嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法在腫瘤治療中的研究進(jìn)展①

張宸瑜 陳柯遠(yuǎn) 賈雨婷 季少平

(河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，開封 475000)

近年來，以T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的靶向性免疫細(xì)胞療法成為抗腫瘤研究的熱點，其目的是產(chǎn)生或者增強(qiáng)針對癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答來對抗癌癥。這些技術(shù)也可稱為過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移(adoptive cell transfer,ACT)療法。近幾年來，此方法廣泛被認(rèn)為是最有可能征服腫瘤的免疫治療技術(shù)。它主要是從人腫瘤內(nèi)部或外周血中采取自身T淋巴細(xì)胞，進(jìn)行基因工程修飾、加入細(xì)胞因子等刺激、進(jìn)行體外培養(yǎng)，使具有一定抗腫瘤活性的T淋巴細(xì)胞大量擴(kuò)增，再回輸至患者體內(nèi)，從而達(dá)到抗腫瘤效果。一般用于過繼性免疫療法的免疫細(xì)胞包括：淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lymphokine-activated killer cell，LAK)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer，CIK)，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)，腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)，T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)T細(xì)胞和嵌合抗原受體(chemical antigen receptor，CAR)T細(xì)胞等。目前，TIL、TCR-T、CAR-T細(xì)胞技術(shù)在臨床試驗中已經(jīng)取得了良好成效。

1 三種ACT療法技術(shù)原理

1.1TILs細(xì)胞技術(shù)原理 TILs抗腫瘤技術(shù)是用機(jī)械處理或酶消化的方式，從腫瘤組織內(nèi)部分離出TILs，在體外大量擴(kuò)增后再回輸至患者體內(nèi)進(jìn)行免疫治療的方法。TILs是淋巴細(xì)胞的異質(zhì)群體，主要由T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)組成，它可以自發(fā)遷移到任何實體腫瘤內(nèi)部。據(jù)報道，使用自體腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)的過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移技術(shù)在治療黑色素瘤轉(zhuǎn)移的患者時，能夠達(dá)到約50%的反應(yīng)率[1]。但最近有研究發(fā)現(xiàn)，在腸癌和卵巢癌分離出的TIL中，只有大約10%的TIL細(xì)胞有識別周圍癌細(xì)胞的能力，其他的都是與癌細(xì)胞無關(guān)的T細(xì)胞。更意外的是，有兩名患者的腫瘤組織樣本中根本沒有能識別癌細(xì)胞的殺傷性T細(xì)胞，盡管這兩份組織樣本中也充滿了TIL[2]。由此可以得知，通過體外擴(kuò)增后回輸?shù)腡IL 細(xì)胞絕大部分在體內(nèi)往往不能有效識別腫瘤細(xì)胞，因此TIL過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移技術(shù)仍需要進(jìn)一步的研究與改善。

1.2TCR-T細(xì)胞技術(shù)原理 TCR-T細(xì)胞技術(shù)是通過轉(zhuǎn)染能識別腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-associated antigen,TAA)的TCR基因到宿主T細(xì)胞中，使T細(xì)胞表達(dá)能特異性識別TAA的TCR，并具有分泌細(xì)胞因子和特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。TCR是由α鏈和β鏈與T細(xì)胞表面的CD3復(fù)合物以非共價結(jié)合構(gòu)成(圖1)。在T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的過程中需要抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)遞呈抗原，并形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物，才能被TCR的可變區(qū)識別并初步活化T細(xì)胞；同時與T細(xì)胞接觸的APC也被活化，上調(diào)表達(dá)共刺激分子CD80/CD86，與T細(xì)胞表面共刺激分子CD28相互作用，產(chǎn)生T細(xì)胞活化第二信號。此時T細(xì)胞被完全活化，開始誘導(dǎo)毒性T淋巴細(xì)胞分泌殺傷因子并有效殺傷靶細(xì)胞，或通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡(圖2)。

