及預(yù)測(cè)宮頸癌發(fā)展趨勢(shì)比較，只要將陰道鏡下活檢控制在可能小的范圍內(nèi)，付出這種代價(jià)應(yīng)該是允許的。

綜上所述，單一HPV-DNA或TCT檢測(cè)對(duì)于宮頸癌早期病變篩查具有重要作用，兩者聯(lián)合檢測(cè)可有效提高CIN Ⅱ及以上病變的敏感度，減少宮頸高級(jí)別病變的漏診，能在早期有效篩選出高級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞病變。隨著宮頸細(xì)胞標(biāo)志物如HPV E6/E7 mRNA、has miRNA、p53、Ki67、TOP2A/MCM2、甲基化等分子、細(xì)胞因子的進(jìn)一步研究，相信其聯(lián)合常規(guī)HPV-DNA和TCT檢測(cè)對(duì)于宮頸癌早期診斷具有重要的價(jià)值[17,18]。明確單一TCT、HPV-DNA檢測(cè)及二者聯(lián)合檢測(cè)在評(píng)價(jià)在宮頸癌早期診斷中的優(yōu)勢(shì)，探索宮頸癌早期分流診斷的標(biāo)準(zhǔn)化模式，尋找最適合臨床應(yīng)用的篩查方案，為臨床早期篩查和診斷宮頸細(xì)胞病變提供科學(xué)依據(jù)。