肺炎鏈球菌神經(jīng)氨酸酶A的研究進(jìn)展

殷庭萱，李藝然，劉志伊，徐 巖，賈文寧，劉金輝

(南昌大學(xué)a.瑪麗女王學(xué)院2017級(jí)； b.醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，南昌 330006)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，S.pneumoniae)是常見的呼吸道病原體，廣泛地存在于口腔或鼻咽部，約有5%～10%的健康成人和20%～40%的健康兒童攜帶此菌[1]。在人體中，S.pneumoniae感染所致疾病的種類與嚴(yán)重程度與其定植能力和侵襲部位有關(guān)，S.pneumoniae可以導(dǎo)致鼻竇炎、中耳炎和侵襲性肺炎。在特定的病理情況下，細(xì)菌可以侵入血液導(dǎo)致菌血癥，并最終穿透血腦屏障導(dǎo)致侵襲性腦膜炎。大多數(shù)感染和死亡病例見于機(jī)體免疫力較低的65歲以上老年人和5歲以下兒童[2]。采用S.pneumoniae感染動(dòng)物模型進(jìn)行的研究結(jié)果表明，其毒力因子神經(jīng)氨酸酶A(neuraminidase A,NanA)參與S.pneumoniae的侵襲與擴(kuò)散，在S.pneumoniae所致的多種侵襲性疾病中起重要作用[3]。本文對(duì)NanA在感染中的毒力機(jī)制進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 肺炎鏈球菌毒力因子簡(jiǎn)介

S.pneumoniae感染與多種毒力因子的表達(dá)有關(guān)，包括莢膜多糖、菌毛、S.pneumoniae溶素蛋白及多種蛋白酶類等分子。莢膜多糖不僅是細(xì)菌產(chǎn)生毒力的必需條件，幫助其抵抗宿主吞噬細(xì)胞的吞噬作用，有利于細(xì)菌在宿主體內(nèi)大量繁殖，還具有抗原性，是S.pneumoniae分型的重要依據(jù)[4]。菌毛是S.pneumoniae胞外菌體結(jié)構(gòu)之一，幫助細(xì)菌黏附到宿主細(xì)胞等各種固體物質(zhì)的表面，提高細(xì)菌侵襲能力并參與生物膜形成。溶血素(pneumolysin,Ply)是細(xì)菌胞內(nèi)蛋白，經(jīng)自溶酶作用釋放后可以通過形成跨膜孔溶解真核細(xì)胞，并激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑，刺激炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，與S.pneumoniae感染導(dǎo)致的高死亡率及急性致死性肺炎和心肌損傷密切相關(guān)[5]。此外，S.pneumoniae表面蛋白(pneumococcal surface protein A,PspA)、S.pneumoniae表面黏附素A(pneumococcal surface adhensin A,PsaA)等表面蛋白也都被證實(shí)在S.pneumoniae致病過程中發(fā)揮重要作用。S.pneumoniae產(chǎn)生多種糖水解酶，通過對(duì)宿主細(xì)胞膜糖復(fù)合物的脫糖基化來促進(jìn)細(xì)菌的黏附和定植，降解產(chǎn)物糖基還可作為細(xì)菌繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在這些糖水解酶中，神經(jīng)氨酸酶致病性最強(qiáng)，具有降解唾液酸的酶活性，可以分解宿主細(xì)胞表面或體液中的多糖、糖蛋白、低聚糖和糖脂等糖復(fù)合物末端的唾液酸殘基。