TCR-T淋巴細(xì)胞的優(yōu)點是可以識別所有能被人源APC呈遞的HLA-Ⅰ類、Ⅱ類抗原，包括細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上的腫瘤相關(guān)抗原，更容易找到特異性高的“安全靶點”，副作用較小，也更容易侵入腫瘤內(nèi)部。不過在有關(guān)TCR-T的研究中，其缺點也很明顯——Johnson等[3]開發(fā)了針對MART-1表面抗原位點的高親和力TCR， 可以較強(qiáng)識別低表達(dá) MART-1的惡性黑色素瘤細(xì)胞。由于MART-1抗原的低特異性，雖然有一些療效，但有超過一半的患者表現(xiàn)出皮膚、眼睛和耳朵中正常黑色素細(xì)胞破壞的癥狀,有時需要局部應(yīng)用類固醇給藥來治療葡萄膜炎和聽力喪失。

圖1 TCR的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic of TCR

1.3CAR-T細(xì)胞技術(shù)原理 CAR-T細(xì)胞免疫治療技術(shù)是通過將患者的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入嵌合的CAR序列，表達(dá)后在體外大量擴(kuò)增，然后回輸入患者體內(nèi)并殺死腫瘤細(xì)胞的技術(shù)。轉(zhuǎn)入CAR序列，使得T細(xì)胞具有特異性識別腫瘤的能力。與TCR-T不同的是，CAR-T細(xì)胞能以非MHC限制的方式識別靶細(xì)胞，并激活自身增殖，分泌大量細(xì)胞因子，同時誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。

通常，CAR是由胞外用來識別腫瘤抗原位點的抗體可變區(qū)以及胞內(nèi)來自T細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊組合而成的融合蛋白。胞外的單鏈抗體輕、重鏈可變區(qū)scFv片段負(fù)責(zé)識別并結(jié)合腫瘤抗原靶點，跨膜區(qū)的鉸鏈提供抗體識別的靈活性，胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)的CD28和CD3ζ負(fù)責(zé)向細(xì)胞內(nèi)傳遞活化信號和增殖信號。CAR-T細(xì)胞被激活后會在短時間內(nèi)分泌大量細(xì)胞因子激活自身以及其他免疫細(xì)胞，并誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。

據(jù)報道，CAR已經(jīng)發(fā)展到第四代(圖3)，第一代的CAR是1989年Eshha研究小組發(fā)明的，其胞外是scFv單鏈抗體片段，胞內(nèi)只有CD3ζ。第一代CAR在細(xì)胞擴(kuò)增、體內(nèi)存活時間以及細(xì)胞因子分泌等方面存在一定缺陷，導(dǎo)致其臨床療效未達(dá)到預(yù)期效果；第二代CAR在第一代的基礎(chǔ)上引入了共刺激分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[(costimulatory molecules endodom-ain)CD28或CD137(4-1BB)]，與第一代相比，第二代CAR-T細(xì)胞比第一代具有更強(qiáng)的增殖能力、更高的細(xì)胞毒性以及更長的體內(nèi)存活時間；第三代CAR是在加入CD28的同時，又加入了CD137或CD134，進(jìn)一步延長體內(nèi)T細(xì)胞的存活時間，增強(qiáng)其抗腫瘤能力。目前，第二代CAR-T技術(shù)是臨床試驗研究最常用的細(xì)胞免疫技術(shù)[4]。第四代CAR-T是在第三代CAR-T的基礎(chǔ)上,同時導(dǎo)入可誘導(dǎo)表達(dá)的IL-12基因，使其獲得CAR-T細(xì)胞與誘導(dǎo)型IL-12的雙重抗癌活性。IL-12能以自分泌方式增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞活化，還能以旁分泌方式吸引并激活先天性免疫細(xì)胞，而先天性免疫細(xì)胞則可以分泌TNF-α來攻擊那些不被CAR-T細(xì)胞識別的陰性抗原腫瘤細(xì)胞，從而進(jìn)一步加強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞抗腫瘤的免疫能力[5]。

圖2 T細(xì)胞活化的雙信號途徑與CAR-T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷Fig.2 Double signal pathway of T cell activation and kill of tumor cells by CAR-T cells

