腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

唐玉秀，閉雄杰

1廣西科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 柳州545006

2廣西科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 柳州5450060

腫瘤是指機(jī)體在各種致瘤因子作用下形成的新生物，涵蓋了不同的腫瘤種類，具有不同的病理類型、檢查和治療方法。腫瘤標(biāo)志物指惡性腫瘤細(xì)胞分泌或脫落到體液或組織中的物質(zhì)，可以反映腫瘤存在和生長(zhǎng)情況，或被認(rèn)為是宿主響應(yīng)腫瘤而產(chǎn)生的腫瘤衍生產(chǎn)物[1]。腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)多數(shù)情況下具有高特異度和靈敏度，但不同的檢測(cè)方法會(huì)有明顯的差異[2]。目前腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方法仍存在較多難點(diǎn)，通過簡(jiǎn)單易用的實(shí)驗(yàn)室測(cè)試，可以檢測(cè)或驗(yàn)證腫瘤的存在。臨床腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)具有無創(chuàng)、易于獲取標(biāo)本、操作方便、易于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病、成本低等優(yōu)點(diǎn)[3]。對(duì)腫瘤的早期診斷、鑒別診斷、疾病監(jiān)測(cè)、病理分型、指導(dǎo)治療和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。臨床上，不同的腫瘤對(duì)腫瘤標(biāo)志物的靈敏度和特異度不同，因此，檢測(cè)方法也有很大差異。本文對(duì)免疫學(xué)方法、液體活組織檢查和外泌體檢測(cè)三類常用的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，為臨床腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法的選擇提供參考依據(jù)。

1 免疫學(xué)方法

腫瘤標(biāo)志物主要包括蛋白質(zhì)、激素、酶、多胺及基因產(chǎn)物等，集中分布在血液、體液、細(xì)胞或組織中，可以通過不同針對(duì)性的生化、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等方法進(jìn)行測(cè)定，對(duì)腫瘤的輔助診斷、鑒別、監(jiān)測(cè)病情、療效及預(yù)后評(píng)估具有十分重要的臨床價(jià)值。

1.1 放射免疫測(cè)定（radioimmunoassay，RIA）

RIA是一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的傳統(tǒng)方法，通過使用高靈敏度、準(zhǔn)確度和未標(biāo)記抗原的放射性同位素測(cè)量結(jié)合抗體特異性或競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)來定量體外微量物質(zhì)的分析方法[4]。一般來講，涉及使用免疫學(xué)測(cè)定的技術(shù)可稱為RIA，只要涉及放射性同位素標(biāo)記的抗原或抗體均可稱為RIA，包括競(jìng)爭(zhēng)性RIA和非競(jìng)爭(zhēng)性RIA。放射免疫分析使用放射性核素125I，因其具有放射性高、易于標(biāo)記和易于檢測(cè)衰變期間釋放的輻射的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用，并逐漸取代了3H和14C。RIA具有以下五方面優(yōu)點(diǎn)[5-6]：①可以測(cè)量多種免疫活性物質(zhì)；②高靈敏度，一般化學(xué)分析的檢出限為（10-9～10-15g）；③由于抗原-抗體免疫反應(yīng)的特異性，特異度較高；④RIA應(yīng)用廣泛，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已為RIA建立了至少300種生物活性物質(zhì)，可以用于幾乎所有的激素、各種蛋白質(zhì)、腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、寄生蟲抗原、一些小分子（如環(huán)核苷酸）和藥物（如地高辛、毛地黃等）的分析，且范圍申請(qǐng)仍在擴(kuò)大；⑤RIA是一種體外分析技術(shù)，試劑少、樣品用量少、反應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、對(duì)患者無輻射危害、易于自動(dòng)化。但RIA也具有以下五方面不足[5-6]：①只能測(cè)量具有免疫活性的物質(zhì)；②生物制劑的穩(wěn)定性受多種因素的影響；③對(duì)某些含量極低的物質(zhì)檢測(cè)靈敏度較低；④測(cè)量值是相對(duì)數(shù)量而不是絕對(duì)數(shù)量；⑤存在輻射和污染等問題。雖然RIA存在一些缺點(diǎn)，但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，RIA作為一種定量分析方法將得到更廣泛和更深入的發(fā)展。