2 神經(jīng)氨酸酶分子結(jié)構(gòu)特征

神經(jīng)氨酸酶是S.pneumoniae表達(dá)的一種重要毒力因子，參與該菌致病過程。S.pneumoniae的基因組可編碼3種同源神經(jīng)氨酸酶：NanA、NanB和NanC，三者在臨床分離株的基因頻率分別是100%、97%和36%～51%[6]，蛋白分子量依次為114、77、82 kD[2]。三者之中NanA活性最強(qiáng)，活性中心保守性最高，且在所有S.pneumoniae感染的臨床分離株中廣泛表達(dá)，說明S.pneumoniae的感染與NanA的毒力機(jī)制密切相關(guān)。NanA的編碼基因長(zhǎng)約3108 bp，其蛋白產(chǎn)物約含1035 aa，可分為N端信號(hào)肽(aa1-120)、N端凝集素域(aa121-305)、催化域(aa326-437、aa532-822)、C端膜結(jié)合域(aa823-1035)等多個(gè)結(jié)構(gòu)域[7]。各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能不同，凝集素域又稱為碳水化合物結(jié)合組件(carbohydrate-binding module,CBM40)，可特異性識(shí)別聚糖末端唾液酸(sialic acids)，并引導(dǎo)NanA酶活性關(guān)鍵基團(tuán)催化域與之結(jié)合。這一區(qū)域已被證實(shí)在細(xì)菌對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells,hBMECs)的黏附和侵襲方面起重要作用，因此其可能是誘發(fā)細(xì)菌性腦膜炎的關(guān)鍵因子[8]。

NanA蛋白催化域呈現(xiàn)神經(jīng)氨酸酶家族經(jīng)典的六葉β螺旋槳樣折疊結(jié)構(gòu)，活性中心含有對(duì)底物唾液酸進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化至關(guān)重要的氨基酸殘基，并包含一段功能未知的插入域(insertion domain)。C端膜結(jié)合域包含一段LPETG基序(motif)，其在S.pneumoniae轉(zhuǎn)肽酶A(sortase A,SrtA)作用下將NanA錨定在細(xì)胞壁表面，而NanB和NanC因缺失該序列而直接分泌到胞外，進(jìn)入機(jī)體組織液[9]。

在NanB和NanC蛋白結(jié)構(gòu)中，凝集素域和催化域在多種域間相互作用下形成堅(jiān)硬球狀體直接相連，而在NanA中2個(gè)結(jié)構(gòu)域彼此分離，由一段長(zhǎng)度為16 aa的靈活連接體隔開，因而具有良好的柔韌性[10]。NanA具有廣泛的底物作用范圍，可大量識(shí)別、分解α-2,3鍵連接的唾液酸、α-2,6鍵連接的唾液酸和α-2,8鍵連接的唾液酸等3種底物，而NanB和NanC主要分解α-2,3鍵連接的唾液酸[2]。此外，生物信息學(xué)分析顯示NanA蛋白表面以負(fù)性電荷為主，活性中心則以正性電荷為主，這種特殊的電荷分布也能增強(qiáng)其對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的黏附和對(duì)天然底物唾液酸的特異性結(jié)合能力[11]。

3 NanA致病機(jī)制

3.1 促進(jìn)細(xì)菌黏附與定植

唾液酸也稱乙?；窠?jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)，是一種細(xì)胞保護(hù)因子，廣泛分布于宿主胞膜表面，具有多種重要的細(xì)胞生物學(xué)功能。成功定植于呼吸道黏膜上皮細(xì)胞是S.pneumoniae的感染過程的第一步，而NanA對(duì)唾液酸的切割降解是幫助S.pneumoniae定植的重要分子機(jī)制。因?yàn)樗拗魃掀ぜ?xì)胞表面所含的多糖、糖蛋白、低聚糖和糖脂等糖復(fù)合物末端多為唾液酸殘基。尤其是唾液酸化的糖蛋白如黏蛋白(mucins)在呼吸道黏膜表面表達(dá)水平較高，在黏膜表面形成了高粘稠度的粘液屏障。NanA對(duì)這些表面分子的唾液酸殘基裂解破壞了它們所形成的粘液分子屏障，使細(xì)菌得以定植上皮細(xì)胞，進(jìn)而繁殖擴(kuò)散到更深層的組織部位[12]。

S.pneumoniae對(duì)真核細(xì)胞的黏附過程分為兩步，首先與宿主細(xì)胞表面糖復(fù)合物進(jìn)行較松散的相互作用，后與細(xì)菌侵襲相關(guān)的宿主受體進(jìn)行更緊密、特異性更高的結(jié)合。NanA在第一步發(fā)揮作用：當(dāng)細(xì)菌跨過粘液素屏障接觸到上皮細(xì)胞后，NanA裂解宿主細(xì)胞表面寡糖，暴露出下方的隱性受體，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)組織的黏附。NanA缺失的S.pneumoniae變異株在體外與在南美栗鼠氣管組織結(jié)合的能力較野生型下降，在體內(nèi)經(jīng)鼻感染后誘發(fā)下呼吸道感染的能力也減弱[13]。

