miR-199a調(diào)控NF-κB通路在肺炎支原體免疫發(fā)病中的作用研究①

馮日昇 林新春 胡文潔 郭燕軍

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院,河南省兒童醫(yī)院，鄭州兒童醫(yī)院普內(nèi)科，鄭州 450000)

支原體肺炎是一種常見的呼吸道感染性疾病，在各種獲得性肺炎中約占10%，感染肺炎支原體是獲得性肺炎的重要病因[1]。研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的疾病，如哮喘、冠心病、慢性阻塞性肺疾病等與肺炎支原體感染有關(guān)，因此對(duì)其進(jìn)行研究具有重要臨床意義[2-4]。miR-199a是一種廣泛存在于各種真核生物中的微小RNA(microRNA，miRNA)，能和靶基因mRNA的特定位點(diǎn)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合或通過吸附lncRNA，如核仁小分子RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1)介導(dǎo)多種生理過程[5]。miR-199a參與調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)，動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生含有miR-199a的外泌體，進(jìn)而抑制外周血中單核細(xì)胞趨化和炎癥因子釋放，減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞形成，最終減輕炎癥反應(yīng)[6]；此外，研究發(fā)現(xiàn)外周靜脈血miR-199a的降低可能與肝移植術(shù)后大鼠免疫排斥反應(yīng)有關(guān)，因而推測(cè)miR-199a可能參與調(diào)節(jié)肺炎支原體免疫發(fā)病[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)調(diào)節(jié)自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病過程，激活NF-κB通路可促使炎癥細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)至甲狀腺組織，引起炎癥反應(yīng)[8]；在肺炎支原體感染小鼠肺組織中NF-κB上調(diào)，克拉霉素治療肺炎支原體感染時(shí)可顯著降低其表達(dá)水平，表明NF-κB在肺炎支原體免疫發(fā)病中起重要作用[9]；而在miR-199a對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞增殖影響及機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-199a可抑制NF-κB活性，因此認(rèn)為miR-199a可能通過調(diào)控NF-κB通路調(diào)節(jié)肺炎支原體免疫發(fā)病[10]。為了探討這一機(jī)制，本研究通過建立肺炎支原體小鼠模型對(duì)其進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c小鼠，8周齡，體質(zhì)量20～25 g、雌雄各半，許可證號(hào)：SCXK(滬)-2009-0001，購于蘇州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。在清潔、安靜的環(huán)境中12 h/12 h交替光照，18～22℃，相對(duì)濕度40%～70%，噪音小于60分貝條件下飼養(yǎng)，定時(shí)清理鼠籠，更換墊料，自由飲水、攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要試劑與儀器 肺炎支原體FH型標(biāo)準(zhǔn)株購自上海佰泰科技有限公司；miR-199a agomir(激動(dòng)劑)、miR-199a agomir陰性對(duì)照、miR-199a antagomir(抑制劑)、miR-199a