線粒體鈣離子調(diào)控腫瘤發(fā)展的作用及機制研究進展

陶雪，魏立彬，郭青龍

（江蘇省南京市鼓樓區(qū)童家巷24 號中國藥科大學玄武門校區(qū)，江蘇省腫瘤發(fā)生與干預重點實驗室，江蘇 南京）

0 引言

線粒體是細胞的能量工廠，能夠合成大量的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）為細胞供能，其提供的能量約占細胞生命活動所需總能量的95%[1]。除此以外，線粒體還參與了細胞凋亡、細胞周期調(diào)控等一系列的細胞生物過程[2]。線粒體是具有雙層膜的鈣存儲細胞器，鈣離子（calcium ion，Ca2+）分布在其膜間隙和基質(zhì)中[3]。Ca2+通過線粒體上不同的轉(zhuǎn)運機制穿梭于線粒體與細胞質(zhì)之間，調(diào)節(jié)線粒體乃至整個細胞的生命活動。

Ca2+是機體內(nèi)一種不可或缺的物質(zhì)，既是細胞的第二信使，又與細胞增殖、細胞程序性死亡、肌肉刺激收縮、基因轉(zhuǎn)錄、信號傳遞等密切相關，在細胞各功能的正常運作中必不可少[4]。而細胞內(nèi)Ca2+的水平依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放和細胞外空間Ca2+的流入。在正常情況下，維持一定水平的Ca2+可促進細胞存活。

Ca2+穩(wěn)態(tài)的異常是許多疾病的共同病理機制之一。研究表明，Ca2+不但能被線粒體攝取和釋放，而且線粒體對Ca2+的攝取和釋放過程在維持胞漿鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[5]。有研究報道，線粒體內(nèi)游離Ca2+的濃度與其能量代謝的水平以及膜通透性的改變密切相關[6-8]；線粒體Ca2+的攝取和釋放過程也會影響細胞內(nèi)的鈣信號[9]。這些鈣信號相關活動的異常與心臟病、癲癇以及神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關[10-12]。

目前，惡性腫瘤已是全球范圍內(nèi)最嚴重的公共問題之一，其發(fā)病率與死亡率逐年升高，躍居各類疾病死因的第一位，嚴重危害人類健康。據(jù)估計到2030 年，全球可能將新增2640 萬例腫瘤患者，大約1700 萬人可能死于惡性腫瘤[13]。因此，本文就線粒體Ca2+對腫瘤細胞發(fā)展的調(diào)控作用及分子機制進行綜述，為以線粒體Ca2+調(diào)控為靶標的腫瘤治療提供思路與基礎。

1 線粒體Ca2+的調(diào)控

線粒體是第一個被發(fā)現(xiàn)的參與Ca2+轉(zhuǎn)運的細胞器。線粒體是雙層膜的鈣存儲器，由于線粒體外膜具有Ca2+高度通透性，因此膜間隙內(nèi)的Ca2+濃度與胞漿內(nèi)的Ca2+濃度相當。在細胞靜息狀態(tài)下，線粒體基質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度約在0～100nmol/L 之間，與胞漿內(nèi)相當[14]。當細胞處于興奮狀態(tài)時，胞漿內(nèi)Ca2+濃度可升到2～3μmol/L，而線粒體基質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度可升至10μmol/L，甚至更高[15-16]。線粒體對Ca2+的攝取與釋放可通過單向轉(zhuǎn)運機制或轉(zhuǎn)運體進行調(diào)控。

1.1 Ca2+的攝取

20 世紀50 年代，科研人員發(fā)現(xiàn)離體的線粒體可以攝取Ca2+[17]。細胞中有兩個鈣池中的Ca2+可以被攝取進入線粒體：一個是細胞質(zhì)中的，另一個是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）中的。

