功能酵素的研究進展

吳 紅，雷于國，胡國元*

1.武漢工程大學環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，湖北 武漢430205；

2.湖北裕國菇業(yè)股份有限公司，湖北 隨州441300

酵素是以動物、植物、菌類等為原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品，其中含各種活性物、生物酶以及益生菌，具有豐富的營養(yǎng)和較高的經(jīng)濟價值［1-2］。我國的豆豉、泡菜、豆腐乳等也屬酵素食品［3］。2018年中華人民共和國工業(yè)和信息化部頒布的《酵素產(chǎn)品分類導則》規(guī)定酵素按產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域可分為食用酵素、飼用酵素、農(nóng)用酵素、日化酵素、環(huán)保酵素及其他［1］。在我國，酵素產(chǎn)品價格偏高，在人群中的普及率和認可度較低，原因是我國關(guān)于酵素的研究仍然處于起步階段，酵素的菌種篩選鑒定方法存在不足，酵素的制備工序大多是優(yōu)化其發(fā)酵條件，檢測產(chǎn)物在發(fā)酵過程中的含量變化。對于原料配比研究較少，酵素功能的研究主要傾向于食用酵素，處在體外試驗階段且關(guān)于抗氧化功能的研究居多，臨床試驗的研究偏少，其他類型酵素的研究處于邊緣位置，需要大力研發(fā)并發(fā)揮其潛在的作用。另外，在宣傳酵素產(chǎn)品的過程中存在不當宣傳，其市場規(guī)范和法律法規(guī)方面有待改進。在此背景下，本文綜述了酵素發(fā)酵菌種的篩選、微生物在發(fā)酵過程中的變化、酵素的發(fā)酵工藝和發(fā)酵機制、功能應(yīng)用、安全問題以及市場規(guī)范，為酵素的相關(guān)研究提供科研思路，有利于酵素產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 酵素發(fā)酵的菌種和發(fā)酵過程中微生物的變化

1.1 酵素發(fā)酵菌種的分離

自然酵素發(fā)酵中的微生物種類繁多，相互作用及菌落結(jié)構(gòu)變化復(fù)雜，且從自然酵素中分離出的微生物最普遍的是酵母菌、乳酸菌［4］、沙如意等［5］，從自然發(fā)酵的水果酵素中篩選出的丘陵假絲酵母可以在起始pH值為1.5的發(fā)酵液中生長，并且篩選出的菌株均具有耐高糖和耐低pH值的特性。Prado等［6］從經(jīng)過自然發(fā)酵的椰子水中分離一株植物乳桿菌AC-1，對大腸桿菌、傷寒沙門氏菌和金黃葡萄球菌有抑制作用，且在胃腸道條件下存活率更高。Giri等［7］從越南傳統(tǒng)大米發(fā)酵飲料中分離出的植物乳桿菌L7在體外具有耐酸、膽汁耐受性和抗菌等特性。

從自然發(fā)酵酵素中分離優(yōu)良的酵素菌種，利用基因工程技術(shù)改良得到食品工業(yè)用菌種［8］以及采用雜交育種獲得的菌種都可以用于酵素發(fā)酵，同時，采用上述基因工程技術(shù)或雜交育種上游技術(shù)結(jié)合下游的酵素發(fā)酵技術(shù)為酵素產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展提供一種新的途徑。

1.2 酵素發(fā)酵過程中微生物的變化

近年來，許多研究開始從基因組學和宏基因組學等方面入手，采用高通量測序技術(shù)對所獲樣本的信息進行對比分析，研究酵素發(fā)酵過程微生物多樣性以及相關(guān)變化規(guī)律。齊天翊［9］通過高通量測序技術(shù)對4個不同發(fā)酵時段果蔬酵素中微生物群落結(jié)構(gòu)變化進行比較，最終確定乳桿菌為優(yōu)勢菌群，最佳發(fā)酵周期為20 d，致病菌豐度最低。邸鵬月等［10］從桑葚酵素發(fā)酵過程中提取到的樣本進行高通量測序及分析發(fā)現(xiàn)：乳桿菌屬是桑葚酵素發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，根據(jù)得到的數(shù)據(jù)推測發(fā)酵過程分為不同的階段。微生物在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律可以顯示出酵素發(fā)酵的特點，以便于調(diào)整發(fā)酵周期，積累更多發(fā)酵產(chǎn)物，避免污染［11］。