antagomir陰性對(duì)照由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；miR-199a、引物U6由上海生工生物工程股份有限公司合成；IgG、IgM、C3、IL-2、IL-10、IFN-γ及TNF-α ELISA試劑盒、兔源GAPDH、IKK、p-IKK、NF-κB及p-NF-κB一抗、羊抗兔二抗購自美國(guó)Abcam公司；PE-anti-mCD4、FITC-anti-mCD8抗體購自美國(guó)eBionscience公司；蛋白提取試劑盒、HE染色試劑盒均購自上海生工公司；RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；蛋白裂解液、紅細(xì)胞裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天公司。實(shí)驗(yàn)室教學(xué)生物顯微鏡：型號(hào)Eclipse E200，日本尼康公司；石蠟切片機(jī)：型號(hào)RM2235，德國(guó)Leica公司；酶標(biāo)儀：型號(hào)Elx800、蛋白電泳儀：型號(hào)1659001、半干轉(zhuǎn)膜儀：型號(hào)Trans-Blot SD、熒光定量PCR儀：型號(hào)CFX96 Touch Deep Well均購自美國(guó)Bio-Rad公司；高通量DNA合成儀：型號(hào)3900購自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；凝膠成像系統(tǒng)：型號(hào)2500購自上海天能公司等。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立及分組給藥 將肺炎支原體菌株以1∶10接種于培養(yǎng)基，采用10倍稀釋法將菌液稀釋成1×10-7～1×10-1CCU/ml，分別置于8支編號(hào)為1～8的1.5 ml無菌EP 管中(1號(hào)管為原液)，37℃培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)基顏色隨稀釋過程由紅變黃，以培養(yǎng)基顏色不再發(fā)生改變?yōu)榕卸ńK點(diǎn)，發(fā)生顏色改變的菌液最高稀釋度為顏色改變單位(color change unit,CCU)。7 d后，EP管中培養(yǎng)基顏色已不發(fā)生改變，在7號(hào)管處停止，8號(hào)管顏色無變化，表明其CCU值為1×106，即被測(cè)菌液稀釋至1×10-6CCU/ml 時(shí)仍有肺炎支原體菌生長(zhǎng)，稀釋為1×10-7CCU/ml無肺炎支原體菌生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[11]。小鼠吸入乙醚麻醉后，向鼻腔滴入濃度為1×106CCU/ml的肺炎支原體菌液20 μl，后仰小鼠頭部約40度，持續(xù)約1 min，確保支原體菌株進(jìn)入小鼠肺組織，對(duì)照組小鼠以同樣方法鼻腔滴入無肺炎支原體的培養(yǎng)基20 μl[12]。當(dāng)小鼠出現(xiàn)飲食、飲水明顯減少，精神萎靡，活動(dòng)減少，皮毛暗淡、豎起，鼻腔分泌物明顯增多、撓鼻等現(xiàn)象，且HE染色顯示肺部發(fā)生肺泡壁增厚、間隙變大，肺間質(zhì)充血水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，表示造模成功[11]。本研究共造模60只，死亡及失敗10只，成功50只，將其分為模型組、miR-199a agomir組、miR-199a agomir陰性對(duì)照組、miR-199a antagomir組、miR-199a antagomir陰性對(duì)照組，10只/組，另設(shè)對(duì)照組小鼠10只。參照說明書及文獻(xiàn)[13]，用生理鹽水溶解miR-199a agomir、miR-199a agomir陰性對(duì)照、miR-199a antagomir、miR-199a antagomir陰性對(duì)照，配制成終濃度為20 μmol/L的溶液，于造模后第1天尾靜脈注射，1次/d，持續(xù)5 d，劑量為5 ml/kg，對(duì)照組和模型組尾靜脈注射等量生理鹽水，持續(xù)5 d。