線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體（mitochondrial calcium uniporter，MCU）是普遍存在于線粒體內(nèi)膜（inner mitochondrial membrane，IMM）中的Ca2+通道，通常被認為是相關模型中關鍵的Ca2+轉(zhuǎn)運蛋白。敲除MCU 幾乎可以完全抑制離體線粒體對Ca2+的攝取[18]。

MCU 是具有電生理特性的離子通道，通過MCU 攝取的Ca2+受電化學梯度的驅(qū)動。完整的Ca2+攝取調(diào)節(jié)復合物由MCU 和調(diào)節(jié)MCU 的相關分子共同組成。這種MCU 的調(diào)節(jié)分子包括MCU 調(diào) 節(jié) 蛋 白1（MCU regulator 1，MCUR 1）、MCU 調(diào) 節(jié)蛋白2（MCU regulator 2，MCUR 2）、線粒體鈣離子攝入蛋白1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）和線粒體鈣離子攝入蛋白2（mitochondrial calcium uptake 2，MICU2）[19]等。

其中，MCUR 1 是MCU 復合物的次級子單元，其能允許離子流進入線粒體基質(zhì)[20]。MCUR1 的下調(diào)可以降低Ca2+的通量，減少線粒體氧化磷酸化和ATP 的產(chǎn)生并激活AMPK 依賴性自噬[21]。而MCUR1 在肝癌細胞中發(fā)生上調(diào)，其表達與癌細胞的存活和腫瘤的生長密切相關。在該通路中，MCUR1 誘導了線粒體Ca2+的積累和ROS 的產(chǎn)生，表明MCUR1 與MCU 的結合對于功能性MCU 復合物是必需的，并且Ca2+進入線粒體是癌細胞的先決生存因子[22]。

1.2 Ca2+的釋放

線粒體內(nèi)膜上存在著一種鈉鈣鋰轉(zhuǎn)運體（Na+/Ca2+Li+-permeable exchanger，NCLX），它是Na+ 依賴的鈉鈣反向交換通道，能夠正向調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)Ca2+外流。

當線粒體內(nèi)Ca2+濃度過高時，會使NCLX 的活性增強，引起線粒體內(nèi)膜上線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablize transition pore，MPTP）的開放。而Ca2+是調(diào)節(jié)MPTP 孔的中樞，既可以直接調(diào)節(jié)MPTP 本身，也可通過調(diào)節(jié)ADP/ATP 的平衡、線粒體膜電位、活性氧/ 活性氮的水平以及蛋白水平對MPTP 進行調(diào)控[23]。

研究發(fā)現(xiàn)，MPTP 具有一個重要的性質(zhì)：MPTP 開放引起的ADP 的增加和Mg2+/Ca2+的恢復均是可逆的，這種可逆性使MPTP 的開放有持續(xù)開放和瞬時開放兩種模式，可以啟動細胞的死亡信號通路或者維持細胞正常的生理功能[24]。

此外，線粒體上還存在著H+/Ca2+反向轉(zhuǎn)運通道蛋白1（leucine zipper EF hand-containing transmembrane protein 1，Letm1）。當線粒體基質(zhì)中的Ca2+濃度較低時，Letm1 可轉(zhuǎn)運Ca2+進入基質(zhì)；反之，則轉(zhuǎn)運Ca2+流出。研究還發(fā)現(xiàn)，沉默Letm1，盡管存在MCU，依然可以抑制Ca2+的內(nèi)流[25]。

2 線粒體Ca2+與腫瘤細胞能量代謝

Ca2+作為第二信使幾乎參與了細胞內(nèi)所有的生理活動[26]。從克雷布斯于1959 年發(fā)現(xiàn)Ca2+能激活磷酸激酶以來，人們認識到Ca2+是潛在的新陳代謝調(diào)節(jié)劑已經(jīng)50 年了[27-29]。線粒體最初被認為是具有攝取大量Ca2+能力的“Ca2+池”，且被認為僅在胞質(zhì)Ca2+超載的情況下才會發(fā)生線粒體對Ca2+的攝取作用[30]。但隨后在19 世紀60 和70 年代，人們發(fā)現(xiàn)生理濃度的Ca2+能調(diào)節(jié)線粒體的脫氫酶：甘油磷酸脫氫酶[31]。因此，Ca2+能刺激糖原分解和葡萄糖氧化，從而導致ATP 供應增加。