感染組織后，S.pneumoniae需要通過糖類發(fā)酵代謝產(chǎn)生的能量來維持活性。盡管呼吸道表面的游離糖濃度有限，S.pneumoniae可以利用包括神經(jīng)氨酸酶在內(nèi)的一系列糖苷酶對(duì)宿主糖基化分子的水解作用來滿足其營(yíng)養(yǎng)需求。其中，裂解并移除末端唾液酸是細(xì)菌對(duì)宿主糖復(fù)合物進(jìn)行連續(xù)降解的第一步也是必要的一步，因此神經(jīng)氨酸酶被認(rèn)為是S.pneumoniae最關(guān)鍵的糖水解酶[14]。此外，經(jīng)酶作用釋放的游離唾液酸在體內(nèi)外均可作為擴(kuò)散信號(hào)，促進(jìn)S.pneumoniae在體內(nèi)轉(zhuǎn)移、繁殖，并可以誘導(dǎo)細(xì)菌經(jīng)鼻嗅球侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)引發(fā)非血源性腦膜炎[15]。

3.2 促進(jìn)生物膜形成

生物膜是一種包裹在細(xì)胞外基質(zhì)中的細(xì)菌的表面附著群落，形成生物膜是S.pneumoniae在上皮組織定植與生存的重要過程之一，在鼻竇炎患者的鼻中隔活檢標(biāo)本上、實(shí)驗(yàn)感染小鼠的鼻中隔上皮以及體外培養(yǎng)的呼吸上皮細(xì)胞上，都能夠檢測(cè)到S.pneumoniae生物膜的存在[16]。當(dāng)S.pneumoniae在生物膜環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，NanA表達(dá)水平上調(diào)提示其在生物膜形成過程中發(fā)揮重要作用[17]，其作用主要是促進(jìn)細(xì)菌微菌落的形成，及以微菌落為基本單位形成成熟的生物膜。而NanA缺失的S.pneumoniae菌株形成生物膜能力顯著下降[18]。PARKER等[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高濃度的乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid,NANA)通過與底物競(jìng)爭(zhēng)拮抗NanA活性，最終導(dǎo)致S.pneumoniae生物膜形成量顯著下降。這些研究表明NanA在S.pneumoniae生物膜的形成過程起重要作用。

NanA促進(jìn)S.pneumoniae生物膜形成的機(jī)制是復(fù)雜的，目前認(rèn)為其作用可能與酶活性有關(guān)，一方面通過降解宿主細(xì)胞表面糖基復(fù)合物，使游離唾液酸大量釋放促進(jìn)生物膜形成[20]，另一方面通過暴露下層半乳糖殘基調(diào)節(jié)S.pneumoniae對(duì)碳源的攝取和利用促進(jìn)生物膜形成[18]。WREN等[21]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)NanA在生物膜形成過程中也發(fā)揮著與酶活性無關(guān)的獨(dú)特作用。生物膜給予細(xì)菌群體共享有利遺傳信息的機(jī)會(huì)，使之對(duì)抗菌肽具有更高的抵抗力，使得S.pneumoniae從最初的無癥狀定植逐步演化為具有誘發(fā)侵襲性疾病的潛能。

3.3 在S.pneumoniae侵襲性感染中的作用

NanA參與S.pneumoniae所致的死亡率普遍較高的侵襲性疾病(invasive pneumococcal disease,IPD)發(fā)生與進(jìn)展過程，如敗血癥、腦膜炎和非典型溶血性尿毒綜合征(pneumococcal hemolytic uremic syndrome,pHUS)。S.pneumoniae通過多種途徑進(jìn)入血流，包括淋巴管途徑、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞損傷途徑以及內(nèi)皮細(xì)胞的直接侵襲途徑。進(jìn)入血液后，NanA通過對(duì)人體血清成分的脫糖基化來干擾補(bǔ)體因子C3在細(xì)菌表面的沉積[2]，減少中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用，有利于細(xì)菌逃避機(jī)體免疫防御而在血液中繁殖擴(kuò)散。另一方面，NanA從細(xì)胞膜復(fù)合糖結(jié)構(gòu)中去除唾液酸將減少補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子H與自身細(xì)胞表面的結(jié)合[22]。H因子作為補(bǔ)體激活途徑之替代途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，抑制補(bǔ)體反應(yīng)激活因子C3b在生物表面的沉積，保護(hù)自身細(xì)胞不受攻膜復(fù)合體(membrane attack complex,MAC)的破壞。因此，當(dāng)H因子與紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及血小板上唾液酸的相互作用減少時(shí)，缺乏調(diào)節(jié)的補(bǔ)體系統(tǒng)被激活可能導(dǎo)致全血溶血和血小板聚集，造成嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病。此外，NanA對(duì)某些關(guān)鍵免疫因子的脫糖基化作用將削弱其在免疫反應(yīng)抵御病原體侵襲中的調(diào)控能力，有利于S.pneumoniae在體內(nèi)生存繁殖。