自然酵素發(fā)酵體系中微生物種類甚多，可作為人工接菌酵素發(fā)酵菌種的重要來源，對其加大開發(fā)力度，并廣泛運用，利于酵素發(fā)酵過程的科學管控，得到高質(zhì)量酵素產(chǎn)品。

2 酵素的發(fā)酵工藝和發(fā)酵機制

2.1 酵素的發(fā)酵工藝

因原料種類豐富，產(chǎn)地不同，酵素制備要根據(jù)原料所含營養(yǎng)成分和用量來“量身定制”一套發(fā)酵工藝，以得到最大效益。酵素主要的發(fā)酵模式分為兩類：傳統(tǒng)的自然發(fā)酵和現(xiàn)代化的接菌發(fā)酵［12］。

2.1.1 自然酵素的發(fā)酵工藝早期的自然酵素發(fā)酵都是憑借環(huán)境和原料自帶的微生物進行發(fā)酵，如薛淑龍等［13］將竹葉和適量水放入干凈無菌的發(fā)酵罐里，密封放置于干燥陰涼處發(fā)酵230 d。晏殊［14］用無菌水將9種水果洗凈，進行去皮去核并切塊處理，按質(zhì)量比1∶1與白糖混合并打漿，再放入滅菌后的玻璃瓶中，室溫下密封發(fā)酵180 d。隨著研究的進行，研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的自然發(fā)酵工藝周期較長，可變因素對酵素的發(fā)酵過程影響較大，發(fā)酵條件不受控制，導致發(fā)酵失敗。使自然酵素發(fā)酵條件從啟動發(fā)酵至終止發(fā)酵都保持不變，為保證發(fā)酵成功提供一個新的思路。張艷明等［15］以牛蒡、山藥為原料，優(yōu)化原料配比，控制溫度和發(fā)酵時間，其發(fā)酵周期縮短，酵素口感柔和且風味獨特。郭俊花等［16］利用蘋果皮渣制備天然酵素并優(yōu)化工藝條件，其最佳發(fā)酵條件為蘋果皮渣添加量為400 g/L、加糖量90 g/L、初始pH為5.5、發(fā)酵時間150 d，該酵素可用于紅富士蘋果的生長，使單果品質(zhì)有所提高。

2.1.2 人工接菌酵素的發(fā)酵工藝人工接菌酵素發(fā)酵工藝是將酵母菌、乳酸菌等接種至原料中，控制發(fā)酵條件。戰(zhàn)偉偉等［17］將合適比例的酵母菌與雙歧桿菌接入藍靛果與椰子果漿，發(fā)酵溫度33℃，發(fā)酵時間70 d，最終得到藍靛果椰子酵素總黃酮含量為20.31 mg/g、SOD酶活力為56.74 U/mL。舒旭晨等［18］利用酵母菌和乳酸菌復(fù)合發(fā)酵石斛，發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵時間8 d后酵素羥自由基清除率為34.79%，且比單菌發(fā)酵更具有明顯優(yōu)勢。

后續(xù)研究還出現(xiàn)一些較為系統(tǒng)且工序復(fù)雜的酵素制備方法，李凡等［19］將白首烏洗凈，經(jīng)過液化糖化、滅菌等處理后得到首烏汁，首先接入體積分數(shù)0.2%酵母菌，發(fā)酵24 h；再接入體積分數(shù)3%復(fù)合乳酸菌；在4～8℃后發(fā)酵12 h，最后得到首烏酵素SOD酶活力達到4.23×104U/L，且含大量活菌，首烏的異味得到改善。莫大美等［20］以玫瑰花為原料，先接入1.99%的酵母菌進行發(fā)酵之后，接著接種1.27%的乳酸菌，再在優(yōu)化基礎(chǔ)上接種2%醋酸菌繼續(xù)發(fā)酵20 d，得到玫瑰花酵素SOD酶活達245.3 U/mL，且酵素口感酸甜適宜。