在19 世紀70 和80 年代，理查德·丹頓和吉姆·麥考馬克的研究也表明，線粒體中Ca2+活化的脫氫酶使他們提出了一種方案，其中胞質(zhì)Ca2+濃度的增加被傳遞到線粒體，線粒體攝取Ca2+能夠活化基質(zhì)酶，通過激活丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶刺激ATP 的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)能量代謝[32-33]。這種“平行激活模型”提供了一種機制，其中Ca2+刺激了由各種激素、肌肉收縮或心臟負荷增加等生理活動引起的能量消耗過程，還提供了使細胞能夠上調(diào)ATP 供給以跟上這種能量消耗的手段[34]。

而腫瘤細胞中的代謝重編程被認為是癌癥的標志，它參與了腫瘤的生長和發(fā)展。在病程中，腫瘤細胞會發(fā)展出整體代謝適應性，使其能夠在低氧氣和養(yǎng)分的腫瘤微環(huán)境中生存。

因此，Ca2+影響線粒體的功能改變從而影響細胞能量代謝與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，包括線粒體功能障礙、代謝轉(zhuǎn)為有氧糖酵解和線粒體失調(diào)[35]。目前，腫瘤細胞代謝的適應性是癌癥治療的主要限制，并且與治療藥物的耐藥性高度相關。

3 線粒體Ca2+與腫瘤細胞自噬

自噬在維持細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用。因此，自噬失調(diào)會破壞正常生理過程，并牽涉包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的發(fā)病機理。自噬是一種細胞分解代謝途徑，在分離囊泡、自噬體和提供水解酶的溶酶體融合后，可導致蛋白質(zhì)和細胞器的降解和再循環(huán)。自噬的分子過程是復雜的，涉及包括自噬相關（Atg）蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾種蛋白質(zhì)進行成核，延伸和融合的順序步驟[36-38]。自噬具有兩個主要的生理學作用：作為質(zhì)量控制機制分解功能失調(diào)的蛋白質(zhì)或細胞器，以及在營養(yǎng)脅迫下為了維持代謝需求而回收生物大分子[39-40]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，自噬可在癌癥中發(fā)揮兩個作用：在腫瘤早期具有保護作用，而在腫瘤晚期則促進腫瘤生長。敲除小鼠的自噬基因主要是通過增加氧化應激來增加腫瘤的多樣性，這表明自噬可以防止癌癥的發(fā)展[41-42]。然而，在已確定的腫瘤中，細胞外部條件（缺氧、低養(yǎng)分和生長因子、活性氧、乳酸）以及致癌基因Ras 和p53 對自噬的激活維持了腫瘤細胞的存活，并且有利于腫瘤的生長[43]。另外，自噬通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞與正常細胞之間的相互作用而在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[44]。除了在腫瘤起始和腫瘤生長中起著明顯相反的作用外，自噬還與癌癥進展相關。與原發(fā)性腫瘤相比，轉(zhuǎn)移灶中自噬的標志物增加[45]，并與預后不良有關[46]。

目前研究者們認為：細胞內(nèi)Ca2+是細胞自噬的潛在調(diào)節(jié)劑[47-48]，且具有“雙刃劍”的特點。

3.1 Ca2+激活自噬

一些研究表明，線粒體相關ER 膜（Mitochondrial-Associated ER Membranes，MAM）的破壞會激活自噬。MAM 是Ca2+從ER轉(zhuǎn)移到線粒體以調(diào)節(jié)線粒體酶的重要部位。Ca2+流主要通過ER膜中的IP3 受體和TRPM8 發(fā)生[49]，也通過線粒體膜上的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）、線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運蛋白（MCU）和瞬時受體蛋白Melastatin 2（TRPM2）發(fā)生[50]。ER 和線粒體之間的Ca2+流的中斷會降低OXPHOS、誘導代謝應激并激活自噬作為生存機制[49]。然而，與正常細胞不同，腫瘤細胞中MAM 破壞引起的自噬激活似乎不足以維持所需的能量水平，從而導致腫瘤細胞死亡和腫瘤生長降低[51]。

