半胱氨酸雙加氧酶-1甲基化表達(dá)對(duì)于癌癥早期診斷的意義研究進(jìn)展

矗日雅，張生彬

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特；2.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭）

0 引言

半胱氨酸雙加氧酶-1是一種金屬蛋白酶，其主要功能是參與半胱氨酸的調(diào)節(jié)和?；撬岷铣?。半胱氨酸雙加氧酶-1通常分布于細(xì)胞質(zhì)中，由位于5q23.2的半胱氨酸雙加氧酶-1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌、乳腺癌及腦膠質(zhì)瘤中的發(fā)生過(guò)程中半胱氨酸雙加氧酶-1存在著表達(dá)失活，其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是導(dǎo)致基因功能異常的重要因素[2-3]。抑制半胱氨酸雙加氧酶-1基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可以恢復(fù)半胱氨酸雙加氧酶-1的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。由此認(rèn)為半胱氨酸雙加氧酶-1具有腫瘤抑癌基因的功能。在對(duì)肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，NSCLC中存在著普遍的半胱氨酸雙加氧酶-1啟動(dòng)子區(qū)高甲基現(xiàn)象，認(rèn)為半胱氨酸雙加氧酶-1的甲基化對(duì)于NSCLC具有一定的特異性[4]。既往研究[5]表明，在表觀遺傳學(xué)水平上發(fā)生的DNA甲基化是抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活的重要原因之一，屬于腫瘤發(fā)生的早期事件。半胱氨酸雙加氧酶-1基因?qū)儆谀[瘤抑制基因，其失活的方式主要通過(guò)啟動(dòng)子的甲基化。對(duì)一些腫瘤特異基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)可提高腫瘤在血清學(xué)診斷水平上的靈敏度，為癌癥患者的篩查及早期診斷提供新的臨床診斷思路。

1 標(biāo)本收集

研究組甲的標(biāo)本為經(jīng)過(guò)篩選的35例合格病例組及20例合格對(duì)照組組織及血清樣本[6]。研究組乙的標(biāo)本為經(jīng)過(guò)篩選的49例合格病例組及16例合格對(duì)照組組織及血清樣本[7]。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組組織標(biāo)本離體后立即置于液氮內(nèi)保存?zhèn)溆?。血清樣本在患者空?2h后于次日晨間抽取，高速離心機(jī)中3000r/min離心10min，吸取上層血清，封裝于2mL凍存管中液氮內(nèi)保存。

2 檢測(cè)方法

2.1 研究組甲組采用基于磁珠的DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾技術(shù)

取血清樣本1mL，加入組織裂解液及蛋白酶K于55℃消化3h后，加入磁珠（Promega公司），充分混勻后，直接采用磁珠抽提DNA；并采用Zymo公司EZ DNA Methylation kit直接在磁珠上對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，最終獲得可直接用于后續(xù)PCR擴(kuò)增的DNA樣本。取腫瘤標(biāo)本中心部位組織10mg，加入適量液氮快速充分研磨至勻漿。加入組織裂解液及蛋白酶K過(guò)夜消化后，處理步驟同上。擴(kuò)增CDO1基因，擴(kuò)增引物由上海Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR緩沖液2.5 μl；10mmol/L dNTP混合液 0.5 μl；50mmol/L MgCl20.8μl；Platinum Taq DNA 聚合酶0.2 μl；上游及下游引物各 1 μl；2 μl修飾后的 DNA 模板；雙蒸水17 μl；總體積共 25 μl。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，共循環(huán) 45 個(gè)周期；72℃終末延伸5min。采用2-ΔCT法判斷實(shí)時(shí)定量PCR陽(yáng)性結(jié)果[4]。

2.2 研究組乙組采用AxyPrep基因組DNA試劑盒說(shuō)明對(duì)血清標(biāo)本的DNA進(jìn)行提取，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA含量和純度。準(zhǔn)備DNA樣品，體積20μl，總量約500ng，根據(jù)MethylCodeTMBisulfiteConversionKit試劑盒說(shuō)明行亞硫酸氫鈉修飾。對(duì)亞硫酸氫鈉處理后的樣本DNA行PCR擴(kuò)增引物由上海Invitrogen公司設(shè)計(jì)。PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR緩沖液2.5 μl；10mmol/LdNTP 混合液 0.5 μl；50mmol/LMgCl20.8μl；PlatinumTaqDNA 聚合酶0.2μl；上游及下游引物各1μl；2μl修飾后的DNA模板；雙蒸水17μl；總體積共25μl。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共循環(huán)35個(gè)周期；72℃終末延伸5min。MSP產(chǎn)物混合適當(dāng)?shù)纳蠘泳彌_液，于3.0%瓊脂糖凝膠電泳。

3 結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后發(fā)現(xiàn)：甲組病例組半胱氨酸雙加氧酶-1基因甲基化檢測(cè)率為71.4%（25/35），對(duì)應(yīng)的血清檢出率為51.4%（18/35）。對(duì)照組中半胱氨酸雙加氧酶-1基因甲基化率為10.0%（2/20），對(duì)應(yīng)的血清檢出率為5.0%（1/20），腫瘤組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。乙組病例組半胱氨酸雙加氧酶-1基因甲基化率為42.9%（21/49），對(duì)應(yīng)的血清檢出率為34.7%（17/49）。所有對(duì)照組血漿未檢出CDO1基因甲基化，病例組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。并且上述兩例研究中發(fā)現(xiàn)組織與血清中甲化檢出率的一致性較好。雖然上述兩例研究中樣本數(shù)量有一定的差距，但研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，病例組血清中半胱氨酸雙加氧酶-1基因甲基化率要高于對(duì)照組，病例組與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。且不論是在組織樣本中還是在血清樣本中，半胱氨酸雙加氧酶-1的檢出率均高，證明其一致性是可靠的。在單因素分析顯示患者血清半胱氨酸雙加氧酶-1基因的甲基化與年齡、性別、腫瘤分級(jí)無(wú)關(guān)。