1.2 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（chemiluminescence immunoassay，CLIA）

CLIA是一種常用且相對(duì)成熟的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)[7]。CLIA是一種將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)量技術(shù)和高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合的檢測(cè)和分析技術(shù)。CLIA是繼RIA、無酶檢測(cè)、熒光免疫測(cè)定和時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定后的最新的免疫檢測(cè)技術(shù)。CLIA具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、線性范圍寬、儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、適合小型化和無放射性危害的優(yōu)點(diǎn)。CLIA采用發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯）或酶催化劑[如辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）]直接標(biāo)記抗體以標(biāo)記抗原抗體[7]。CLIA與微芯片電泳分離及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，具有檢測(cè)效率高、分析速度快、自動(dòng)化程度高、樣品和試劑少的優(yōu)點(diǎn)。Min等[8]研究觀察顯示，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與鐵蛋白濃度在5.1～1300.0 ng/ml間呈線性關(guān)系，檢出下限為2.55 ng/ml。同時(shí)，CLIA的整個(gè)過程可以在45 min內(nèi)完成，這種具有自動(dòng)化和定量功能的芯片實(shí)驗(yàn)室化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定平?臺(tái)為多種腫瘤患者即時(shí)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物提供了一種有前途的策略。

傳統(tǒng)化學(xué)免疫測(cè)定系統(tǒng)中使用的天然酶具有穩(wěn)定性差、來源有限、對(duì)環(huán)境變化敏感及易受環(huán)境影響而變性的缺點(diǎn)，且標(biāo)記過程中通?？蓳p害抗體分子的生物活性。近年來，無酶免疫系統(tǒng)的發(fā)展將電化學(xué)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光結(jié)合來檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物，同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。Yang等[9]研究結(jié)果顯示，一種新型的無CuS納米顆粒的CLIA被設(shè)計(jì)用于測(cè)定線性范圍為0.1～60.0 ng/ml且檢測(cè)下限為0.07 ng/ml的甲胎蛋白，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)廉、快速的特點(diǎn)，特異度高，且具有可接受的重復(fù)性和良好的準(zhǔn)確性。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是在固相載體上吸附已知抗原或抗體，并在抗原-抗體復(fù)合物中加入酶標(biāo)抗原或抗體用于抗原-抗體反應(yīng)[10]。改變抗體的免疫學(xué)特性不會(huì)影響酶的生物活性，并且酶是由底物發(fā)展而來的，從而達(dá)到檢測(cè)目的。常用的ELISA方法是雙抗體夾心法（檢測(cè)大分子抗原）和間接法（確定特異性抗體）。用于標(biāo)記抗體或抗體的酶必須具有高活性和高靈敏度、在室溫下穩(wěn)定、反應(yīng)產(chǎn)物易于觀察、可以商業(yè)化生產(chǎn)的特征[11-12]，包括HRP、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中HRP的使用最廣泛。不同的研究方案將選擇不同的ELISA策略，如使用單克隆、多克隆抗體和嵌合抗體來開發(fā)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒。ELISA開發(fā)后，其檢測(cè)系統(tǒng)也進(jìn)行了不同程度的優(yōu)化，如凝集素和生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用極大地增強(qiáng)了其檢測(cè)的靈敏度[11]。此外，ELISA系統(tǒng)也不斷提高相關(guān)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的靈敏度。除ELISA外，更多具有酶活性的模擬酶的研究正在進(jìn)行。Zhang等[13]使用夾心型比色法在可見光下改變3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethyl benzidine，TMB）的顏色，并通過TMB溶液水平的顏色變化量化癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）。該方法在血清樣品分析中顯示出了良好的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。Aggarwal等[14]通過ELISA驗(yàn)證了所選擇的生物標(biāo)志物，即α-1抗胰凝乳蛋白酶（α-1-antichymotrypsin，ACT）、觸珠蛋白（haptoglobin，HAP）和視黃醇結(jié)合蛋白（retinol-binding protein，RBP），結(jié)果顯示，活動(dòng)性腎病患者的ACT水平高于其他組患者，且與腎臟系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）有很好的相關(guān)性；同時(shí)，該研究中活動(dòng)性腎病患者的HAP水平高于其他組患者的10倍以上；治療后，ACT、HAP、RBP水平比治療6、12個(gè)月時(shí)降低；多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，ACT是區(qū)分活動(dòng)性腎病和SLEDAI的最佳標(biāo)志，尿液中的HAP、ACT和RBP是狼瘡腎炎活動(dòng)的潛在生物標(biāo)志物。