目前，CAR-T細(xì)胞免疫技術(shù)已經(jīng)在血液腫瘤方面取得了巨大成功,尤其是以CD19為靶點的CAR-T免疫療法已經(jīng)成功治愈慢性淋巴細(xì)胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia，CLL)和急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphocytic leukemia，ALL)等血液惡性腫瘤。由于CD19主要表達(dá)于B淋巴細(xì)胞譜系起源的細(xì)胞，因此CD19-CAR-T在治療效果和低毒性方面都具有優(yōu)勢。此外，針對實體瘤的CAR-T細(xì)胞療法也具有一定成效，但是依然存在一些潛在障礙，其中包括：①CAR-T細(xì)胞不能特異的定位到腫瘤部位;②體內(nèi)具有阻止CAR-T細(xì)胞浸潤的物理屏障；③由于實體瘤抗原的高度異質(zhì)性或缺乏特異性導(dǎo)致抗原選擇難度增加；④一些健康器官/細(xì)胞中靶點抗原表達(dá)導(dǎo)致脫靶毒性的風(fēng)險增高；⑤在腫瘤微環(huán)境中一些免疫抑制因子會使CAR-T細(xì)胞功能失調(diào)[6]。目前，正在進(jìn)行的臨床前研究和臨床試驗試圖通過使用改良的基因轉(zhuǎn)移方法和治療方案來克服這些障礙。 開發(fā)新的更具有特異性的靶標(biāo)進(jìn)行 CAR

圖3 四代CAR的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Schematic of four-generation CAR

的改造：例如用于結(jié)腸直腸癌的CEA、用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤和肉瘤的二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2、用于前列腺癌和黑色素瘤的PSMA以及用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的EGFRvⅢ等，可以不同程度地提高抗原的特異性，降低毒副作用，有望增加治療效果。

2 CAR-T細(xì)胞療法的臨床應(yīng)用

2.1CD19-CAR-T 2011年起，靶向CD19的第二代CAR-T細(xì)胞技術(shù)成為CAR-T細(xì)胞免疫療法的主流。CD19在B細(xì)胞譜系起源的惡性腫瘤中表達(dá)水平較高，并且它不在B細(xì)胞譜系之外的細(xì)胞表達(dá)，因此在一定程度上降低了脫靶毒性，這使得CD19成為非常理想的腫瘤相關(guān)抗原靶點[7]。但由于正常的B淋巴細(xì)胞也會有CD19的表達(dá),所以經(jīng)過CD19-CAR-T技術(shù)成功治療的患者通常具有深度B細(xì)胞發(fā)育不良的癥狀，需要通過靜脈注射免疫球蛋白來彌補B細(xì)胞的損失[7,8]。幸運的是，在停用CD19-CAR-T治療后，大部分患者通過造血使得B淋巴細(xì)胞得以恢復(fù)。

ALL患者Emily是第一位成功接受CAR-T細(xì)胞治療的人，她于2012年加入了賓夕法尼亞大學(xué)的CAR-T-19臨床試驗，成為全球第一位接受試驗性CAR-T細(xì)胞免疫治療的兒童患者。該患者接受治療后曾一度出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴；幸運的是在接受了降低免疫反應(yīng)的藥物依那西普(一種腫瘤壞死因子阻斷劑)和托珠單抗(一種人源化白細(xì)胞介素6受體拮抗劑)后，CAR-T的嚴(yán)重副作用幾乎被完全緩解，最終檢查結(jié)果顯示患者體內(nèi)的癌細(xì)胞徹底消失，并且5年沒有復(fù)發(fā)[9]。

2.2HER2-CAR-T 人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)作為乳腺癌靶點研究的比較多，但在骨肉瘤、尤文氏肉瘤等其他腫瘤治療中也有一些研究。值得注意的是Ahmed等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HER2低水平表達(dá)的惡性腫瘤也可以用HER2-CAR-T細(xì)胞進(jìn)行治療并且在臨床前動物模型中這些HER2-CAR-T細(xì)胞具有有效的抗腫瘤活性[11]。在臨床試驗中，19名HER2陽性腫瘤患者輸注HER2-CAR-T細(xì)胞后，普遍耐受性良好，HER2-CAR-T細(xì)胞可以在患者體內(nèi)持續(xù)存在6周而沒有明顯的毒性，患者中位總生存期達(dá)到10.3個月(范圍5.1至29.1個月)。這項研究首次評估出HER2-CAR-T細(xì)胞在癌癥患者的治療中具有安全性和有效性，為今后HER2-CAR-T細(xì)胞免疫療法的癌癥治療研究奠定了基礎(chǔ)[12]。