4 討論

研究證實(shí)半胱氨酸雙加氧酶-1作為一種具有抑癌基因功能特征的基因，其基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與食管鱗癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌等腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。研究認(rèn)為半胱氨酸代謝途徑在腫瘤細(xì)胞的侵襲過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。半胱氨酸雙加氧酶家族主要包括半胱氨酸雙加氧酶-1和半胱氨酸雙加氧酶-2兩個(gè)成員[2-4]。半胱氨酸雙加氧酶-2是一種膜結(jié)合蛋白；半胱氨酸雙加氧酶-1是半胱氨酸分解代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，其基因啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化引起基因表達(dá)下調(diào)，從而影響半胱氨酸代謝，細(xì)胞代謝異常，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

Brait et al[1]研究得出在不同腫瘤組織中半胱氨酸雙加氧酶-1基因也都存在異常的高甲基化，并表現(xiàn)其相應(yīng)信使RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。研究顯示惡性腫瘤患者外周血中的游離DNA含量較高，這些小片段，半衰期短，極易降解的游離DNA多是由凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞釋放而來(lái)。一些特異基因啟動(dòng)子常常被檢測(cè)出處于高甲基化狀態(tài)，并且這種狀態(tài)的改變總伴隨于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抑癌基因的甲基化改變而發(fā)生，同時(shí)在遺傳特性上的兩者變異是一致的。目前已經(jīng)可以從外周循環(huán)血中檢測(cè)到腫瘤相關(guān)的基因突變，如EGFR，Kras等，然而DNA甲基化的檢測(cè)仍是一個(gè)難點(diǎn)[7]。

在方法學(xué)方面，甲組研究人員認(rèn)為傳統(tǒng)的亞硫酸氫鈉修飾過(guò)程中會(huì)損失大量的DNA，這對(duì)于原本就很微量的循環(huán)血游離DNA檢測(cè)而言，在很長(zhǎng)時(shí)間里都是難以逾越的障礙。上述研究中采用的基于磁珠的DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾技術(shù)，在亞硫酸氫鈉修飾過(guò)程中最大程度減少了DNA的損失，并采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)DNA甲基化信號(hào)，極大地增強(qiáng)了檢測(cè)的靈敏度和特異性。乙組研究人員認(rèn)為MSP法檢測(cè)DNA甲基化是一種簡(jiǎn)單、精確、高效、價(jià)格適中的檢測(cè)方法。首先，在腫瘤細(xì)胞及其相應(yīng)的正常細(xì)胞中，對(duì)完全相反狀態(tài)（純合甲基化或去甲基化）的靶基因，MSP法能夠從多達(dá)104個(gè)正常細(xì)胞中檢測(cè)出1個(gè)腫瘤細(xì)胞。其次與定量性表達(dá)性指標(biāo)相比，DNA甲基化（為定性指標(biāo)）狀態(tài)不易受患者體內(nèi)腫瘤因素的影響，使得對(duì)腫瘤樣品中非腫瘤細(xì)胞污染有高度的抗性。在兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清檢測(cè)半胱氨酸雙加氧酶-1啟動(dòng)子區(qū)甲基化與直接從腫瘤組織中檢測(cè)在結(jié)果上具有極高的一致性，這提示血清檢測(cè)DNA中半胱氨酸雙加氧酶-1甲基化對(duì)癌癥進(jìn)行診斷和監(jiān)測(cè)是可行的。

在統(tǒng)計(jì)學(xué)資料方面，兩組實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)量并不大，如果增加樣本含量其半胱氨酸雙加氧酶-1的甲基化檢出率是否會(huì)出現(xiàn)誤差還有待研究。且這種單基因的甲基化檢測(cè)是否會(huì)出現(xiàn)漏診的情況還未知，其組織樣本中是否會(huì)出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果還有待考證，其靈敏度還需大樣本的臨床研究支持。所以在下一步應(yīng)盡量增加樣本含量，增加其半胱氨酸雙加氧酶-1的甲基化檢出率的靈敏度，在增加樣本含量的同時(shí)是否可以采用聯(lián)合基因檢測(cè)以提高其靈敏度，并且應(yīng)進(jìn)一步完善腫瘤DNA甲基化譜。盡量減少實(shí)驗(yàn)步驟以減少系統(tǒng)誤差，避免出現(xiàn)“假陰性”或“假陽(yáng)性”結(jié)果。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)某些癌癥患者血清DNA中存在半胱氨酸雙加氧酶-1基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化狀態(tài)，且具有極高的特異性，在早期診斷中具有深遠(yuǎn)的意義，同時(shí)血清標(biāo)本極易獲得，這又使被檢人群具有良好的依從性。血清游離DNA中半胱氨酸雙加氧酶-1的甲基化檢測(cè)可能為癌癥的早期診斷提供全新的臨床思路及價(jià)值。