2 液體活組織檢查

液體活組織檢查，即液體活檢，是體外診斷的一個(gè)分支，指使用無創(chuàng)血液檢測(cè)技術(shù)來監(jiān)測(cè)腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤釋放到血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和外泌體等，是用于檢測(cè)腫瘤和輔助治療的突破性技術(shù)[15]。既往臨床沒有對(duì)液體活檢給予足夠重視，且沒有發(fā)現(xiàn)其潛在的應(yīng)用價(jià)值。隨著研究深入，CTC的潛在應(yīng)用價(jià)值逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，液體活檢的研究呈爆發(fā)性增長(zhǎng)，現(xiàn)已逐漸應(yīng)用于臨床。與組織活檢相比，液體活檢可以早期篩查和監(jiān)測(cè)腫瘤標(biāo)志物，具有無創(chuàng)、易取樣、操作簡(jiǎn)便和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但存在檢測(cè)費(fèi)用較高且沒有統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)等不足。Zhang等[16]的研究表明，CTC、ctDNA和外泌體檢測(cè)優(yōu)勢(shì)明顯，作為一種非侵入性檢測(cè)方法，可以在治療前、治療期間和進(jìn)展期間提供診斷和預(yù)后信息。Rolfo等[17]研究表明，液體活檢是非侵入性的檢測(cè)方式，應(yīng)用前景廣闊，在臨床中可方便快捷的立即實(shí)施。Cohen等[18]對(duì)66例胰腺導(dǎo)管腺癌患者采用無創(chuàng)血漿液體活檢，探討多個(gè)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)是否優(yōu)于任何單個(gè)標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30%的患者存在鼠類肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）突變，血漿中發(fā)現(xiàn)的每個(gè)突變均與患者原發(fā)腫瘤中發(fā)現(xiàn)的突變相同（一致性100%）。聯(lián)合檢測(cè)KRAS與4個(gè)閾值蛋白質(zhì)，即CEA、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）可將檢測(cè)靈敏度提高至64%。