1.2.2HE染色及標(biāo)本采集 末次給藥結(jié)束24 h后，各組小鼠乙醚吸入麻醉后頸椎脫臼處死，采集腹主動(dòng)脈血5 ml，解剖取出肺組織，剪取約1 g凍存于-80℃?zhèn)溆茫渌M織用于制備肺組織石蠟切片，HE染色試劑盒染色對(duì)切片進(jìn)行染色，光鏡下根據(jù)肺組織水腫、出血、炎癥浸潤(rùn)等病理改變情況進(jìn)行Holfbauer病理評(píng)分，無上述病理改變，0分；≤25%視野出現(xiàn)上述病理改變，1分；26%～50%視野出現(xiàn)上述病理改變，2分；51%～75%視野出現(xiàn)上述病理改變，3分；>75%視野出現(xiàn)上述病理改變，4分[14]。

1.2.3qRT-PCR分析肺組織中miR-199a表達(dá) 取1.2.2中的凍存肺組織約0.5 g剪碎，加入1 ml RNAiso Plus，參照RNAiso Plus說明書提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系配制、反應(yīng)條件參照說明書要求，以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法對(duì)各組miR-199a表達(dá)進(jìn)行計(jì)算，引物序列見表1。

1.2.4血清TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ、IgG、IgM、補(bǔ)體C3水平測(cè)定 取1.2.2中的腹主動(dòng)脈血3 ml，4℃、3 000 r/min離心15 min，收集上清，ELISA試劑盒分別測(cè)定血清中TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ、IgG、IgM、補(bǔ)體C3含量。

1.2.5外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定 取1.2.2中的腹主動(dòng)脈血2 ml，以紅細(xì)胞裂解液裂解，提取T淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)后將其濃度調(diào)整為1×107個(gè)/ml，吸取100 μl細(xì)胞液，以小鼠PE-anti-mCD4、FITC-anti-mCD8單克隆抗體于4℃避光孵育40 min，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，PBS洗滌，細(xì)胞沉淀后重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中T淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+比例，并計(jì)算其比值。

1.2.6Western blot分析肺組織NF-κB通路相關(guān)蛋白(p-IKK/IKK、p-NF-κB/NF-κB)表達(dá) 取1.2.2中的凍存肺組織約0.5 g剪碎，加入含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，冰浴中制備為勻漿液，4℃、3 000 r/min 離心20 min，收集上清液，以BCA試劑盒測(cè)定蛋白總濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果將各組蛋白溶液濃度調(diào)整至相同，變性后煮沸5 min，取20 μg各組總蛋白行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，室溫下以5%脫脂奶粉封閉2 h，根據(jù)分子量截取目的蛋白條帶置于小盒中，加入兔源IKK、NF-κB、p-IKK、p-NF-κB一抗，4℃孵育過夜，TBST溶液漂洗3次，加入羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，ECL顯色。采用Tanon軟件拍攝蛋白條帶并分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠肺組織中miR-199a水平比較 與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中miR-199a表達(dá)明顯降低(P<0.05)； miR-199a agomir組miR-199a表達(dá)明顯高于模型組，miR-199a antagomir組miR-199a表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05)，見圖1。

表1 qRT-PCR引物序列

2.2各組小鼠肺組織形態(tài)變化 與對(duì)照組相比，模型組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥反應(yīng)、肺泡壁增厚、間隙變大、肺間質(zhì)充血水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，Holfbauer評(píng)分顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，miR-199a agomir組Holfbauer評(píng)分降低，miR-199a antagomir組Holfbauer評(píng)分升高(P<0.05)，見圖2、3。

2.3各組小鼠血清中TNF-α、 IL-6、IFN-γ、IL-10含量比較 與對(duì)照組相比，模型組IL-10含量降低(P<0.05)，TNF-α、IL-6、IFN-γ含量升高(P<0.05)。miR-199a agomir組小鼠IL-10含量高于模型組，TNF-α、IL-6、IFN-γ含量低于模型組(P<0.05)；miR-199a antagomir組小鼠IL-10含量低于模型組，TNF-α、IL-6、IFN-γ含量高于模型組(P<0.05，圖4)。

圖1 各組小鼠肺組織中miR-199a水平Fig.1 Level of miR-199a in lung tissue of mice in each groupNote:Compared with Control group,*.P<0.05;compared with Model group,#.P<0.05.

圖2 HE染色觀察小鼠肺組織形態(tài)變化(×200)Fig.2 HE staining to observe morphological changes of lung tissue in mice (×200)

圖3 各組小鼠Holfbauer評(píng)分Fig.3 Holfbauer scores of mice in each groupNote:Compared with Control group,*.P<0.05;compared with Model group,#.P<0.05.

2.4各組小鼠血清中T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值的比較 與對(duì)照組相比， 模型組小鼠CD4+/CD8+比值顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，miR-199a agomir組小鼠CD4+/CD8+比值升高(P<0.05)；miR-199a antagomir組小鼠CD4+/CD8+比值降低 (P<0.05)；miR-199a agomir陰性對(duì)照組及miR-199a antagomir陰性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5、6。

圖4 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-10含量比較Fig.4 Comparison of TNF-α,IL-6,IFN-γ and IL-10 in serum of mice in each groupNote:Compared with Control group,*.P<0.05;compared with Model group,#.P<0.05.

