艱難梭菌實驗室診斷方法研究進展

謝 樂，劉善文，張 寧，張淑芳*

(1 山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 臨沂 276000；2 臨沂市人民醫(yī)院)

艱難梭菌是胃腸道最常見的條件性致病菌。長期應(yīng)用抗生素、化療藥物的患者，其腸道正常菌群生長受抑制，艱難梭菌會乘機繁殖并釋放毒素，引起相關(guān)性腹瀉，輕者呈自限性腹瀉，重者可引起偽膜性腸炎[1]。艱難梭菌相關(guān)性腹瀉占抗生素相關(guān)性腹瀉的20%～30%[2]。艱難梭菌在歐美國家已經(jīng)被列為法定傳染病的監(jiān)測病原體，國內(nèi)醫(yī)院對艱難梭菌進行常規(guī)檢驗的較少。為此，本文對艱難梭菌的實驗室檢測方法進行了綜述。

1 艱難梭菌致病機制

艱難梭菌是專性厭氧菌，營養(yǎng)要求高，其致病決定區(qū)(Pathogenicity locus，PaLoc)由tcdA、tcdB、tcdC、tcdE和tcdR組成，長度為19.6 kb，其中tcdA編碼A毒素，作為腸毒素能趨化中性粒細胞聚集，導(dǎo)致液體大量分泌入腸腔；tcdB編碼B毒素，作為細胞毒素可以破壞細胞骨架，引起腸細胞壞死。艱難梭菌大多含有tcdA、tcdB基因，部分tcdA基因片段缺失[3]。tcdC為負向調(diào)控基因，其缺失可引起tcdA、tcdB基因高表達。tcdR為正向調(diào)控基因，與tcdC基因作用相反。tcdE基因是一種膜孔蛋白編碼基因，該蛋白可促進A、B毒素分泌。此外，部分高致病性艱難梭菌菌株還可分泌二元毒素(Clostridium difficile transferase，CDT)，由cdtA和cdtB編碼，位于CdtLoc(CDT locus)基因上。PaLoc存在于所有產(chǎn)毒艱難梭菌中，而CdtLoc只存在部分產(chǎn)毒或不產(chǎn)毒株中。

2 實驗室檢測

2.1微生物學(xué)方法

2.1.1厭氧培養(yǎng) 艱難梭菌典型的菌落外觀呈黃色扁平狀，邊緣不規(guī)則，并且有典型的馬糞氣味，鏡下為粗大芽孢桿菌，在360 nm紫外燈照射下菌落發(fā)黃綠色熒光。實驗室中常用CCFA(環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂)培養(yǎng)基。ChromID CD agar(IDCd；bioMerieux SA，F(xiàn)rance)，是一種顯色培養(yǎng)基，艱難梭菌在平板上呈黑色，并且大部分的檢測能在24 h內(nèi)完成，其24 h和48 h的檢測敏感性可達91.9%、97.3%[4]。厭氧培養(yǎng)敏感度高、特異性強，但是不能區(qū)分產(chǎn)毒艱難梭菌和非產(chǎn)毒艱難梭菌，并且耗時比較長，不能快速有效的為臨床診斷提供依據(jù)。

2.1.2產(chǎn)毒素培養(yǎng) 產(chǎn)毒素培養(yǎng)(TC)分為兩步，首先通過厭氧培養(yǎng)分離得到艱難梭菌，然后利用PCR方法檢測毒素基因或者利用免疫方法進行艱難梭菌毒素檢測。產(chǎn)毒培養(yǎng)的敏感性和特異性都比較高，SHEA/IDSA指南將產(chǎn)毒培養(yǎng)方法作為檢測的金標準。由于產(chǎn)毒素培養(yǎng)檢測時間長、操作復(fù)雜，需要專業(yè)的工作人員，限制了其在臨床上的使用。

2.1.3細胞毒素中和試驗 細胞毒素中和試驗(CCNA)是直接檢測糞便標本中的毒素。對糞便標本進行稀釋并過濾，過濾液與培養(yǎng)細胞(常用Vero細胞)孵育24～48 h后觀察細胞病變，若有≥50%的細胞出現(xiàn)病理改變，則在反應(yīng)池中加入毒素特異性抗體孵育0.5 h，如果細胞的病理改變消失，就表示艱難梭菌毒素陽性。CCNA的檢測操作復(fù)雜，敏感性較低，結(jié)果判讀主觀性強[5]，難以標準化，再加上檢測費用高，所以較難在臨床上推廣使用。

2.2免疫學(xué)方法

2.2.1谷氨酸脫氫酶 谷氨酸脫氫酶(GDH)作為一種代謝酶，普遍存在于艱難梭菌表面(包括產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒素菌株)，在糞便標本中的量較多并且穩(wěn)定性較高，可作為糞便中艱難梭菌檢測的指標。GDH檢測方法靈敏度和陰性預(yù)測值高，由于產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒艱難梭菌均能表達GDH，所以特異性低。如果GDH檢測結(jié)果為陽性，可進一步判斷其是否產(chǎn)生毒素；若檢測結(jié)果為陰性則可基本排除，這樣大大縮短了陰性標本的檢測時間。

2.2.2EIA方法 許多商品化試劑盒大都使用EIA方法檢測艱難梭菌產(chǎn)生的毒素A/B，其操作簡單，用時短，價格相對較低。由于直接檢測的是標本中的毒素，所以該方法的特異性高，但是敏感性低[6]。

免疫學(xué)方法檢測艱難梭菌，操作簡單，對工作人員的專業(yè)要求不高并且結(jié)果易于判讀，但是其敏感性或特異性低，不能單獨用于診斷[7]。為了提高診斷的準確性，臨床上將GDH、EIA法作為初篩，陽性標本再用分子生物學(xué)方法進行檢測。

2.3分子生物學(xué)方法

2.3.1聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法 用普通PCR法直接檢測糞便標本中的艱難梭菌毒素基因，該方法檢測敏感性高、時間短(3～5 h)，但是擴增的產(chǎn)物需要電泳判斷結(jié)果，會造成污染。有研究報道，實時熒光定量PCR檢測艱難梭菌的靈敏性和特異性達到100%和98.3%[8]，大約3 h即可檢測完成，是一種非常有效的檢測方法。

2.3.2環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP) LAMP檢測的基因是tcdA基因的一個片段。當(dāng)特異性擴增產(chǎn)物形成時，形成肉眼可見的絮狀沉淀，通過反應(yīng)管的透光率實時監(jiān)測。該方法敏感性和特異性比較高[9]，儀器設(shè)備簡單，可以在等溫條件下持續(xù)擴增，1 h即可完成檢測，擴增產(chǎn)物量多，對人員的要求不高，大部分實驗室都能滿足這個條件。但是對tcdA(-)的菌株沒法檢測，影響其準確度。

分子生物學(xué)方法是直接檢測的糞便標本中的艱難梭菌毒素基因，其檢測時間短，敏感性和特異性比EIA方法高。但是該方法存在假陽性，有的患者雖然有產(chǎn)毒艱難梭菌定植，但是并沒有出現(xiàn)腹瀉等臨床癥狀。

綜上所述，檢測艱難梭菌的三種方法所需的檢測時間、對工作人員的要求、敏感度與特異度差異較大。將兩種或三種方法聯(lián)合使用，能提高檢測的準確性。