沉默PKM2表達(dá)可通過Bim來影響肺鱗狀細(xì)胞癌凋亡

溫媛媛 楊志強(qiáng) 金丹雯 何 慧 錢立勇

丙酮酸激酶(PK),作為糖酵解的關(guān)鍵酶之一,編碼4種不同亞型,L、R、M1、M2[1,2]。PKM2主要表達(dá)在正常人類胚胎發(fā)育過程中,與組織修復(fù)和再生密切相關(guān)[3]。PKM2在腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮重要作用[4,5]。此外，PKM2還可以通過磷酸化、乙?；刃揎椬饔门c多種蛋白相互調(diào)控，介導(dǎo)PKM2在細(xì)胞內(nèi)的不同定位，發(fā)揮特殊的生物學(xué)功能[6,7]。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌中PKM2通過調(diào)節(jié)Bim穩(wěn)定性來抑制細(xì)胞凋亡[8]。Bim作為Bcl-2家族BH3蛋白重要成員，在外界壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[9]。PKM2介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚不清楚。在肺鱗狀細(xì)胞癌中PKM2是否可通過調(diào)控Bim來影響肺癌細(xì)胞凋亡？本研究分析了PKM2在肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)、與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及對肺鱗狀細(xì)胞癌不良預(yù)后的影響，探討PKM2在肺鱗狀細(xì)胞癌凋亡中的作用及與Bim的關(guān)系。

材料與方法

1.標(biāo)本來源與患者資料：本研究收集了舟山醫(yī)院病理診斷中心2007年1月1日～2016年12月31日的95例肺鱗狀細(xì)胞癌與癌旁正常組織標(biāo)本。所有入組患者均行根治性手術(shù)切除，未行化療或放療。根據(jù)WHO肺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)(2015年)確定組織學(xué)類型，根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)的TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分期。所有入組患者術(shù)前均獲得知情同意。隨訪方法為門診和電話隨訪。生存時間從手術(shù)日期至因復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移而死亡日期或最后一次隨訪日期。本文隨訪數(shù)據(jù)截止日期為2016年12月，1例患者失訪。

2.主要試劑：P免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(中國福州邁新生物技術(shù)公司)；兔抗人PKM2抗體(英國Abcam公司)，兔抗人Bim抗體(美國Santa Cruz公司)，鼠抗人β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Annexin V-FITC/PI試劑盒(英國Abcam公司)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0試劑盒(日本TaKaRa公司)，PCR引物合成與測序委托大連TaKaRa公司進(jìn)行，PKM2 siRNA(5′-CCAUAAUCGUCCUCACCAATT-3′)和對照siRNA(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′) 由上海吉瑪生物公司設(shè)計合成，Bim siRNA購自美國Santacruz公司。

3.免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定：石蠟組織制成4μm切片，按照SP法進(jìn)行染色：脫蠟，水化，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，抗原修復(fù)，封閉，分別滴加一抗(PKM2，1∶400)(Bim，1∶100)4℃過夜，PBS清洗后加入對應(yīng)的二抗、室溫孵育1h，DAB顯色，復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下判讀。半定量法評價PKM2與Bim在腫瘤區(qū)域的免疫著色。每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，并計算了陽性細(xì)胞的百分比。PKM2與Bim均以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色，二者染色強(qiáng)度分為3個等級：0為陰性；1為中等著色；2為強(qiáng)著色。染色百分率分為4個等級： 1級1%～25%;2級26%～50%;3級51%～75%;4級76%～100%。以陽性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度的分值乘積作為每一例的積分，積分<4者判定為陰性或低表達(dá)，積分≥4為陽性或高表達(dá)。

4.細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA干擾實驗：選取人正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE與人肺鱗癌細(xì)胞系SK-MES-1，兩種細(xì)胞均為貼壁生長的細(xì)胞系，均接種在DMEM培養(yǎng)液中，于37℃含5%CO2濕潤空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分5組：未處理組、control siRNA組、PKM2 siRNA組、PKM2 siRNA+Bim siRNA組及Bim siRNA組，每個實驗均重復(fù)3次。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞以5×105每孔的密度接種于6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗，陰性對照為未轉(zhuǎn)染組與control siRNA組，siRNA 濃度為 20μmol/L，轉(zhuǎn)染具體步驟按Lipofect amine 2000試劑說明書進(jìn)行。

5.蛋白提取與免疫印跡:使用細(xì)胞裂解液，對貼壁細(xì)胞進(jìn)行裂解，4℃靜置24h，低溫高速離心(4℃, 12000r/min, 40min)，提取上清即為總蛋白。加樣，上樣蛋白量為60μg。經(jīng)聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳1.5h后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，加入Western blot封閉液室溫封閉60min，洗凈，后將膜立即加入稀釋好的一抗(PKM2抗體，1∶500；Bim抗體，1∶600；β-actin抗體，1∶200)，4℃孵育過夜。TTBS洗膜3次，后加入對應(yīng)的二抗室溫下孵育2h，ECL顯色，X線膠片曝光成像，經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像。以目的條帶與內(nèi)參照 β-actin 條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。重復(fù)實驗 3次。