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠血清中CD4+、CD8+比例Fig.5 Percentage of serum CD4+,CD8+ in mice by flow cytometry

圖6 各組小鼠血清中CD4+/CD8+比值Fig.6 Ratio of CD4+/CD8+ in serum of mice in each groupNote:Compared with Control group,*.P<0.05;compared with Model group,#.P<0.05.

2.5各組小鼠血清中IgG、IgM、補(bǔ)體C3含量比較 與對(duì)照組相比，模型組小鼠IgG、IgM 含量升高(P<0.05)，C3含量降低(P<0.05)。與模型組相比，miR-199a agomir組小鼠IgG、IgM 含量降低(P<0.05)，C3含量升高(P<0.05)；miR-199a antagomir組小鼠IgG、IgM 含量升高(P<0.05)，C3含量降低(P<0.05)；miR-199a agomir陰性對(duì)照組及miR-199a antagomir陰性對(duì)照組無明顯變化(P>0.05)，見圖7。

2.6各組小鼠肺組織NF-κB通路相關(guān)蛋白(p-IKK/IKK、p-NF-κB/NF-κB)表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，模型組小鼠p-IKK/IKK、p-NF-κB/NF-κB升高(P<0.05)。與模型組相比，miR-199a agomir組小鼠p-IKK/IKK、p-NF-κB/NF-κB降低(P<0.05)；miR-199a antagomir組小鼠p-IKK/IKK、p-NF-κB/NF-κB升高(P<0.05)；miR-199a agomir陰性對(duì)照組及miR-199a antagomir陰性對(duì)照組無明顯變化(P>0.05)，見圖8。

圖7 各組小鼠血清中IgG、IgM、補(bǔ)體C3含量Fig.7 Serum levels of IgG,IgM and complement C3 in mice of each groupNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

圖8 各組小鼠肺組織NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.8 Expressions of NF-κB pathway related proteins in lung tissue of mice in each groupNote:1.Control;2.Model;3.miR-199a agomir;4.miR-199a agomir negative control;5.miR-199a antagomir;6.miR-199a antagomir negative control.Compared with Control group,*.P<0.05;compared with Model group,#.P<0.05.

3 討論

支原體肺炎是一種非典型肺炎，是人體感染肺炎支原體引發(fā)的一種臨床表現(xiàn)為反復(fù)喘息、咳嗽的肺部疾病[15]。由于小兒抵抗力弱，更易感染病原體，因而支原體肺炎是兒科常見的疾病，近年來我國(guó)支原體肺炎發(fā)病率明顯上升，兒童感染人數(shù)也明顯增加，嚴(yán)重影響人民的身心健康和生活質(zhì)量，因此安全有效的治療支原體肺炎是臨床需解決的熱點(diǎn)問題[16]。miR-199a通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化參與調(diào)節(jié)慢性阻塞性肺病的免疫炎癥過程，上調(diào)miR-199a可抑制慢性阻塞性肺病的炎癥及發(fā)展，表明miR-199a異常表達(dá)與肺部炎癥的發(fā)生有關(guān)[17]。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-199a可減輕膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷，表明miR-199a異常表達(dá)與急性肺感染有關(guān)。然而miR-199a是否參與調(diào)控支原體肺炎發(fā)病過程目前尚不明確。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠miR-199a水平降低，Holfbauer評(píng)分升高。與模型組相比，miR-199a agomir組小鼠miR-199a水平升高，Holfbauer評(píng)分降低；miR-199a antagomir組小鼠miR-199a水平降低，Holfbauer評(píng)分升高，表明miR-199a調(diào)節(jié)支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展，其在肺炎支原體小鼠中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可減輕小鼠肺部炎癥反應(yīng)，下調(diào)其表達(dá)可加重其肺部炎癥反應(yīng)，揭示miR-199a參與了支原體肺炎的發(fā)病過程。