目前對酵素原料配方的研究報道比較少，喬沈［21］添加生物硒制備生物硒蔬菜酵素，其抗氧化能力比普通無硒酵素強。楊婧娟等［22］采用最優(yōu)混料設(shè)計法優(yōu)化原料配方，增強酵素抗氧化和抑菌作用。劉敏等［23］經(jīng)過比較水果、蔬菜、中草藥等不同原料組合發(fā)酵，證明酵素中活性物質(zhì)含量及抗氧化性隨著物料的添加量和品種的增加而升高，單一的蔬菜酵素活性物質(zhì)最少。

2.1.3 自然發(fā)酵與接菌發(fā)酵工藝自然酵素的發(fā)酵工藝類似于傳統(tǒng)發(fā)酵，目前存在一定的缺陷，而人工接菌發(fā)酵工藝雖然從某些方面講更具優(yōu)勢，但仍然存在不足。梅子龍等［24］以大球蓋菇為原料，分別進行自然發(fā)酵和人工接菌發(fā)酵，結(jié)果表明人工接菌發(fā)酵的酵素比自然發(fā)酵具有更強的抗氧化能力，脂肪酶和淀粉酶活有所提高，有機酸種類增加，而蛋白酶和纖維素酶活力、乳酸和總酸含量比自然酵素低。肖夢月等［25］在自然拐棗酵素中篩選分離獲得釀酒酵母和植物乳桿菌各1株，再接種至拐棗進行人工接菌發(fā)酵，發(fā)酵時間明顯縮短，對糖的使用量也大大減少。自然酵素發(fā)酵過程不易控，接菌發(fā)酵工藝發(fā)酵周期相對較短，發(fā)酵過程穩(wěn)定。這兩種發(fā)酵方式在產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中仍需進一步對比研究，有利于酵素制備產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新性發(fā)展。

2.2 酵素的發(fā)酵機制

目前的研究主要是對發(fā)酵產(chǎn)物檢測之后進行對比分析，發(fā)掘發(fā)酵菌種的發(fā)酵特性，有利于充分理解并掌握酵素的發(fā)酵機制。如酵母菌是兼性厭氧菌，在酵素發(fā)酵過程中將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為乙醇、水和CO2，在合適的條件下還能產(chǎn)生乳酸、酒石酸、蘋果酸等［26］。韋仕靜［27］研究桑葚酵素發(fā)酵過程中植物乳桿菌對花青素的轉(zhuǎn)化，初步發(fā)現(xiàn)：原兒茶酸是花青素的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物之一，隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸并非桑葚酵素中花青素的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，后經(jīng)過液質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，除原兒茶酸外，桑葚中的花青素經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后新增了8種酚酸，初步確定為桑葚酵素花青素的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。Kaprasob等［28］利用5種益生菌分別進行發(fā)酵腰果梨汁，在整個發(fā)酵過程中，嗜酸乳桿菌自身具有合成維生素B1（Vita?min B1，VB1）的能力，不需要VB1也可以生長，因此可使發(fā)酵腰果梨汁中的VB1含量保持較高水平。微生物代謝途徑存在差異，發(fā)酵產(chǎn)物變化較大，從微生物代謝的角度研究酵素的發(fā)酵機制，并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，促進酵素產(chǎn)品的品質(zhì)，以滿足人們對于健康飲食的需求［26］。

3 酵素產(chǎn)品的功能

酵素中含有不同種類活性物質(zhì)，從而具備不同生物功效（見表1），為食品行業(yè)、種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)以及日化行業(yè)帶來福音，既迎合了現(xiàn)代人對健康生活追求，也符合農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展觀念。相關(guān)研究表明食用酵素作為發(fā)酵功能食品具有輔助人們預(yù)防多種疾病，補充營養(yǎng)，促進人體健康的潛在價值，但是其作用機理、臨床試驗等方面仍需進一步研究。在開發(fā)新型功能酵素的過程中，一方面是探索新的發(fā)酵菌種，另一方面是在自然界尋找發(fā)現(xiàn)含有特殊功能活性成分的酵素原材料，從而開發(fā)出新型功能酵素，為人們的生產(chǎn)生活提供更多的便利。酵素除了在食品領(lǐng)域有突出貢獻，還在動物飼料添加、促進作物生長和土壤改良以及日化領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用。

