A型肉毒素對帶狀皰疹后神經(jīng)痛小鼠炎性神經(jīng)遞質表達的影響

李國松，湯樣華，徐燦達，沈志恩，林成英

（杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院 疼痛科，浙江 杭州 311200）

帶狀皰疹后神經(jīng)痛（postherpetic neuralgia，PHN）是帶狀皰疹皮損愈合后遺留的頑固性神經(jīng)病理性疼痛，是帶狀皰疹最常見的并發(fā)癥之一[1]。流行病學調查顯示，約有20%的帶狀皰疹患者在發(fā)病后3個月有PHN發(fā)生，且發(fā)生率隨年齡而增長，60歲以上老年患者發(fā)生率高達50%～75%[2-3]。PHN一旦形成，由于疼痛較為劇烈，且病程長，患者多伴有焦慮和抑郁等精神癥狀，嚴重影響患者生活質量。目前臨床上治療PHN的方法主要分為藥物療法和非藥物療法。治療藥物主要有抗抑郁藥、抗癲癇藥、鎮(zhèn)痛藥等，需要長期甚至終身服藥，且不良反應較多。非藥物療法如脊髓電刺激、神經(jīng)阻滯與毀損、皮內注藥療法等有嚴重并發(fā)癥的可能，且部分療法因臨床患者個體差異而導致安全性和有效性不盡人意。近幾年來，有研究報道[4]應用A型肉毒毒素（botulinum toxin A，BTX-A）皮下注射可有效地治療PHN。BTX-A是肉毒桿菌在繁殖中分泌的一種有毒性的蛋白質，可通過阻斷神經(jīng)遞質在突觸前膜的釋放，以減輕神經(jīng)病理性痛[5-6]。但關于BTX-A治療PHN的作用機制尚不明確。前期研究中我們已通過微量加樣器皮下接種注射I型單純皰疹病毒成功建立了PHN小鼠模型，本研究旨在通過觀察BTX-A對PHN小鼠模型炎性神經(jīng)遞質表達的影響，探討B(tài)TX-A對PHN的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 BTX-A（蘭州生物制品研究所，國藥準字號S10970037，生產(chǎn)批號20170928），RNeasy Mini RNA抽提試劑盒（德國Qiagen公司），Quant Reverse Transcriptase反轉錄試劑盒（美國Bio-Rad公司），SYBR Green熒光素酶（美國Thermo Scientific公司），小鼠TNF-α、IL-1β、NKA（英國Abcam公司），NE-PER蛋白提取試劑盒（美國Thermo Scientific公司），抗Na1.3 鼠單克隆抗體（英國Abcam公司），抗Na1.8鼠單克隆抗體（英國Abcam公司），抗β-Actin鼠單克隆抗體（美國Sigma公司）。BECKMANDU800紫外分光光度計（美國Beckman公司），GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)（日本Olympus公司），Rotor Gene 3000熒光PCR儀（美國Rotor Gene公司），DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標儀（美國Thermo Scientific公司），Wellwash 4 MK2洗板機（美國Thermo Scientific公司），PYX-DHS恒溫培養(yǎng)箱型（上海躍進醫(yī)療器械廠），TGL-168離心機（上海安亭科學儀器廠），移液槍（美國Thermo labsystems公司），Odyssey紅外成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 PHN動物模型的制作:選擇SPF級8周齡雄性C57小鼠，體質量18～22 g[由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SCXK（滬）2003-0003]，腹腔內注射1%戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg麻醉后，將左下肢和背部用化學脫毛劑脫毛并用清水沖洗脫毛部位。3 d后，選取脫毛區(qū)光滑無損傷動物進入以下實驗，皮膚損傷的動物剔除。分別于每只動物左下肢脛骨局部處用微量加樣器皮下接種I型單純皰疹病毒（HSV-1）10 μL（濃度1×106PFU/mL），于接種前和接種后第1、第3、第5、第7天測定后爪機械痛閾和熱痛痛閾反應評分，鑒定PHN動物模型是否造模成功。

1.2.2 動物分組與藥物干預:選擇造模成功的PHN小鼠36只，隨機分成A、B、C 3組，每組12只。A組在皰疹部位注射0.9%氯化鈉溶液；B組在皰疹部位注射BTX-A（2 U/kg）；C組在L5背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）處注射BTX-A（2 U/kg）。每天1次，連續(xù)干預7 d。

1.2.3 實驗標本取材:注射BTX-A后第7天，所有小鼠全部腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，用止血鉗固定針尖，并剪開右心耳形成灌注液排出管道，從左心室快速灌注37 ℃ 0.9%氯化鈉溶液，直到從右心耳流出的液體為無色，同時小鼠肝臟色淡，腸管腫脹為止，停止灌流。迅速暴露左側坐骨神經(jīng)，然后剪開骨質，逆行找到相應的L5 DRG并取出，立即置于液氮中備用。再逆行找到相應的發(fā)出神經(jīng)的術側脊髓節(jié)段并取出，立即置于液氮中備用。

1.2.4 RT-qPCR反應檢測小鼠DRG和脊髓中炎性神經(jīng)遞質TNF-α、IL-1β、神經(jīng)激肽A（neurokinin A，NKA）的mRNA表達:從液氮中取出DRG和脊髓標本，分別按照試劑盒說明書抽提總RNA。用紫外分光光度計選擇波長260 nm和280 nm分別檢測OD值，測得樣本OD260/280為1.6～2.0后進行反轉錄和擴增。按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄成cDNA，然后進行Real-time PCR反應。引物由大連寶生物公司設計、合成。引物序列見表1。