2.3GD2-CAR-T 二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(disialoganglioside，GD2)少量表達(dá)于人小腦以及外周神經(jīng)細(xì)胞中，而在一些腫瘤中，比如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤等也有較高表達(dá)。GD2是FDA批準(zhǔn)的治療性單克隆抗體的靶標(biāo)，可以作為細(xì)胞免疫治療的腫瘤相關(guān)抗原。在Louis等[13]的研究中，19例惡性程度較高的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者經(jīng)過GD2-CAR-T細(xì)胞的輸注治療后，輸注緩解8例，剩下復(fù)發(fā)的11例當(dāng)中，又有3例完全緩解。在經(jīng)過5年的隨訪中，唯一觀察到與治療相關(guān)的不良癥狀的2名受試者出現(xiàn)低度發(fā)熱和輕度至中度的局部疼痛；1名受試者出現(xiàn)不明原因的局部疼痛，但沒有受試者出現(xiàn)與GD2單克隆抗體輸注相關(guān)的神經(jīng)性疼痛或功能障礙。在這些病例中還觀察到CAR-T細(xì)胞在患者體內(nèi)可以存活很長時間(最長時間長達(dá)4年)，表明CAR-T細(xì)胞可能在患者體內(nèi)具有持久性，并且這種持久性似乎可以預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，與患者更長的存活率相關(guān)。

2.4CAⅨ-CAR-T 碳酸酐酶Ⅸ(Carbonic anhydr-ase Ⅸ，CAⅨ)在腎癌細(xì)胞中表達(dá)量較高。Lamers等[14]將CAⅨ-CAR-T用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(metastatic renal cell carcinoma，mRCC)。結(jié)果8名患者均發(fā)生CTC 2～4級肝功能異常。其中4名患者因脫靶作用嚴(yán)重而停止治療，其肝組織活檢的結(jié)果顯示，表達(dá)CAⅨ正常的膽管上皮中伴有T細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞的浸潤。為了預(yù)防CAR-T的脫靶毒性，研究者經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，2～5 mg G250的用藥劑量(98～320 ng/ml的血液水平)，抗體可以有效覆蓋在低表達(dá)CAⅨ的正常肝細(xì)胞表面，保護(hù)正常肝組織免受CAR-T細(xì)胞的傷害，并且該抗體水平并不阻止CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。如果要完全阻斷CAR-T殺傷mRCC腫瘤細(xì)胞，則抗體在血液中的水平需要增加到10 μg/ml以上。后來研究者用低劑量的CAⅨ單克隆抗體(mAb)G250對另外4名患者進(jìn)行預(yù)處理，再進(jìn)行CAⅨ-CAR-T細(xì)胞的輸注治療，結(jié)果顯示并未有肝毒性和外周T淋巴細(xì)胞浸潤持續(xù)增強(qiáng)的跡象。該報告顯示實體瘤的脫靶毒性癥狀可以在治療前通過注射靶點mAb改善。未來，這一技術(shù)有可能是CAR-T技術(shù)攻克實體瘤的關(guān)鍵。

3 不良反應(yīng)

3.1細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome,CRS) CRS是一種由T細(xì)胞活化引發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)。輸注CAR-T細(xì)胞后患者體內(nèi)的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞以及單核/巨噬細(xì)胞會釋放大量的細(xì)胞因子，主要是IL-1、IL-6、TNF-α、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等。這些細(xì)胞因子水平顯著升高，從而出現(xiàn)高熱、肌痛、乏力、惡心、低血壓、心動過速、腎損害、肝衰竭，甚至呼吸困難等不良癥狀，嚴(yán)重者會有致死性風(fēng)險。CRS通常發(fā)生在CAR-T治療后的第一周內(nèi)，且于1～2周內(nèi)達(dá)到最高峰，其嚴(yán)重程度與腫瘤負(fù)荷相關(guān)。最近Theodoros等[15]發(fā)現(xiàn)CRS是由炎性分子IL-1引發(fā)的，在治療方案中加入抑制IL-1的阿那白滯素(IL-1抑制劑，Anakinra)能夠有效控制CRS和神經(jīng)毒性。也有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子的釋放與腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺等兒茶酚胺類物質(zhì)有關(guān)，通過限制此類物質(zhì)的合成可以有效控制CRS的發(fā)生。在多種免疫治療的小鼠模型中，這種方法都能夠降低細(xì)胞因子產(chǎn)生、增加存活率，同時不會影響到治療效果。并且，兒茶酚胺合成的關(guān)鍵限速酶酪氨酸羥化酶(TH)抑制劑α-甲基酪氨酸(MTR)以及α-腎上腺素受體阻滯劑哌唑嗪等物質(zhì)是FDA批準(zhǔn)用于治療高血壓的藥物[16-18]。