表1不同類型酵素的功能Tab.1 Functions of different types of Jiaosu

4 酵素產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量規(guī)范

我國對于酵素的研究逐漸擴展，但還未對酵素品質(zhì)出臺相關(guān)規(guī)范制度，酵素制備工藝及檢測方法不夠完善統(tǒng)一［45］。市場上酵素產(chǎn)品種類五花八門，價格不菲，質(zhì)量不過關(guān)，功效被過度宣傳，給消費者、生產(chǎn)者以及市場監(jiān)管者帶來多種不必要的麻煩。

4.1 酵素產(chǎn)品的安全性

酵素發(fā)酵工藝主要存在生物危害和化學危害2種。生物危害涉及到有毒或致病雜菌污染及菌種變異等，化學危害則是農(nóng)藥殘留及重金屬、化學試劑的混入［46］。酵素發(fā)酵過程可能存在雜菌污染，或者物質(zhì)經(jīng)過微生物轉(zhuǎn)化可能產(chǎn)生有害物質(zhì)，最終導致酵素質(zhì)量不合格。除不斷改進工藝技術(shù)，監(jiān)測發(fā)酵過程外，原料處理以及發(fā)酵罐設(shè)計也十分必要，最終都是要保證酵素產(chǎn)品的安全性，使消費者放心使用酵素產(chǎn)品。

4.2 酵素產(chǎn)品的質(zhì)量規(guī)范

當前各企業(yè)及高校簡化酵素發(fā)酵過程，追根溯源研究其明確的成分及功能［47］，以提升其品質(zhì)。酵素質(zhì)量評價標準還未完成，成分鑒定及檢測方法標準未統(tǒng)一［48］。2018年中華人民共和國工業(yè)和信息化部頒布的《植物酵素》《酵素產(chǎn)品分類導則》中關(guān)于酵素的檢測方法尚不明確，有待細化和完善。一方面，各科研機構(gòu)共同研究和努力，不斷地提升酵素發(fā)酵工藝技術(shù)，提高并穩(wěn)定酵素產(chǎn)品質(zhì)量，另一方面，隨著國家加大對酵素市場的監(jiān)管力度，進一步完善法律法規(guī)和酵素的相關(guān)質(zhì)量檢測標準，規(guī)范商家的不當宣傳行為，讓人們對酵素有一個正確的認識，從而促使酵素產(chǎn)業(yè)發(fā)展良好，為人們提供更多消費選擇，利于酵素產(chǎn)業(yè)長期發(fā)展。

5 結(jié)論

當前關(guān)于酵素的研究正逐漸多樣化，從優(yōu)良菌種選育到工藝優(yōu)化，以及發(fā)酵機制和功能作用等方向擴展和深入研究，最近幾年，還成立了中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會酵素分會，并且制定了關(guān)于酵素的行業(yè)標準，且每年各地還舉辦了關(guān)于酵素的博覽會，有利于大眾對其有一個更為清楚的認識。為使酵素成為讓消費者放心使用的綠色健康產(chǎn)品，形成一條從源頭到市場的完整的生產(chǎn)銷售產(chǎn)業(yè)鏈條，在市場上占據(jù)足夠的優(yōu)勢，仍需做以下思考和研究：

1）從酵素的配方、菌種培育和選用、發(fā)酵工藝、功能效用以及產(chǎn)品保存等幾個主要方面入手，利用更新發(fā)展的相關(guān)技術(shù)輔助酵素的發(fā)酵，研究的主要目的在于弄清楚酵素的主要作用成分及發(fā)酵菌種在發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物，酵素的作用機制，并掌握一套成熟的發(fā)酵工藝，以便于工業(yè)化生產(chǎn)。

2）市場的嚴格監(jiān)管和把控也需要跟上酵素產(chǎn)業(yè)發(fā)展的腳步，逐步統(tǒng)一和完善酵素的質(zhì)量和安全標準，從生產(chǎn)到運輸和保存以及銷售都要有明確的規(guī)定，不同類型的酵素必須滿足一定條件才可投入生產(chǎn)進行銷售，酵素的作用成分需明確標明，必要時標明適宜人群和注意事項，在銷售過程中不能進行誤導宣傳。

3）本土酵素的研制在不同程度需依托各個學科方面的知識和技術(shù)，從而降低酵素生產(chǎn)成本和提升酵素品質(zhì)，擺脫對進口酵素產(chǎn)品的依賴，增強國民對本土酵素產(chǎn)品的信心，對此，我國酵素產(chǎn)品的自主研發(fā)和生產(chǎn)就顯得極為必要。