支原體肺炎的發(fā)病機(jī)制包括支原體直接入侵、神經(jīng)毒作用、免疫效應(yīng)等多方面因素，其中因支原體入侵引起的自身免疫炎癥反應(yīng)起重要作用，細(xì)胞免疫和體液免疫均參與此反應(yīng)[19]。機(jī)體感染肺炎支原體后，會(huì)使輔助性T細(xì)胞亞型Th1/Th2比值失衡，促使巨噬細(xì)胞活化因子IFN-γ釋放，降低其參與調(diào)節(jié)的免疫炎癥反應(yīng)，抑制免疫抑制因子IL-10釋放，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)[20]；T細(xì)胞亞群比例在感染后亦發(fā)生失衡，CD4+/CD8+降低，影響機(jī)體正常免疫功能，加重炎癥反應(yīng)；感染肺炎支原體后，機(jī)體免疫系統(tǒng)可生成相對(duì)應(yīng)的抗體，與支原體抗原結(jié)合后形成免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，沉積于組織器官并消耗補(bǔ)體，降低補(bǔ)體的活性及含量，進(jìn)一步引起免疫效應(yīng)，加重炎癥損傷[21]。本研究通過探討miR-199a對(duì)支原體肺炎小鼠免疫反應(yīng)的作用發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組小鼠CD4+/CD8+比值，IL-10、C3水平降低；TNF-α、IL-6、IFN-γ、IgG、IgM 水平升高。與模型組相比，miR-199a agomir組小鼠CD4+/CD8+比值升高，IL-10、C3水平升高，TNF-α、IL-6、IFN-γ、IgG、IgM 含量降低；miR-199a antagomir組小鼠CD4+/CD8+比值降低，IL-10、C3水平降低，TNF-α、IL-6、IFN-γ、IgG、IgM 含量升高，表明miR-199a可通過上調(diào)CD4+/CD8+比值、Th2類免疫抑制因子IL-10水平，降低Th1類巨噬細(xì)胞活化因子IFN-γ水平，降低免疫炎癥反應(yīng)；同時(shí)miR-199a也可下調(diào)IgG、IgM抗體水平，降低體液免疫反應(yīng)；降低炎癥因子TNF-α、IL-6水平，降低炎癥反應(yīng)，最終可阻止肺炎支原體發(fā)病，揭示miR-199a調(diào)節(jié)支原體肺炎的免疫發(fā)病過程，上調(diào)其表達(dá)可抑制支原體肺炎的免疫發(fā)病進(jìn)程，最終減輕肺損傷。

還有研究表明，在肺炎支原體感染小鼠中NF-κB信號(hào)通路被磷酸化激活[22]。在脂肪細(xì)胞凋亡研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-199a表達(dá)可抑制IKK的磷酸化激活，降低IκB磷酸化，進(jìn)而抑制NF-κB的磷酸化激活[23]。本研究結(jié)果顯示，模型小鼠p-IKK/IKK、p-NF-κB/NF-κB升高，以miR-199a agomir上調(diào)模型小鼠miR-199a表達(dá)，其肺組織p-IKK/IKK、p-NF-κB/NF-κB降低；以miR-199a antagomir下調(diào)模型小鼠miR-199a表達(dá)，其肺組織p-IKK/IKK、p-NF-κB/NF-κB升高，表明miR-199a可調(diào)控支原體肺炎小鼠NF-κB信號(hào)通路活性，上調(diào)其表達(dá)可抑制NF-κB信號(hào)通路激活，影響小鼠免疫反應(yīng)及肺損傷，揭示miR-199a可能通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)支原體肺炎小鼠的發(fā)病過程。

綜上所述，miR-199a在支原體肺炎小鼠中低表達(dá)，并調(diào)節(jié)支原體肺炎的免疫發(fā)病過程，上調(diào)其表達(dá)可抑制支原體肺炎的免疫發(fā)病進(jìn)程，最終減輕支原體肺炎小鼠的免疫炎癥反應(yīng)，抑制NF-κB信號(hào)通路激活可能是其作用機(jī)制，但本研究未使用NF-κB通路激動(dòng)劑和抑制劑做對(duì)照，尚存在諸多不足，關(guān)于miR-199a在肺炎支原體免疫發(fā)病中更確切的作用機(jī)制還需要更全面的研究。