1.2.5 ELISA法檢測小鼠DRG和脊髓中炎性神經(jīng)遞質TNF-α、IL-1β、NKA的蛋白表達:具體操作步驟分別按照試劑盒說明書進行，用酶標儀在450 nm下，測定顯色物的OD值，OD值反映了底物被水解的量。根據(jù)試劑盒提供的標準品（已知濃度）對應的酶含量繪制標準曲線，計算獲得測試樣品中相應抗體的濃度。

表1 Real-time PCR反應引物序列

1.2.6 Western blot檢測各組小鼠DRG和脊髓中Na1.3、Na1.8 通道蛋白表達:蛋白裂解液裂解組織，離心后，取上清液。收集完蛋白樣品后，用蛋白濃度測定試劑盒測定每個蛋白樣品的蛋白濃度，以含30 μg蛋白計算需要的上樣體積，確保每個蛋白樣品的上樣量一致。加入適量上樣緩沖液，沸水中蛋白變性5 min，4 ℃冷卻。安裝好電泳槽，按照蛋白分子量不同，預制5%濃縮膠和8%分離膠，加入蛋白樣品及蛋白marker 5 μL左右。先80 V電壓跑濃縮膠，然后110 V電壓跑分離膠。電泳至蛋白marker目的條帶區(qū)域分離開，停止電泳。300 mA恒流，80 min轉膜。將PVDF膜放入封閉液中冰上搖1 h。后加入稀釋好的β-actin（1:5 000）及Na1.3（1:1 000，5%奶粉/TBST配制）、Na1.8抗體（1:1 000，5%奶粉/TBST配制）冰上搖1～2 h，再轉入4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜2次，冰上搖10 min。加入1:10 000的二抗，孵育1 h。將二抗倒去，用PBS清洗3遍，Odyssey紅外成像系統(tǒng)采集目的條帶圖像。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠DRG和脊髓中炎性神經(jīng)遞質RT-qPCR檢測結果 與A組比，B組和C組炎性神經(jīng)遞質TNF-α、IL-1β、NKA的mRNA相對表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但B和C組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 小鼠DRG和脊髓中炎性神經(jīng)遞質ELISA法檢測結果 與A組比，B組和C組TNF-α、IL-1β、NKA的蛋白含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），但B和C組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 小鼠DRG和脊髓中Na1.3、Na1.8通道蛋白的Western blot檢測結果 與A組比較，B組和C組Na1.3、Na1.8通道蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但B和C組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4和圖1。

表2 各組小鼠DRG和脊髓中炎性神經(jīng)遞質RT-qPCR檢測結果（每組n=12）

表3 各組小鼠DRG和脊髓中炎性神經(jīng)遞質ELISA法檢測結果（每組n=12）

表4 各組小鼠DRG和脊髓中Na1.3、Na1.8通道蛋白相對表達量（每組n=12）

圖1 各組小鼠DRG和脊髓中Na1.3、Na1.8通道蛋白Western blot檢測結果

3 討論

國內外研究[7-9]發(fā)現(xiàn)，目前臨床上應用BTX-A治療PHN，鎮(zhèn)痛效果明顯，是一種潛在的可能用于治療PHN的可靠方法，但是作為一種運動神經(jīng)的特異性阻滯劑，BTX-A治療PHN的內在機制仍不清楚，因此，仍需要大量的基礎及臨床研究來揭示BTX-A治療PHN的作用機制，以更準確和更有效地指導臨床治療。研究[10-11]表明，帶狀皰疹患者發(fā)生PHN的一個重要原因為其周圍神經(jīng)干發(fā)生炎癥，神經(jīng)末梢釋放大量的P物質、NKA、炎性因子等介質，使患者對傷害性刺激更加敏感，引起周圍神經(jīng)敏化，產(chǎn)生疼痛癥狀。本研究采用RT-qPCR和ELISA法檢測了小鼠DRG和脊髓中相關炎性神經(jīng)遞質TNF-α、IL-1β、NKA的mRNA和蛋白表達量。結果表明，于皰疹局部注射BTX-A和L5 DRG注射BTX-A（2 U/kg）均可顯著降低TNF-α、IL-1β、NKA的mRNA和蛋白表達水平，與局部注射0.9%氯化鈉溶液組比較，差異有統(tǒng)計學意義，提示BTX-A治療PHN的作用與抑制炎性神經(jīng)遞質TNF-α、IL-1β、NKA的mRNA和蛋白表達水平相關。

另外，有研究通過檢測水痘帶狀皰疹病毒感染后的大鼠DRG，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽表達顯著增加，鈣通道、鈉通道1.3和1.8蛋白顯著激活[12]。本研究中通過Western blot檢測小鼠DRG和脊髓中Na1.3、Na1.8通道的蛋白表達發(fā)現(xiàn)，BTX-A可顯著降低Na1.3、Na1.8通道的蛋白表達，且與0.9%氯化鈉溶液對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，也進一步提示，BTX-A治療PHN的作用可能與降低通道蛋白Na1.3、Na1.8的表達相關。

綜上所述，結合本研究結果表明，BTX-A能有效抑制PHN，其作用機制可能是通過降低通道蛋白Na1.3、Na1.8 的表達，抑制炎性神經(jīng)遞質TNF-α、IL-1β、NKA的mRNA和蛋白表達水平。但在本研究中實驗結果發(fā)現(xiàn)局部注射BTX-A和L5 DRG注射BTX-A，對PHA小鼠炎性神經(jīng)遞質表達的影響差異無統(tǒng)計學意義，從而表明注射部位對于BTX-A治療PHA的機制影響不大，其可操作性方面及臨床應用方面尚需進一步研究。