另外，Hoyer-Hansen 等也證明了，Ca2+激動劑，如毒胡蘿卜素、ATP 和離子霉素，通過Ca2+激活的激酶CAMKK 刺激Hela 細胞自噬。該激酶可直接激活AMPK 來抑制mTOR[48]。最近，已經(jīng)確定了該途徑是人神經(jīng)母細胞瘤細胞中淀粉樣蛋白-β 肽誘導的自噬體形成所必需的[52]。與Ca2+對自噬的激活作用相一致，研究人員也發(fā)現(xiàn)線粒體裂變介導的Ca2+信號傳導顯著誘導了HCC 細胞自噬[53]。

3.2 Ca2+抑制自噬

另有一些研究小組發(fā)現(xiàn)Ca2+對自噬的抑制作用[54]。Khan 等發(fā)現(xiàn)，在雞B 淋巴細胞系中，自噬流可能受到ER 釋放的IP3R 依賴性Ca2+的負調(diào)控[55]。

目前發(fā)現(xiàn)Ca2+抑制自噬的途徑有以下幾種：

（1）P3R 介導Ca2+降低Beclin1 的釋放，從而減少自噬體生成，抑制自噬[56]； （2）P3R 介導Ca2+活化鈣蛋白酶，使自噬相關基因-5蛋白與自噬相關基因-12 蛋白分離，降低二者復合體水平，抑制自噬[57]；（3）ER 釋放到線粒體的Ca2+增多，使得三羧酸循環(huán)增加，ATP 生成增多，抑制自噬[58]；（4）P3R 介導Ca2+進入線粒體，導致ATP 生成增加，AMPK 被抑制，從而抑制自噬[58]。

因此，Ca2+可能對自噬具有不同的調(diào)節(jié)作用，具體可能取決于Ca2+信號傳導的時空參數(shù)、營養(yǎng)成分和生長因子的利用率。而細胞主要是通過自噬來對抗刺激來，因此Ca2+會影響自噬從而導致正常細胞癌變以及影響腫瘤細胞的生長。

4 線粒體Ca2+與腫瘤細胞凋亡

細胞凋亡是一種高度保守的程序性死亡過程。凋亡是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控。線粒體不僅能為細胞提供大量能量，作為細胞內(nèi)的鈣庫之一也能通過調(diào)控Ca2+濃度來調(diào)節(jié)細胞的存活與死亡[59]。

對于Ca2+信號傳導調(diào)節(jié)層，其為細胞提供了極大的靈活性，使得細胞可以響應內(nèi)部和外部刺激來微調(diào)細胞的生理過程。然而，這個敏感的系統(tǒng)可以被影響，從而在細胞中驅(qū)動惡性轉(zhuǎn)化。眾所周知，幾種類型的腫瘤細胞都經(jīng)歷了其內(nèi)部Ca2+信號轉(zhuǎn)導機制的廣泛重組，從而促進了腫瘤的發(fā)生[58]。

線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間可通過VDAC1、IP3R 和SERCA 在內(nèi)的幾種Ca2+信號蛋白進行鈣離子的交流，在腫瘤的進程中發(fā)揮著重要作用。例如，在幾種類型的非小細胞肺癌和宮頸癌中，VDAC1的表達水平與腫瘤的生長和侵襲相關[60]。最近在這方面發(fā)現(xiàn)，異種移植模型的細胞中，VDAC1 的遺傳破壞顯示出線粒體膜電位和ATP 含量的降低，從而導致了遷移率降低和腫瘤消退[61]。而膀胱癌細胞中IP3R1 的下調(diào)，通過減少ER- 線粒體Ca2+的攝取來防止線粒體Ca2+的超載，從而減弱順鉑介導的細胞凋亡[62]。在轉(zhuǎn)化發(fā)生的結腸上皮細胞中，SERCA3 亞型的顯著減少或丟失也證明了Ca2+信號在腫瘤發(fā)生中發(fā)生了重塑[63]。