血源細(xì)菌沿血管進(jìn)入腦部，附著并穿透以單層hBMECs為主的血腦屏障，是腦膜炎發(fā)生機(jī)制中的首要過程。NanA缺失型S.pneumoniae對(duì)hBMECs的黏附、侵襲的能力較野生型下降約90%[23]，表明NanA在引發(fā)腦膜炎中發(fā)揮關(guān)鍵作用，細(xì)菌穿透血腦屏障后對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成的損害則與其它毒力因子協(xié)同完成。在內(nèi)皮細(xì)胞上，NanA裂解末端唾液酸，修飾宿主細(xì)胞表面糖復(fù)合物以暴露親和力更高的受體，促進(jìn)細(xì)菌粘附并穿透內(nèi)皮細(xì)胞。此外，NanA蛋白N端凝集素結(jié)構(gòu)域能夠充分活化內(nèi)皮細(xì)胞，激活趨化因子[如interleukin 8(IL-8)]和中性粒細(xì)胞募集，在促進(jìn)S.pneumoniae對(duì)hBMECs的侵襲以及誘發(fā)急性腦膜炎的過程中發(fā)揮重要且特異的作用[24]。

3.4 在與流感病毒協(xié)同感染中的作用

流感爆發(fā)或流行期間，肺炎發(fā)病率與死亡率過高被認(rèn)為與S.pneumoniae和流感病毒之間的致死性協(xié)同感染有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)S.pneumoniae的NanA蛋白可以促進(jìn)流感病毒從宿主細(xì)胞表面釋放，并在呼吸道組織快速擴(kuò)散[25]。NanA促流感病毒擴(kuò)散作用呈濃度依賴性：一定濃度下，可以增強(qiáng)流感病毒的復(fù)制能力；大量存在時(shí)，病毒的擴(kuò)散能力和產(chǎn)量反而下降[26]。過量NanA可能通過裂解宿主細(xì)胞表面乳糖分子末端唾液酸(SA-α2,3-Gal和SA-α2,6-Gal)，清除病毒受體，干擾病毒對(duì)宿主的黏附[27]。

同時(shí)表達(dá)Nan和S.pneumoniae的NanA是流感病毒和S.pneumoniae2種病原體達(dá)到完全協(xié)同所必需的。共感染的流感病毒促進(jìn)S.pneumoniae在鼻腔定植并加重疾病進(jìn)展這一作用已被證實(shí)。為研究S.pneumoniae的NanA在共感染中的致病作用，WREN等[21]采用小鼠模型進(jìn)行研究，鼻腔定植力與感染力均出現(xiàn)嚴(yán)重受損的S.pneumoniae的NanA缺失突變株在與表達(dá)神經(jīng)氨酸酶的甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)共感染時(shí)，S.pneumoniae突變株的定植力與致病力均得以提升，但仍達(dá)不到野生S pneumonia的致病水平[21]，即流感病毒的神經(jīng)氨酸酶不能完全彌補(bǔ)S.pneumoniae缺失的NanA的致病作用，說明2種神經(jīng)氨酸酶分子的致病機(jī)制存在某些未知的差異，它們?cè)?種病原共感染過程中起協(xié)同作用，從而加重S.pneumoniae疾病進(jìn)展。