2.1 CTC

在原發(fā)性乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等的形成和生長(zhǎng)早期，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤脫落，然后進(jìn)入血流循環(huán)形成CTC。臨床可利用這些CTC不同的物理和生物學(xué)特性采用不同的技術(shù)來富集和檢測(cè)。CTC分析被認(rèn)為是腫瘤患者的實(shí)時(shí)“液體活檢”。CTC的檢測(cè)和分子表征是腫瘤轉(zhuǎn)化研究中最活躍的領(lǐng)域之一，超過400項(xiàng)臨床研究將CTC作為生物標(biāo)志物[11,19]。CTC主要采用免疫組化法，近年來，多種改進(jìn)CTC檢測(cè)方法的創(chuàng)新技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床，包括CTC微芯片、過濾裝置、定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析和自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)。但分子特征研究表明，CTC有很強(qiáng)的異質(zhì)性，這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)需要多種方法來捕獲所有相關(guān)的CTC子集[19]。越來越多的證據(jù)表明，CTC能夠?qū)崟r(shí)反映腫瘤進(jìn)展，且這些信息在全身治療的背景下可能特別有用。預(yù)計(jì)CTC有助于在特定治療窗口內(nèi)向特定的腫瘤患者群體指導(dǎo)特定的靶向治療，是個(gè)體化醫(yī)療的標(biāo)志。Busetto等[20]為評(píng)估CTC對(duì)155例高危非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌患者的預(yù)后評(píng)估價(jià)值，并評(píng)估兩種不同CTC分離方法的療效和可靠性，平均隨訪28個(gè)月的結(jié)果顯示，65例（41.9%）復(fù)發(fā)，27例（17.4%）疾病進(jìn)展，9例（5.8%）淋巴結(jié)和（或）骨轉(zhuǎn)移，其他正常。在對(duì)CTC的分析中，Cell Search自動(dòng)化系統(tǒng)（A組）陽性患者20例（19.8%），CELLection Dynabeads手動(dòng)系統(tǒng)（B組）陽性患者24例（44.4%）；CTC陽性與首次復(fù)發(fā)時(shí)間密切相關(guān)，A組CTC陽性患者的復(fù)發(fā)率為75%，B組CTC陽性患者的復(fù)發(fā)率為83%；此外，疾病進(jìn)展時(shí)間也與CTC密切相關(guān)。表明CTC可作為高危非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌患者危險(xiǎn)分層和預(yù)后的潛在標(biāo)志物，以預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)和疾病進(jìn)展。Arnoletti等[21]的研究結(jié)果顯示，壺腹周圍病變、壺腹腺癌和遠(yuǎn)端膽管癌患者的CTC增殖能力較高，并對(duì)凋亡具有抵抗力，在接受術(shù)前化療的壺腹周圍病變、壺腹腺癌和遠(yuǎn)端膽管癌患者中，壺腹周圍病變患者的CTC明顯增殖且對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞毒性的抵抗力明顯降低。培養(yǎng)7天后，來自胰腺導(dǎo)管腺癌、遠(yuǎn)端膽管癌和壺腹腺癌患者的CTC募集了多種免疫細(xì)胞類型，包括CD105+CD14+髓樣成纖維細(xì)胞，以組織成類球體簇。只有在壺腹腺癌和遠(yuǎn)端膽管癌衍生的混合細(xì)胞反應(yīng)培養(yǎng)物（mixed cell reaction cultures，MCR）中，簇形成才能促進(jìn)CTC存活、生長(zhǎng)和成纖維細(xì)胞分化。流式細(xì)胞儀消耗了CTC或髓樣成纖維細(xì)胞，消除了簇網(wǎng)絡(luò)的形成，而這些細(xì)胞群體的重新引入又重新構(gòu)建了這種能力。該研究結(jié)果表明，胰腺導(dǎo)管腺癌、遠(yuǎn)端膽管癌的CTC在門靜脈循環(huán)內(nèi)的生存與多細(xì)胞類型簇內(nèi)的免疫細(xì)胞的相互作用得到支持，這些簇可以作為局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性進(jìn)展的載體。

2.2 ctDNA

對(duì)腫瘤組織進(jìn)行基因分型以尋找可操作信息的體細(xì)胞遺傳改變已成為臨床腫瘤學(xué)的常規(guī)實(shí)踐。雖然這些序列改變具有很高的信息量，但腫瘤組織取樣具有明顯的內(nèi)在局限性，這是因?yàn)槟[瘤組織僅提供腫瘤異質(zhì)性的快照，受到腫瘤異質(zhì)性引起的選擇偏倚，并且可能難以獲得。經(jīng)過細(xì)胞凋亡或壞死的細(xì)胞將DNA的無細(xì)胞片段釋放到血液中，且ctDNA的負(fù)荷與腫瘤分期和預(yù)后相關(guān)[22]。雖然ctDNA具有易降解、含量低等缺點(diǎn)，但DNA分析的靈敏度和準(zhǔn)確度研究的最新進(jìn)展，允許改變腫瘤中發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞基因組從而進(jìn)行ctDNA基因分型。檢測(cè)和量化腫瘤突變的能力可有效地實(shí)時(shí)追蹤腫瘤動(dòng)態(tài)，并用作液體活檢，應(yīng)用于既往不可能的各種臨床和研究。