最近發(fā)現(xiàn)，在幾種癌癥類型中，兩種新機制的失調(diào)會影響蛋白酶體的更新，從而通過影響IP3R3 蛋白干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體間Ca2+交流，調(diào)控腫瘤細胞的凋亡敏感性[64]。

（1）抑癌蛋白PTEN 和F-box/LRR 重復蛋白2（FBXL-2）競爭與IP3R3 的結合（后者是屬于Skip-Cullin1-F-box 蛋白家族的一種E3 泛素連接酶成分），從而減慢了FBXL-2 介導的IP3R3 蛋白酶體降解[65]。這代表了一種新的機制，PTEN 的這種缺失使得腫瘤細胞能夠避開凋亡，由于IP3R3 的下調(diào)使促凋亡的線粒體Ca2+轉(zhuǎn)移受到損害。

（2）抑癌蛋白BRCA1 相關蛋白1（BAP1）是一種去泛素化酶，其通過穩(wěn)定IP3R3 來促進ER-線粒體Ca2+的轉(zhuǎn)移。在長期的環(huán)境壓力下，BAP1 的功能會嚴重受損，這與BAP1 基因的獲得性失活突變有關。BAP1 的丟失會導致IP3R3 的下調(diào)，從而阻礙受損細胞的有效凋亡清除，并有利于腫瘤的發(fā)生和惡性細胞的存活[66]。

此外，癌基因（如Akt/PKB 和FATE1）以及抑癌蛋白（如PML和PTEN）可以通過Ca2+信號調(diào)節(jié)在癌癥的發(fā)展中發(fā)揮其他作用[62]，例如凋亡抗性。由于線粒體Ca2+的超載與細胞凋亡死亡相關，因此在MAM 處修飾ER-線粒體Ca2+的轉(zhuǎn)移會改變細胞凋亡的敏感性[67]。腫瘤細胞可以獲得細胞死亡的抗性，例如，通過過度表達抑制IP3R 介導Ca2+信號傳導的蛋白（如Akt78）或通過增加MAM 處的跨膜距離，使ER-線粒體Ca2+轉(zhuǎn)移效率降低[68]，從而降低腫瘤細胞的凋亡敏感性。

5 結語

Ca2+通過線粒體上的各種轉(zhuǎn)運機制穿梭于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與胞質(zhì)之間，調(diào)節(jié)著細胞的各項生理活動。線粒體內(nèi)的Ca2+濃度會影響線粒體ATP 的合成、線粒體MPTP 的開放、胞質(zhì)內(nèi)鈣信號及胞漿鈣穩(wěn)態(tài)的維持。因此，線粒體Ca2+具有重要的生理意義，它的異常與許多重要疾病相關，尤其在一些惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。

線粒體通過MCU 等攝取Ca2+進入而通過NCLX 等釋放Ca2+流出，調(diào)節(jié)著線粒體內(nèi)與胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度，維持著Ca2+穩(wěn)態(tài)。細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的失衡普遍存在于細胞的死亡過程中，而細胞鈣信號的重組普遍發(fā)生在腫瘤細胞的進程中。

線粒體的結構與功能比較復雜，并且處于不斷地分裂融合的動態(tài)過程中，還與細胞內(nèi)各個細胞器之間聯(lián)系緊密。因此，線粒體各個方面功能的改變都與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關。然而，目前科研人員對于線粒體內(nèi)Ca2+的各項機制了解的還不全面，未來很有必要對其進行更深入的研究與探索，以期更好地了解線粒體相關腫瘤的機制，從而提供新的治療思路。