4 靶向NanA的藥物與疫苗的研制

S.pneumoniae作為引發(fā)社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)最主要的病原體，相關(guān)藥物與疫苗的開發(fā)一直是研制重點(diǎn)。隨著抗生素耐藥與人口老齡化的加劇，S.pneumoniae對(duì)一些抗生素表現(xiàn)多重耐藥，包括青霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類及頭孢菌素類，且耐藥率逐年上升[27]。有效的S.pneumoniae疫苗很大程度上緩解了耐藥危機(jī)，現(xiàn)行使用的疫苗以莢膜多糖疫苗(capsular polysaccharide vaccine,PPV)(PPV23)和蛋白質(zhì)-莢膜多價(jià)結(jié)合疫苗(protein-capsule multivalent conjugate vaccine，PVC)(PCV7、PCV10、PCV13)為主。多價(jià)結(jié)合疫苗將莢膜和蛋白載體相結(jié)合，激發(fā)T細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫原性和持久的免疫保護(hù)，顯著降低兒童(尤其2歲以下)S.pneumoniae肺炎發(fā)病率[28]。但由于細(xì)菌持續(xù)變異和選擇作用，其型別限制和莢膜血清轉(zhuǎn)換等缺點(diǎn)逐漸展現(xiàn)，“第三代疫苗”重組蛋白疫苗因其保守性好、免疫原性強(qiáng)、價(jià)格相對(duì)低廉等優(yōu)勢(shì)得到廣泛關(guān)注[29]。

相比于傳統(tǒng)的血清接種，黏膜免疫是一種很有潛力的新型接種方式，可同時(shí)誘導(dǎo)黏膜和全身免疫反應(yīng)，對(duì)主要定植于人類呼吸道黏膜表面的S.pneumoniae引發(fā)的肺部疾病提供更特異的保護(hù)[30]。有實(shí)驗(yàn)[31]證實(shí)，用NanA蛋白黏膜免疫小鼠后可誘導(dǎo)高滴度抗體的產(chǎn)生，能有效抵抗致病性S.pneumoniae的感染，抑制其在宿主鼻咽部和肺部的定植，提示NanA或可作為新型疫苗的載體或融合蛋白，具有疫苗研發(fā)價(jià)值。

以S.pneumoniae的NanA蛋白毒力因子為靶點(diǎn)的新型藥物也在不斷研制中。從植物中提取的小分子藥物β-谷甾醇-3-O-葡萄糖苷(β-Sitosterol-3-O-glucopyranoside，SOG)可以通過抑制SrtA酶活性阻止NanA在細(xì)胞壁上錨定[9]，進(jìn)而影響NanA在促進(jìn)細(xì)菌于呼吸道上皮黏附和定植中的作用，緩解肺組織病理變化。由于流感病毒神經(jīng)氨酸酶和NanA結(jié)構(gòu)存在一定的相似性，多種雙靶向該相似結(jié)構(gòu)的神經(jīng)氨酸酶抑制劑(neuraminidase inhibitors,NAIs)也在研究與評(píng)估之中，這些藥物分子通過靶向抑制2種病原體之間的神經(jīng)氨酸酶的協(xié)同作用，降低流感流行期間死亡率和S.pneumoniae二次感染發(fā)生率，目前研究發(fā)現(xiàn)桂木黃酮(Artocarpin)效果最優(yōu)，是目前唯一對(duì)S.pneumoniae生長(zhǎng)和生物膜形成都有抑制作用的NAI[25]。

5 結(jié)語

NanA作為S.pneumoniae的一種重要毒力因子，在S.pneumoniae的毒力及疫苗研發(fā)方面都起著重要作用。一方面，該蛋白主要在細(xì)菌致病的起始階段發(fā)揮作用，以多樣化的作用機(jī)制參與S.pneumoniae在人體不同部位的感染。另一方面，以NanA為靶點(diǎn)的抗S.pneumoniae藥物和新型疫苗的研制為減輕S.pneumoniae感染帶來的公共衛(wèi)生壓力提供了新的途徑。雖然NanA毒力性質(zhì)的認(rèn)識(shí)已取得了一定的研究成果，但某些作用機(jī)制的結(jié)論處于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物階段，并且模型動(dòng)物與人體在組織結(jié)構(gòu)功能上存在較大差異，加之NanA的氨基酸序列和抗原性在不同型別的S.pneumoniae中存在一定變異，因此研究成果最終轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步仔細(xì)驗(yàn)證。