6.RT-PCR法:細(xì)胞離心后加入 1ml Trizol 與液氮混勻，轉(zhuǎn)移至 1.5ml EP 管中，加入200μl 氯仿，經(jīng)過兩次高速離心后(4℃、12000r/min、15min)，去除上清液，用 1ml 75%乙醇洗滌管壁和RNA，再經(jīng)高速離心處理后，棄去上清液，即獲得細(xì)胞總RNA。利用RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，擴(kuò)增PKM2與Bim，以β-actin為內(nèi)參。PKM2 PCR上游引物： 5′-CCATTACCAGCGACCCCACAG-3′；下游引物：5′- GGGCACGTGGGCGGTATCT-3′。Bim PCR上游引物：5′-CTGCAGATA TGCGCCCAGAGAT-3′; 下游引物： 5′-CACCAGGCGGACAATGTAACG-3′。β-actin PCR上游引物：5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3′; 下游引物： 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3′。實驗重復(fù)3次，取平均值。

7.Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測凋亡：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×104個/毫升的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)。收集細(xì)胞，加入300μl的1×binding buffer 懸浮細(xì)胞，再分別加入5μl的Annexin V-FITC與5μl的PI，室溫避光15min后加400μl PBS，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析檢測，實驗重復(fù)3次，取平均值。

結(jié) 果

1.PKM2與Bim蛋白在肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與臨床病理因素的關(guān)系:免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PKM2在74例肺鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)(77.9%),免疫染色定位于細(xì)胞質(zhì)。在正常支氣管及肺泡組織中不表達(dá)或低表達(dá)(圖1)。PKM2高表達(dá)與患者高TNM分期(χ2=10.146，P=0.008)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=19.011，P=0.003)及腫瘤直徑(χ2=8.848，P=0.009)相關(guān)(表1)。Bim在65例肺鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)(68.4%)，染色定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。Spearman相關(guān)性表明，在95例肺鱗狀細(xì)胞癌中PKM2與Bim表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.932，P=0.000，表2)。

圖1 PKM2與Bim在肺組織中的表達(dá)(SP法，×200)A、C、E.PKM2分別在肺鱗狀細(xì)胞癌、正常肺泡上皮及支氣管上皮中的表達(dá)；B、D、F.Bim分別在肺鱗狀細(xì)胞癌、正常肺泡上皮及支氣管上皮中的表達(dá)

表1 PKM2在90例肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.PKM2高表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌患者不良預(yù)后相關(guān):Kaplan-Meier生存分析顯示，PKM2蛋白高表達(dá)組患者的總體生存期低于PKM2低表達(dá)組(χ2=18.630，P=0.000，圖2)。單因素分析表明，腫瘤體積大(χ2=9.185,P=0.038)、高TNM分期(χ2=11.453,P=0.011)、PKM2高表達(dá)狀態(tài)(χ2=18.630,P=0.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=19.857,P=0.000)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)(表3)。將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的4項指標(biāo)引入COX風(fēng)險比例回歸模型分析，多因素分析表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(RR=2.896，P=0.003)、PKM2表達(dá)(RR=1.798，P=0.038)與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)，分別為本組患者生存時間的獨(dú)立預(yù)測因素(表4)。

表2 PKM2與Bim在95例肺鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)相關(guān)性分析

圖2 PKM2表達(dá)情況與患者生存曲線分析

表3 95例肺鱗狀細(xì)胞癌患者總生存率的單因素分析

表4 95例肺鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的多因素分析(COX回歸模型)

3.PKM2在肺鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá):鱗狀細(xì)胞癌SK-MES-1中PKM2蛋白(t=8.210，P<0.05)與mRNA(t=5.473，P<0.05)表達(dá)均高于正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE(圖3)。

圖3 PKM2蛋白與mRNA在SK-MES-1中表達(dá)A.PKM2蛋白在肺鱗狀細(xì)胞癌SK-MES中表達(dá)高于正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE;B.PKM2 mRNA在肺鱗狀細(xì)胞癌SK-MES中表達(dá)高于正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE

圖4 肺鱗狀細(xì)胞癌中沉默PKM2表達(dá)后可上調(diào)Bim表達(dá)A、B、C、D.在SK-MES-1中分別沉默PKM2與Bim表達(dá)后，PKM2、Bim蛋白和mRNA 表達(dá)情況;E、F.共轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA與Bim siRNA后，PKM2與Bim蛋白和mRNA表達(dá)情況