3.2神經(jīng)毒性征 CAR-T細(xì)胞療法的另一嚴(yán)重副反應(yīng)就是神經(jīng)毒性。神經(jīng)毒性在很大程度上是可逆的，在使用托珠單抗和地塞米松(一種糖皮質(zhì)激素，主要用于過敏性與自身免疫性炎癥性疾病)進(jìn)行治療后，神經(jīng)毒性一般會于4.5 d(中位天數(shù))后完全緩解。大部分患者的神經(jīng)毒性并發(fā)癥是短暫和輕微的，只有小部分患者會有嚴(yán)重副反應(yīng)，包括昏迷、頭痛、意識水平下降、失語癥、語言障礙、神經(jīng)錯亂、癲癇、局灶性神經(jīng)功能缺損和顱內(nèi)大出血等。在Gust等[19]的研究中，CD19-CAR-T用于治療133名患有難治性CD19陽性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)、CLL和非霍奇金淋巴瘤(NHL)的患者，雖然在Ⅰ期研究中取得較高的反應(yīng)率，但有40%的患者發(fā)生了不同程度的神經(jīng)毒性，在這40%的患者當(dāng)中又有90%的患者同時發(fā)生了CRS，并且更早出現(xiàn)CRS的患者會有更高的神經(jīng)毒性風(fēng)險。目前神經(jīng)毒性的根本原因尚不清楚，不過研究發(fā)現(xiàn)，有內(nèi)皮細(xì)胞活化的患者經(jīng)過CD19-CAR-T治療后可能會發(fā)生更為嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，且使用托珠單抗等藥物治療后恢復(fù)更慢，說明神經(jīng)毒性與患者內(nèi)皮活化存在一定聯(lián)系[19]。

3.3脫靶毒性 有一些TAA位點，不僅在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)量較高，而且正常組織細(xì)胞表面也會有表達(dá)。因此CAR-T細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也可能會損傷正常組織細(xì)胞，這就產(chǎn)生了脫靶毒性。碳酸酐酶Ⅸ(CAⅨ)在腎透明細(xì)胞癌表面高表達(dá)，但是正常膽管上皮細(xì)胞表面也會表達(dá)，Lamers等[14]在研究靶向CAⅨ的第一代CAR-T細(xì)胞的試驗中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的患者經(jīng)過治療后，出現(xiàn)因T淋巴細(xì)胞浸潤導(dǎo)致的膽管炎和一定程度的肝毒性。

同樣在靶向HER2位點的第三代CAR-T細(xì)胞療法試驗中，也存在顯著脫靶毒性。研究顯示其毒性是由CAR-T細(xì)胞識別并殺死低密度表達(dá)的陽性HER2肺上皮細(xì)胞引起的，同時引發(fā)肺衰竭和大量細(xì)胞因子的釋放。但是Ahmed等[12]同時也發(fā)現(xiàn)低親和力的scFv配合低劑量的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行治療是相對安全的，但是其臨床抗腫瘤活性較低，這就迫切需要尋找特異性更強(qiáng)的腫瘤相關(guān)抗原位點，或者研究出有效的靶點單抗對患者進(jìn)行預(yù)處理保護(hù)患者正常組織來降低脫靶毒性[14]。

4 癌癥復(fù)發(fā)

在免疫治療中，腫瘤逃逸是癌癥復(fù)發(fā)的主要原因。雖然大多數(shù)復(fù)發(fā)性的白血病患者在經(jīng)過CD19-CAR-T細(xì)胞治療后可以完全緩解，但在一些ALL患者當(dāng)中，CAR-T細(xì)胞靶向的CD19陽性腫瘤細(xì)胞上抗原表位的缺失會導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞無法正常識別B-ALL腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后的腫瘤細(xì)胞為CD19陰性。在Grupp[9]的研究當(dāng)中，兩名患有復(fù)發(fā)和難治性ALL的兒童經(jīng)過CAR-T治療后，一名患者持續(xù)緩解，另一名患者一年后復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)患者的腫瘤細(xì)胞不再表達(dá)CD19。Jacoby等[20]通過對小鼠B-ALL腫瘤模型的研究表明，CD19-CAR-T的作用壓力可誘導(dǎo)B-ALL腫瘤細(xì)胞發(fā)生部分或完全的免疫表型改變，引起CD19表達(dá)降低或者沉默，從而耐受CD19-CAR-T治療。CD19的缺失表明對于ALL患者的治療除了靶向CD19之外還需要靶向其他分子進(jìn)行雙靶點或多靶點CAR-T治療。