在腫瘤學(xué)中，檢測(cè)源自ctDNA具有三個(gè)主要原因，包括從正常ctDNA中區(qū)分ctDNA，存在有時(shí)極低水平的ctDNA，以及樣品中突變片段數(shù)量的準(zhǔn)確定量[23]。通過突變來定義腫瘤DNA的存在有助于區(qū)分正常和腫瘤ctDNA。這些體細(xì)胞突變，通常是單堿基對(duì)的替換，僅存在于腫瘤細(xì)胞或癌前細(xì)胞的基因組中，且不存在于同一個(gè)正常體細(xì)胞的DNA中。這確保了ctDNA作為生物標(biāo)志物的精細(xì)生物學(xué)特異性。因此，若腫瘤DNA片段在腫瘤患者的循環(huán)中豐富，則使用所有識(shí)別體細(xì)胞突變的DNA測(cè)序方法來鑒定ctDNA均較容易。不幸的是，檢測(cè)源自腫瘤的ctDNA存在很大的挑戰(zhàn)，主要是因?yàn)閏tDNA通常僅占總ctDNA的1.0%。由于數(shù)字基因組技術(shù)允許在復(fù)雜的DNA混合物中計(jì)數(shù)罕見的突變體，因此，近期臨床對(duì)腫瘤患者ctDNA的研究逐漸增多。Schwaederlé等[24]為確定非小細(xì)胞肺腺癌患者血液ctDNA的基因組變化，對(duì)88例晚期肺腺癌患者進(jìn)行了全面的血清ctDNA檢測(cè)，34例患者進(jìn)行了下一代測(cè)序，25例沒有進(jìn)行組織分子檢測(cè)，結(jié)果顯示，72例（82%）患者的ctDNA基因改變數(shù)量≥1，最常見的改變依次為TP53（44.3%）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）（27.3%）、MET（14.8%）、KRAS（13.6%）和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）（6.8%）基因。對(duì)于任何可檢測(cè)ctDNA改變的晚期肺腺癌患者，EGFR改變的一致性率為80.8%（ctDNA和組織測(cè)試之間100%vs61.5%，P=0.04）。25例患者（28.4%）接受了匹配≥1 ctDNA改變的治療，結(jié)果顯示，22例可評(píng)估患者中，72.3%（16/22）的患者實(shí)現(xiàn)了≥6個(gè)月的疾病穩(wěn)定或部分緩解。隨后采用第三代EGFR抑制劑治療了5例經(jīng)ctDNA檢測(cè)的EGFRT790M突變患者，所有患者均達(dá)到≥6個(gè)月的疾病穩(wěn)定或部分緩解。變異等位基因數(shù)量≥1且變異等位基因分?jǐn)?shù)≥5%患者的中位生存期明顯短于編譯等位基因分?jǐn)?shù)＜5%的患者（P=0.012）。Riva等[25]調(diào)查了非轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌患者ctDNA檢測(cè)對(duì)新輔助化療的評(píng)估價(jià)值，并在手術(shù)后檢測(cè)出最少的殘留腫瘤組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依據(jù)液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）制定的ctDNA檢測(cè)在基線時(shí)即可達(dá)到75%的檢測(cè)率。在新輔助化療期間，ctDNA水平迅速下降，且術(shù)后未發(fā)現(xiàn)最小的殘留病，但新輔助化療期間ctDNA水平的緩慢降低與較短的生存期密切相關(guān)。

2.3 外泌體檢測(cè)