4.PKM2可通過Bim抑制肺鱗狀細(xì)胞癌凋亡:采用PKM2 siRNA片段與Bim siRNA片段來分別沉默PKM2與Bim表達(dá)，在SK-MES-1中轉(zhuǎn)染PKM2siRNA或 Bim siRNA 48h后收集細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PKM2與Bim在PKM2 siRNA組中表達(dá)顯著低于control siRNA組(P<0.05)，Bim在Bim siRNA組中表達(dá)顯著低于control siRNA組(P<0.05)，證明PKM2 siRNA片段與Bim siRNA片段的干擾作用是顯著的,在肺鱗狀細(xì)胞癌中沉默PKM2表達(dá)可上調(diào)Bim表達(dá)(圖4中A～D)。為了觀察PKM2對肺鱗狀細(xì)胞癌凋亡的影響，細(xì)胞轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA 48h后采用 Annexin V-FITC/PI試劑盒處理細(xì)胞。與未處理組(10.45%±1.23%)、control siRNA組(11.32%±1.52%)比較，SK-MES-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA(28.01%±3.65%)后細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05,圖5)。為了探討B(tài)im在PKM2調(diào)控細(xì)胞凋亡中的作用，SK-MES-1細(xì)胞同時轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA與Bim siRNA(13.55%±1.74%)，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA(28.01%±3.65%)比較，PKM2上調(diào)Bim表達(dá)的作用明顯減弱(P<0.05,圖4中E、F)，同時細(xì)胞凋亡率明顯減少(P<0.05，圖5)。

圖5 肺鱗狀細(xì)胞癌中沉默PKM2表達(dá)可通過上調(diào)Bim來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡A.SK-MES-1各實驗組中細(xì)胞的凋亡情況；B.各實驗組中凋亡率統(tǒng)計，*P<0.05

討 論

PKM2已被證實在許多惡性腫瘤中高表達(dá)且與這些腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，例如胃癌、前列腺癌[10,11]。在638例肝細(xì)胞肝癌中，PKM2表達(dá)上調(diào)并與肝細(xì)胞肝癌的惡性臨床表型顯著相關(guān)，包括高臨床分期、血管浸潤和腫瘤直徑。PKM2高表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌的總體生存期縮短密切相關(guān)[8]。在子宮內(nèi)膜癌中高表PKM2高表達(dá)的患者總體生存率較PKM2低表達(dá)患者低[12]。PKM2高表達(dá)與食道鱗狀細(xì)胞癌的總生存期低相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)PKM2在肺鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，且PKM2高表達(dá)與患者高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤直徑相關(guān)。PKM2高表達(dá)的患者的總體生存期低于PKM2低表達(dá)者，PKM2高表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌患者不良預(yù)后相關(guān)，且為患者生存時間的獨(dú)立預(yù)測因素。

PKM2可調(diào)控許多惡性腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡。文獻(xiàn)報道，采用siRNA沉默PKM2表達(dá)后可抑制腫瘤細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。PKM2通過與Bub3結(jié)合并在Y207位點(diǎn)磷酸化來直接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展[15]。PKM2可在T11位點(diǎn)磷酸化組蛋白H來調(diào)控細(xì)胞周期蛋白cyclinD1與c-myc表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[16]。這些研究報道均證實PKM2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，采用PKM2 siRNA片段干擾PKM2表達(dá)后，凋亡檢測實驗發(fā)現(xiàn)，沉默PKM2可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

凋亡是細(xì)胞的一種程序性的細(xì)胞死亡，包括內(nèi)源性和外源性凋亡途徑[17]。Bim作為Bcl-2家族重要凋亡蛋白成員之一，可激活caspase-9，誘導(dǎo)線粒體凋亡通路[18]。有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞系中沉默PKM2表達(dá)可上調(diào)Bim來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[8]。在肺鱗狀細(xì)胞癌中，Bim是否也參與了PKM2調(diào)控的肺癌細(xì)胞凋亡？本研究就這一假設(shè)進(jìn)行探討，免疫組化與統(tǒng)計結(jié)果表明在95例肺鱗狀細(xì)胞癌組織中PKM2與Bim表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，同時采用特異性siRNA片段沉默PKM2表達(dá)后可上調(diào)Bim表達(dá)，共轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA與Bim siRNA片段發(fā)現(xiàn)抑制PKM2表達(dá)可通過上調(diào)Bim來誘導(dǎo)肺鱗狀細(xì)胞癌凋亡。

綜上所述，本研究表明PKM2高表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌不良預(yù)后密切相關(guān)，PKM2可通過調(diào)控凋亡蛋白Bim表達(dá)來影響肺鱗狀細(xì)胞癌凋亡，為肺鱗狀細(xì)胞癌的診治提供新的靶點(diǎn)。