近期研究發(fā)現(xiàn)在給一名身患復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)的患者構(gòu)建CAR-T細(xì)胞時,CAR基因意外地被加到患者癌變的B細(xì)胞上,形成了“CAR-癌細(xì)胞”。并且加到癌細(xì)胞上的CAR會與癌細(xì)胞表面的CD19結(jié)合而屏蔽CD19分子，使得CAR-T細(xì)胞失去了識別癌細(xì)胞靶標(biāo)的機(jī)會。雖然這名患者在接受CAR-T細(xì)胞回輸?shù)?8 d之后，病情完全緩解，但在261 d之后由于“CAR-癌細(xì)胞”大量增殖，癌癥復(fù)發(fā)?；颊咦罱K死于與白血病相關(guān)的并發(fā)癥[21]。

5 通過基因編輯改良CAR

改變CAR的親和力。通過改變CAR對腫瘤靶點的親和力，能夠使CAR-T細(xì)胞更容易區(qū)分健康組織細(xì)胞上的低密度抗原分子以及腫瘤細(xì)胞上面的高密度抗原分子。比如在Richman等[22]研究的GD2-CAR-T臨床模型中，雖說GD2特異性CAR結(jié)合抗原的能力被增強(qiáng)，并且增加了抗腫瘤活性，然而，這種增強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤功效也伴隨著致死性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)毒性。其中包括腦內(nèi)CAR-T細(xì)胞的大范圍浸潤和增殖以及對神經(jīng)元的破壞。因此既能保證抗腫瘤能力又能控制好脫靶毒性的CAR-T細(xì)胞是最佳選擇，這些還需要進(jìn)一步的優(yōu)化和探索。

消除免疫抑制信號，如CTLA-4和PD-1。CTLA-4(CD152)表達(dá)于活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞，其配體與CD28一樣都是CD80和CD86，但CTLA-4與配體結(jié)合的親和力顯著高于CD28，并傳遞抑制性信號，起下調(diào)或終止T細(xì)胞活化的作用；PD-1(programmed death 1)也表達(dá)于活化T細(xì)胞，配體為PD-L1和PD-L2，PD-L1與配體結(jié)合后可抑制T細(xì)胞的增殖分化及Ig的分泌。故可嘗試?yán)没蚓庉嫾夹g(shù)先將T細(xì)胞的這兩段基因沉默，再轉(zhuǎn)進(jìn)CAR基因構(gòu)建CAR-T,從而達(dá)到保持CAR-T細(xì)胞活性的目的[23]。

靶向兩種或多種抗原位點。靶向單個抗原位點的CAR-T細(xì)胞在區(qū)分腫瘤細(xì)胞和健康組織細(xì)胞的能力方面會有一些限制。為了增強(qiáng)針對腫瘤細(xì)胞的特異性,可以開發(fā)靶向兩種或多種抗原位點的聯(lián)合識別技術(shù)。比如對B-ALL患者的治療過程中，可以使用CD19+CD22雙靶點CAR-T療法，即使腫瘤B細(xì)胞上的CD19抗原表位缺失，還可以通過靶向CD22來避免腫瘤逃逸[24]。如果產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，則可以用mAb封閉靶點抗原來緩解脫靶效應(yīng)。最早的雙靶點CAR-T技術(shù)是將二代CAR的共刺激信號CD28與CD3ζ分開，即1個CAR-T細(xì)胞表達(dá)兩種CAR。CAR1的scFv識別靶點1，其胞內(nèi)區(qū)是CD3ζ，就像第一代CAR；CAR2的scFv識別靶點2，其胞內(nèi)區(qū)只有CD28或CD137。當(dāng)腫瘤細(xì)胞上的兩種靶點被雙靶點CAR-T細(xì)胞同時識別時，CAR-T細(xì)胞才可以完全活化并且殺傷腫瘤細(xì)胞[25]。