外泌體是“生物活性囊泡”的最新家族成員，來源于多泡體與質(zhì)膜的融合，以及管腔內(nèi)囊泡的細(xì)胞外釋放，可促進(jìn)細(xì)胞間通訊[16]。最近的研究多集中于外泌體的生物發(fā)生和組成，以及對(duì)外來體釋放的調(diào)節(jié)。研究已經(jīng)證實(shí)，外泌體由造血和非造血來源的細(xì)胞釋放，但其功能仍不清楚。另一項(xiàng)研究表明，外泌體也可能促進(jìn)感染因子的細(xì)胞間傳播[26]。此外，從感染了各種細(xì)胞內(nèi)病原體（包括結(jié)核分枝桿菌和弓形蟲）的細(xì)胞中分離的外泌體，顯示含有微生物成分且可以促進(jìn)抗原呈遞和巨噬細(xì)胞活化，表明外泌體可以在免疫監(jiān)視中起作用[27]。Bach等[28]發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性腫瘤微環(huán)境中，腫瘤組織分泌的外泌體和miRNA可以被其他細(xì)胞類型內(nèi)化，這些外泌體中裝載的miRNA可能會(huì)轉(zhuǎn)移到受體利基細(xì)胞中，從而對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行全基因組調(diào)控。在腫瘤微環(huán)境下，外泌體miRNA如何促進(jìn)耐藥性的發(fā)展尚未得到充分描述。Cheng等[29]研究表明，外泌體是通過穿梭貨物（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA、雙鏈DNA、非轉(zhuǎn)錄RNA和miRNA）轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分中轉(zhuǎn)移的介質(zhì)，這種現(xiàn)象在腫瘤發(fā)生和耐藥性中均已表明。同時(shí)引入的外泌體提取的新方法，注重在卵巢癌外泌體的作為生物標(biāo)志物和化療靶點(diǎn)的新興作用，并探討其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)是在分子水平上研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，以解釋生命現(xiàn)象。分子生物學(xué)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、通量高等特點(diǎn)，但檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高。分子生物學(xué)的主要研究領(lǐng)域是蛋白質(zhì)系統(tǒng)，蛋白質(zhì)-核酸系統(tǒng)/脂質(zhì)系統(tǒng)（即生物膜）[30]。目前，用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的分子生物學(xué)技術(shù)包括PCR、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）。

PCR是一種廣泛使用的體外擴(kuò)增DNA技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、靈敏、高效、高特異度和快速性的特點(diǎn)。通過經(jīng)典PCR開發(fā)的技術(shù)，如RT-PCR、擴(kuò)增融合PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等通常用于檢測(cè)腫瘤，如肺癌、結(jié)腸直腸癌和乳腺癌[31]。此外，甲基化特異性PCR對(duì)DNA甲基化檢測(cè)的靈敏度較高。Lan等[32]研究發(fā)現(xiàn)，甲基化特異性PCR檢測(cè)胃癌標(biāo)志物的檢出率明顯高于RT-PCR。FISH是將標(biāo)記的探針與單鏈核酸片段配對(duì)，并在非放射性分子生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)下使用原位雜交，通過熒光標(biāo)記的取代同位素觀察靶序列的分布。盡管FISH是一種低通量測(cè)試，但它不需要放射性同位素標(biāo)記，具有高探針穩(wěn)定性、更經(jīng)濟(jì)、更安全及良好的特異性，定位準(zhǔn)確，出結(jié)果快速。FISH可以顯示不同的顏色，以便同時(shí)檢測(cè)多個(gè)序列，且檢測(cè)周期短。目前，F(xiàn)ISH在腫瘤細(xì)胞、突變?nèi)旧w和染色體重排中具有重要意義。

4 小結(jié)與展望

目前，傳統(tǒng)的腫瘤診斷方法包括病理活檢、B超、X線、計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）、內(nèi)窺鏡檢查和磁共振成像（MRI），但腫瘤的早期診斷受上述診斷效果的限制。部分檢測(cè)方法難以應(yīng)用于基層醫(yī)院，且由于昂貴的檢測(cè)費(fèi)用增加了患者家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，選擇一種有效的腫瘤早期診斷方法十分關(guān)鍵，腫瘤標(biāo)志物的篩選已成為腫瘤早期診斷最有價(jià)值的指標(biāo)。腫瘤標(biāo)志物通常分布在尿液、血清、細(xì)胞、體液或組織中，常見的腫瘤標(biāo)志物包括激素、碳水化合物抗原、酶標(biāo)記物、癌胚蛋白和腫瘤抗原等。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前，已發(fā)現(xiàn)了大量的具有更高靈敏度或特異度的腫瘤標(biāo)志物，且出現(xiàn)了不同的檢測(cè)方法，但每種標(biāo)志物均有其自身的特征。如何整合不同的檢測(cè)方法，提高腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的靈敏度、特異度和穩(wěn)定性是研究人員一致探討的難點(diǎn)。因此，無論使用何種材料和方法，早期檢測(cè)低水平的腫瘤標(biāo)志物，指導(dǎo)臨床治療是研究和開發(fā)所追求的最終目標(biāo)。