給CAR-T細(xì)胞添加自殺基因。Stasi等[26]設(shè)計了一種誘導(dǎo)型T細(xì)胞安全開關(guān)，它是基于人Caspase 9與修飾過的人FK結(jié)合蛋白的融合，可以條件性二聚化。當(dāng)CAR-T細(xì)胞暴露于合成的二聚化藥物時，誘導(dǎo)型半胱天冬酶9(iCasp9)被激活并誘導(dǎo)表達(dá)該基因的細(xì)胞快速死亡。研究顯示在過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法中，一旦發(fā)生移植物抗宿主病，患者只要接受一種生物惰性小分子二聚化藥物便可以在30 min內(nèi)消除體內(nèi)90%的轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞。因此通過iCasp9細(xì)胞自殺系統(tǒng)能夠提高細(xì)胞免疫療法的安全性，可以考慮將其拓展到臨床應(yīng)用上。

6 通用型CAR-T細(xì)胞

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompati-bility complex，MHC)是一組決定移植組織是否相容的基因群，人的MHC稱為人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因復(fù)合體。由于MHC固有的限制性，ACT的治療策略只能體現(xiàn)在自體T細(xì)胞，如果可以消除MHC的限制，那么可以使用健康供體的T細(xì)胞來構(gòu)建通用型CAR-T。由健康供體T細(xì)胞構(gòu)建的CAR-T具有許多克服與癌癥治療相關(guān)的免疫缺陷的潛力，相對患者自體T細(xì)胞具有顯著的優(yōu)勢。同時能夠簡化CAR-T的制造工藝，有可能出現(xiàn)即用型的“CAR-T產(chǎn)品”，使得整個治療過程更快捷，更便宜[27]。

根據(jù)Torikai等[28]的研究報道，有兩名患者成功使用了通用型CD19-CAR-T細(xì)胞，但由于患者自身的免疫反應(yīng)會使得自身NK細(xì)胞去裂解輸注的CAR-T細(xì)胞，所以輸注的CAR-T細(xì)胞數(shù)量會受到限制，因此治療效果也很有限。為了阻止CAR-T細(xì)胞被患者的NK細(xì)胞裂解，我們可以利用基因編輯技術(shù)將HLA-E基因插入CAR-T細(xì)胞，再刪除CAR-T細(xì)胞的HLA-Ⅰ類基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C)。HLA-E分子是NK細(xì)胞表面CD94/NKG2的專一型配體，可以抑制NK細(xì)胞對表達(dá)HLA-E分子的細(xì)胞的殺傷作用[29]。HLA-Ⅰ類基因表達(dá)于所有有核細(xì)胞，可以被宿主CD8+T淋巴細(xì)胞特異性識別并殺傷。因此將HLA-Ⅰ類基因刪除則可以避免CAR-T細(xì)胞被接受者的自身CTL識別和裂解，降低抗腫瘤活性。所以理論上這兩種途徑可以防止接受者自身T細(xì)胞殺死通用型CAR-T細(xì)胞。

7 結(jié)語

近期CD19特異性CAR-T細(xì)胞療法已經(jīng)被美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療難治性B細(xì)胞前體ALL和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤，也是第一種獲得美國FDA商業(yè)批準(zhǔn)的基因治療方法?？紤]到細(xì)胞因子綜合征和神經(jīng)毒性的風(fēng)險，F(xiàn)DA要求醫(yī)生完成CAR-T不良反應(yīng)的救護(hù)培訓(xùn)，進(jìn)而在CAR-T細(xì)胞的治療過程中降低風(fēng)險。

今后CAR-T的發(fā)展有可能與一些新型免疫治療方法相結(jié)合，比如免疫檢查點抑制劑等；發(fā)展即用型CAR-T細(xì)胞；也有可能將CAR-T細(xì)胞作為藥物載體來靶向輸送抗癌藥物/蛋白，從而達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的[30]。開發(fā)CAR-T最大的挑戰(zhàn)就是缺乏臨床前模型來評估CAR-T的安全性和有效性，盡管CAR-T細(xì)胞在血液腫瘤方面的研究比較成功，但用于實體瘤方面還是存在一定的障礙。隨著科學(xué)家對腫瘤特異性抗原研究的不斷深入以及基因修飾技術(shù)的不斷發(fā)展，未來的CAR-T細(xì)胞免疫療法將會更加精準(zhǔn)有效。